Article de méthode

Techniques de phénotypage micron-échelle de maïs faisceaux vasculaires issu de tomographie à rayons x Microcomputed

DOI :

10.3791/58501

⸱

9 octobre 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Nous fournissons une méthode originale pour améliorer le contraste d’absorption des rayons x des tissus de maïs adapté pour la numérisation de la tomographie microcomputed ordinaire. Basée sur des images de CT, nous présentons un ensemble de flux de traitement d’image pour différents matériaux de maïs extraire efficacement des phénotypes microscopiques des faisceaux vasculaires du maïs.

Résumé

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Il est nécessaire de quantifier avec précision les structures anatomiques des matériaux maïs issu des techniques d’analyse d’images de haut débit. Ici, nous fournissons un « protocole de préparation d’échantillon » de maïs matériaux (c.-à-d., tige, feuilles et racine) adaptés aux microcomputed ordinaires tomodensitométrie micro-numérisation. Basé sur des images haute résolution de CT de tige de maïs, feuilles et racine, les auteurs décrivent deux protocoles pour l’analyse phénotypique des faisceaux vasculaires : (1) basé sur l’image de CT de tige de maïs et de feuilles, nous avons développé un pipeline d’analyse d’image spécifique pour extraire automatiquement 31 et 33 caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires ; (2) basé sur la série d’image de CT des racines de maïs, nous avons mis en place un régime de traitement d’image pour la segmentation d’en trois dimensions (3d) des navires de métaxylème et extrait bidimensionnel (2d) et des caractères phénotypiques 3D, tels que volume, surface habitable de navires de métaxylème, etc. Les protocoles proposés par rapport à la mesure manuelle traditionnelle des faisceaux vasculaires de maïs matériaux, améliorent considérablement l’efficacité et la précision de dosage phénotypique à l’échelle du micron.

Introduction

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Le système vasculaire maïs traverse toute la plante, de la racine et la tige à feuilles, qui forme les chemins de transport clé pour livrer de l’eau, minéraux et substances organiques1. Une autre fonction importante du système vasculaire est de fournir un soutien mécanique pour les plants de maïs. Par exemple, la morphologie, le nombre et la répartition des faisceaux vasculaires dans les racines et les tiges sont étroitement liés à la résistance à la verse des plants de maïs2,3. À l’heure actuelle, des études sur la structure anatomique des faisceaux vasculaires principalement utilisent des techniques microscopiques et ultramicroscopiques pour afficher les structures anatomiques d’une certaine partie de la tige, feuille ou racine et ensuite mesurent et comptent ces structures de intérêt par enquête manuelle. Sans aucun doute, mesure manuelle de différentes structures microscopiques dans microimages à grande échelle est une œuvre très fastidieuse et inefficace et limite considérablement la précision des traits microphenotypic, en raison de sa subjectivité et incohérence4, 5.

Maïs n’a aucune croissance secondaire, et le contenu de la cellule se compose essentiellement de l’eau dans le méristème primaire. Sans aucun traitement préalable, les échantillons frais des tissus de maïs peuvent être directement numérisés en utilisant un dispositif de micro-CT ; Toutefois, les résultats d’analyse sont probablement pauvre et rugueuse. Les principales raisons sont résumées comme suit : la densité (1) faible atténuation des tissus végétaux, ce qui entraîne un faible contraste de numéro atomique et un bruit élevé en images ; (2) matières végétales frais ont tendance à déshydrater et rétrécir pendant l’environnement balayage normal, tel que rapporté par Du6. Les problèmes susmentionnés sont devenus les principaux obstacles pour le développement et l’application de la technologie microphenotyping pour le maïs, le blé, riz et autres monocotylédones. Ici, nous introduisons le « protocole de préparation d’échantillon » d’un prétraitement des échantillons de maïs tige, feuilles et racine. Ce protocole permet d’éviter la déshydratation et la déformation des matériaux végétaux pendant la tomodensitométrie ; ainsi, il est utile d’augmenter la durée de conservation des échantillons de plantes avec nondeformation. Par ailleurs, l’étape de teinture basée sur l’iode solide aussi améliore le contraste des matières végétales ; ainsi, il apporte des améliorations significatives dans la qualité d’image de micro-CT. En outre, nous avons développé le logiciel de traitement d’image, nommé VesselParser, à traiter les images de CT des feuilles et des tiges de maïs. Ce logiciel intègre un ensemble de pipelines de traitement des images pour réaliser une analyse phénotypage haut-débit et automatique pour les images CT 2-D des tissus végétaux différents. Faisceaux vasculaires à toute coupe transversale de la tige de maïs et de la feuille sont détectés, extraits et identifié à l’aide d’une méthode de traitement d’image automatique. Ainsi, nous obtenons 31 phénotypes microscopiques de la tige de maïs et 33 phénotypes microscopiques de la feuille de maïs. Pour les séries d’images CT de la racine du maïs, nous avons élaboré un schéma de traitement d’image d’acquérir 3D caractéristiques phénotypiques des vaisseaux de métaxylème. Ce régime est supérieur en efficacité d’acquisition d’images et de la reconstruction par rapport aux méthodes traditionnelles.

Ces résultats indiquent que l’image, traitement des tuyaux étant donné que les caractéristiques d’imagerie d’ordinaire micro-tomodensitométrie fournissent une méthode efficace pour le phénotypage microscopique des faisceaux vasculaires ; C’est extrêmement élargit les applications des techniques de CT en phytologie et améliore le phénotypage automatique du matériel végétal à résolution cellulaire6,7.

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Protocole

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1. Protocole de préparation d’échantillon

  1. Pour l’échantillonnage, recueillir la tige, feuilles et racines de plants de maïs frais et diviser en trois types de groupes d’échantillons (chaque groupe avec quatre répétitions). Ensuite, coupez-les en petits segments à l’aide d’une lame chirurgicale de la manière suivante : (1) coupe un segment du milieu de la tige entre-nœud 1 à 1,5 cm de longueur ; (2) couper un segment de la largeur de la feuille de 0,5 - 3 cm de longueur le long de l’axe vertical avec la veine principale ; (3) couper un segment de la racine de la Couronne 0,5 cm de longueur.
  2. Pour la fixation de la FAA, tremper les segments de l’échantillon dans une solution de la FAA (90:5:5 v/v/v, 70 % éthanol : 100 % formaldéhyde : 100 % d’acide acétique) pendant au moins 3 jours.
  3. Effectuez la procédure de déshydratation dans six des gradients séquentielle de l’éthanol (c'est-à-dire, 30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % et 100 %) et le délai de traitement de chaque dégradé de l’éthanol comme 30 min.
  4. Placer les matières végétales dans les paniers d’échantillon correspondant fabriqués à l’aide d’une imprimante 3D ; Ensuite, transférer rapidement les paniers de l’échantillon à la cellule d’un système de séchage CO2 point critique. Définissez les paramètres de séchage comme suit :
    (1) CO2 dans : vitesse rapide. Charges de support : 100 %.
    (2) charge : CO2 frais retard 120 s dans le cycle. Échange de vitesse : 5. nombre de Cycle : 12.
    (3) gaz dehors : chaleur, rapide. Vitesse : lente, 50 %.
    1. Selon les différences morphologiques des racines de maïs, des tiges et des feuilles, conception et impression paniers d’échantillon à l’aide d’une imprimante 3D (par exemple, la Figure 1).
  5. Placer les matériaux de plante séchée (racines de maïs, tige ou feuille) dans un tube à centrifuger de 50 mL avec 2 g d’iode solide pour teindre les matières végétales avec de la vapeur d’iode volatil et, ensuite, placer les tubes dans une chambre opaque pour 4-5 h.

2. micro-CT Scan protocole

  1. Pour numériser dans les données brutes de la CT, définissez le paramètres de tomodensitométrie comme suit : 40 kV/250 µA (pour tige et feuilles) ou 34 kV/210 µA (pour root). Régler le balayage des plages pour les différentes tailles et les volumes des matières végétales utilisées correspondant et ajuster les tailles pixel d’imagerie comme suit : 2,0 µm (pour les racines de maïs), 6.77 µm (pour la tige de maïs) et 10,0 µm (pour la feuille de maïs).
  2. Pour reconstruire des images de tranche, convertir les données brutes de CT en images tranche CT avec une résolution de 2K (2 000 x 2 000 pixels) grâce à un logiciel de reconstruction d’images. Plus de détails sont fournis dans le manuel d’utilisation de NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. image Protocole d’analyse d’une Image unique CT d’une tige de maïs ou une feuille

Remarque : Utiliser des logiciels d’imagerie automatique pour les faisceaux vasculaires pour effectuer l’analyse de phénotypage des faisceaux vasculaires dans les images de tranche de CT de la tige de maïs et de la feuille (Figure 2). Les étapes d’utilisation de logiciel sont décrites comme suit.

  1. Nommer le type d’orgue pour initialiser des pipelines d’algorithme différent. Cliquez sur le bouton paramètres de la méthode et sélectionner les souches de maïs ou de feuilles de maïs dans la première zone de liste déroulante.
  2. Pour importer les images, cliquez sur le bouton de gestion des données , définir le répertoire de travail et importer automatiquement toutes les images de tranche dans ce répertoire. Sélectionnez les images simples ou multi-slice dans les pipelines de l’image.
  3. Déterminer la taille réelle de pixel de l’image. Cliquez sur le bouton paramètres de la méthode et entrez la taille réelle de pixel de l’image dans l’élément de modification de la taille en pixels.
  4. Pour le calcul de phénotypage, cliquez sur le bouton de calcul phénotypage pour extraire automatiquement les caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires pour toutes les images de la tranche sélectionnée.
  5. Cliquez sur le bouton d’analyse statistique pour générer les résultats comme un format de fichier TXT ou CSV.

4. image Protocole d’analyse de séries d’images CT d’une racine de maïs

Remarque : Les séries d’images CT des racines du maïs sont utilisés pour extraire les structures 3D des vaisseaux de métaxylème à l’aide du logiciel de traitement d’image. Les principales étapes sont les suivantes.

  1. Importer les images reconstruites des racines du maïs (dans le format de fichier BMP) et déterminer les paramètres d’espacement précis (la taille d’un voxel [c.-à-d., x, y, z]). Utilisez l’outil gaussien récursif pour lisser ces images afin d’améliorer la qualité de l’image.
  2. Conduite de segmentation 3D des vaisseaux de métaxylème en ajustant les paramètres de seuil ; Cela génère une étiquette de couleur uniforme pour chaque navire de métaxylème connectés.
  3. Améliorer et identifier les navires de métaxylème interactivement à l’aide de la morphologie, au niveau du bit et les inondations-remblais.
  4. Mener la reconstruction de visualisation et de surface volume des vaisseaux. Utilisez l’outil de statistiques de masque pour compter et mesurer les caractéristiques phénotypiques d’un navire dans les niveaux 2 et 3 dimensions.

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Résultats

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Le protocole de préparation d’échantillon adapté à ordinaire micro-TDM non seulement empêche la déformation des tissus végétaux mais aussi améliore le contraste d’absorption des rayons x. Matières végétales prétraitées sont analysés en utilisant un système de micro-CT dans la tranche haute qualité des images, et la plus haute résolution peut atteindre 2 µm/pixel. La figure 4 montre les images numérisées de la micro-CT de tige, feuilles et racine, et le contra...

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Discussion

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Avec l’application réussie de la technologie de CT dans les domaines de la biomédecine et science des matériaux, cette technologie a été progressivement introduite dans les domaines de la botanique et l’agriculture, la promotion de recherches en sciences de la vie comme un outil technique prometteur . Dans les années 1990, technologie CT a été tout d’abord utilisée pour étudier les structures morphologiques et développement des systèmes de racine de plante. Au cours de la dernière décennie, synchrotron HRCT est devenu un...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette recherche a été financée par National Nature Science Foundation of China (No.31671577), la Science et technologie Innovation spécial Construction financés par le programme de Pékin Académie d’Agriculture et foresterie Sciences(KJCX20180423), la recherche Programme de développement de la Chine (2016YFD0300605-01), la Fondation des sciences naturelles de Beijing (5174033), la Beijing Postdoctoral Foundation (2016 ZZ-66) et recherche la Beijing Academy of Agricultural et subvention de Sciences forestières (KJCX20170404),) JNKYT201604).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Skyscan 1172 Système de tomodensitométrie à rayons XBruker Corporation, BelgiqueNAPour la tomodensitométrie
CO2 système de séchage du point critique (Leica CPD300)Leica Corporation, AllemagneNAPour le séchage d’échantillons
ÉthanolToutNAPour fixation FAA
FormaldéhydeToutNAPour fixation FAA
Acétique acideToutNAPour la fixation FAA
Lame chirurgicaleN’importe quelNAPour couper les échantillons
Imprimante 3D Makerbotreplicator 2, MakerBot Industries, USANAPour imprimer les paniers d’échantillons de racines, de tiges et de feuilles de maïs
Tube à centrifugerCorning, États-UnisNAPlacer les matériaux de la racine, de la tige ou des feuilles
Iode solideToutNAPour la teinture d’échantillons
Logiciel SkyScan NreconSkyScan NRecon, Version : 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgiqueNAPour la reconstruction d’images
Logiciel VesselParser VesselParser, Version : 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Pékin, ChineNAProtocole d’analyse d’images pour une image CT unique de la tige ou de la feuille de maïs
ScanIPScanIP, Version : 7.0 ; Simpleware, Exeter, Royaume-UniNA Logicielde traitement d’images 3D
Gants en latexTous NA
Pince à épilerToutNA

Références

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