Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo

Résumé

La synthèse des protéines est un processus biologique essentiel pour les cellules. Dans le cerveau, il est nécessaire pour les changements adaptatifs. La mesure des taux de synthèse des protéines dans le cerveau intact nécessite des considérations méthodologiques soignelées. Ici nous présentons la méthode autoradiographique quantitative de L-[1-¹⁴C]-leucine pour déterminer des taux régionaux de synthèse cérébrale de protéine in vivo.

Résumé

La synthèse des protéines est nécessaire pour le développement et le maintien de la fonction neuronale et est impliquée dans les changements adaptatifs dans le système nerveux. En outre, on pense que la dysrégulation de la synthèse des protéines dans le système nerveux peut être un phénotype de base dans certains troubles du développement. La mesure précise des taux de synthèse des protéines cérébrales dans les modèles animaux est importante pour comprendre ces troubles. La méthode que nous avons développée a été conçue pour être appliquée à l'étude des animaux éveillés et se comportant. Il s'agit d'une méthode autoradiographique quantitative, de sorte qu'il peut produire des taux dans toutes les régions du cerveau simultanément. La méthode est basée sur l'utilisation d'un acide aminé traceur, L-[1-¹⁴C]-leucine, et un modèle cinétique du comportement de L-leucine dans le cerveau. Nous avons choisi L-[1-¹⁴C]-leucine comme traceur parce qu'elle ne conduit pas à des produits métaboliques étiquetés par des produits non-terrestres. Il est soit incorporé dans les protéines ou rapidement métabolisé pour produire ¹⁴CO₂ qui est dilué dans un grand pool de CO₂ non étiqueté dans le cerveau. La méthode et le modèle permettent également la contribution de la leucine non étiquetée dérivée de la protéolyse tissulaire au pool de précurseurs tissulaires pour la synthèse des protéines. La méthode a la résolution spatiale pour déterminer les taux de synthèse des protéines dans les couches cellulaires et neuropil, ainsi que les noyaux hypothalamiques et crâniens nerf. Pour obtenir des données quantitatives fiables et reproductibles, il est important d'adhérer aux détails de la procédure. Ici, nous présentons les procédures détaillées de la méthode quantitative autoradiographique L-[1-¹⁴C]-leucine pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines in vivo.

Introduction

La synthèse des protéines est un processus biologique important requis pour un changement adaptatif à long terme dans le système nerveux¹. L'inhibition de la synthèse des protéines bloque le stockage de la mémoire à long terme chez les invertébrés et les vertébrés². La synthèse des protéines est essentielle pour le maintien des phases tardives de certaines formes de potentialisation à long terme (LTP) et de dépression à long terme (LTD)³, survie neuronale pendant le développement⁴, et pour le maintien général du neurone et de ses connexions synaptiques⁵. La mesure des taux de synthèse des protéines cérébrales peut être un outil important pour étudier les changements adaptatifs ainsi que les troubles neurodéveloppementaux et les troubles liés à l'apprentissage et à la mémoire.

Nous avons développé une méthode pour quantifier les taux de synthèse des protéines cérébrales in vivo chez un animal éveillé qui offre des avantages inhérents à d'autres techniques qui estiment les taux de préparations ex vivo ou in vitro des tissus cérébraux⁶. Le premier est l'applicabilité aux mesures dans le cerveau intact dans un animal éveillé. Il s'agit d'une considération clé, car il permet des mesures avec la structure synaptique et la fonction en place et sans préoccupations au sujet des effets post mortem. En outre, l'approche autoradiographique quantitative que nous employons atteint un degré élevé de localisation spatiale. Alors que l'énergie de ¹⁴C est telle que nous ne pouvons pas localiser le traceur au niveau subcellulaire ou cellulaire, nous pouvons mesurer les taux dans les couches cellulaires et les petites régions du cerveau telles que les noyaux hypothalamiques, avec environ une résolution de 25 m⁷.

Un défi des mesures in vivo avec des radiotracers est de s'assurer que l'étiquette radio mesurée est dans le produit de la réaction d'intérêt plutôt que le précurseur étiqueté non réagi ou d'autres produits métaboliques étiquetés non associés⁶. Nous avons choisi L-[1-¹⁴C]-leucine comme acide aminé traceur parce qu'il est soit incorporé dans la protéine ou rapidement métabolisé à ¹⁴CO_2, qui est dilué dans le grand pool de CO₂ non étiqueté dans le cerveau résultant du taux élevé de métabolisme énergétique⁸. En outre, tout ¹⁴C non incorporé dans la protéine existe principalement comme libre [¹⁴C]-leucine, qui au cours de la période expérimentale de 60 min, est presque entièrement effacé du tissu⁶. Les protéines sont ensuite fixées aux tissus avec formaline et ensuite rincées avec de l'eau pour enlever toute leucine libre^[14C]-leucine avant l'autoradiographie.

Une autre considération importante est la question de la dilution de l'activité spécifique du pool d'acides aminés précurseurs par des acides aminés non étiquetés dérivés de la protéolyse tissulaire. Nous avons montré que chez le rat et la souris adultes, environ 40% du bassin précurseur de leucine pour la synthèse des protéines dans le cerveau provient d'acides aminés dérivés de la dégradation des protéines⁶. Ceci doit être inclus dans le calcul des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (RCPS) et doit être confirmé dans les études dans lesquelles cette relation peut changer. La base théorique et les hypothèses de la méthode ont été présentées en détail ailleurs⁶. Dans le présent document, nous nous concentrons sur les questions de procédure de l'application de cette méthodologie.

Cette méthode a été utilisée pour la détermination de rCPS chez les écureuils terrestres⁹, moutons¹⁰, singes rhésus¹¹, rats^{12,13,14,15,16 , 17 Annonces , 18} ans, états-unis qui ^{, 19 ans,} états-unis qui ^{, 20} Ans, états-unis ^{, 21}, un modèle de souris de tubercule la sclérose complexe²², un modèle de souris du syndrome X fragile^23,24,25,26, fragileX souris prémutation²⁷, et un modèle de souris de phénylketonuria²⁸. Dans ce manuscrit, nous présentons les procédures de mesure de rCPS avec la méthode autoradiographique in vivo L-[1-¹⁴C]-leucine. Nous présentons rCPS dans les régions de cerveau d'une souris de contrôle éveillée. Nous démontrons également que l'administration in vivo de l'anisomycine, un inhibiteur de la traduction, abolit la synthèse des protéines dans le cerveau.

Protocole

Remarque : Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité national des soins et de l'utilisation des animaux en santé mentale et ont été exécutées conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health sur les soins et l'utilisation des animaux.

Un aperçu du protocole est présenté à la figure 1.

1. Implanter chirurgicalement des cathéters dans une veine fémorale et une artère pour l'administration du traceur et la collecte des échantillons de sang artériel chronométrés, respectivement. Chirurgie complète d'au moins 22 h avant l'administration du traceur. La chirurgie nécessite environ 1 h pour terminer.

1. Rassembler les matériaux nécessaires : instruments chirurgicaux stériles (ciseaux chirurgicaux, micro-ciseaux, forceps, trois crochets chirurgicaux pour la peau), équipement pour l'anesthésie isoflurane (vaporisateur d'isoflurane, charognard actif de gaz, chambre d'anesthésie scellée, anesthésie cône nasal), stade de chirurgie stérile, tondeuses à fourrure, 70 % d'éthanol, de bétadine, gaze stérile, ruban chirurgical, chauffe-mains commerciaux, microscope chirurgical, chlorure stérile de 0,9 % de sodium (saline), héparine stérile 100 unités USP/mL en chlorure de sodium de 0,9 % (heparinisé saline), stérile cinq bandes de 20 cm de suture absorbable de 6-0, brins stériles de 25 cm de PE-8 et PE-10 cathéters en polyéthylène avec une extrémité coupée à 45^o, seringues stériles de 1 cc, aiguilles stériles de 32 jauges, équipement de cautérisation, stérile15-20 cm creux en acier inoxydable tige d'acier (2,5 mm de diamètre intérieur, 3 mm de diamètre extérieur), anesthésiques locaux (onimite de bupivane et de lidocaïne), et enclos animal avec configuration d'appendice pivotant (30 cm d'attache de ressort avec bouton, pivot, monture pivotante et bras, 20 X 13 cm cylindrique clair conteneur).
2. Préparer l'animal pour la chirurgie.
3. Assurez-vous que les techniques aseptiques et stériles appropriées sont utilisées selon les besoins de votre établissement.
   1. Pesez l'animal. L'animal doit être d'au moins 25 g pour une chirurgie réussie.
   2. Placez l'animal à l'intérieur d'une chambre en plexiglas scellée et connectez la chambre à l'appareil d'anesthésie isoflurane. Fixer le débit à 2,5 L/min pour les mâles et à 3,0 L/min pour les femelles de 1,5 % d'isoflurane dans O₂. Après environ 2 min, assurez-vous que la souris est correctement sédative par l'absence d'un réflexe de retrait avec une pincée d'orteil.
   3. Une fois sous sédatif, retirez la souris de la chambre et placez-la en position couchée avec son visage à l'intérieur du cône nasal d'anesthésie. Installez le cône de nez pour recevoir le gaz du vaporisateur et pour retourner le gaz au charognard. Le charognard capturera l'isoflurane dans un filtre à charbon de bois.
   4. Utilisez des tondeuses pour raser la fourrure entre les omoplates. Assurez-vous de stériliser correctement la région rasée, en alternant trois fois entre les gommages de bêtadine et d'éthanol.
   5. Retournez la souris dans une position de supine en gardant le visage dans le cône de nez. Tapez la jambe gauche sur le stade de la chirurgie et utilisez des tondeuses pour raser la fourrure de la cuisse interne gauche à l'abdomen gauche supérieur. Assurez-vous de stériliser correctement la région rasée, en alternant trois fois entre les gommages de bêtadine et d'éthanol.
   6. Faites glisser sous la souris un chauffe-mains activé disponible dans le commerce, enveloppé dans de la gaze. Tapez la jambe droite sur le stade de la chirurgie.
4. Insérer le cathéter dans la veine fémorale gauche.
   1. À l'aide d'un microscope chirurgical, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision de 1 cm de la partie médiale supérieure de la cuisse gauche rostalement vers la ligne médiane, révélant l'artère fémorale et la veine.
   2. Retirez la peau lâche avec des crochets chirurgicaux pour exposer davantage les vésicules.
   3. Appliquer du chlorure de sodium stérile de 0,9 % sur la zone exposée pour maintenir une humidité adéquate.
   4. Utilisez des forceps pour émousser le disséquement, séparant le tissu conjonctif autour d'une petite section de l'artère fémorale et de la veine. Soigneusement, séparer l'artère et la veine (Figure 2).
   5. Utilisez des forceps pour enfiler un brin de suture absorbable (Strand A) sous la veine fémorale et l'artère au point le plus latéral de l'incision. Tirez la suture à mi-chemin à travers de sorte que les extrémités sont égales.
   6. À un point plus proximal à l'aine, utiliser des forceps pour enfiler une deuxième suture (Strand B) sous seulement la veine fémorale. Attachez doucement un demi-noeud qui sera utilisé pour restreindre la circulation sanguine.
   7. À un point entre le brin A et le brin B, utilisez des forceps pour enfiler une troisième suture (Strand C) sous seulement la veine fémorale. Attachez doucement un noeud complet qui sera utilisé pour restreindre la circulation sanguine. Veillez à ne pas déchirer la veine.
   8. Tirez doucement sur le brin B pour limiter la circulation sanguine. Utilisez un hemostat pour tirer doucement Strand B pour maintenir la circulation sanguine restreinte.
   9. Couper un petit trou dans la zone restreinte de la veine fémorale avec des microscissors et insérer soigneusement l'extrémité inclinée du tube PE-8 (précédemment rincé avec de l'héparine saline) vers le brin B. Une fois inséré, relâchez la tension de Strand B et guidez le cathéter plus haut dans la veine. Resserrer le brin B autour de la veine contenant le cathéter.
   10. À l'aide du brin C, nœuer un noeud supplémentaire autour du cathéter. Assurez-vous que ce noeud ne capte pas l'artère fémorale.
   11. Retirez doucement sur le baril de seringue pour remplir partiellement le tube de sang pour s'assurer que le cathéter a été implanté correctement.
5. Après la même procédure, insérez un cathéter PE-10 dans l'artère fémorale gauche.
6. Procédure chirurgicale complète.
   1. Une fois que les cathéters de veine fémorale et d'artère ont été fixés, attachez le brin A dans un noeud autour des deux cathéters.
   2. Couper tous les points de suture excédentaires et enlever les crochets de peau. Rincer le cathéter artériel avec de la saline héparinisée pour éviter la coagulation. Cauteriser les extrémités des deux cathéters pour créer un joint.
   3. Placez la souris en position couchée et faites une petite incision à la base du cou et appliquez saline sur la zone exposée.
   4. Insérer la tige de métal creuse subdermally de l'incision de cou à l'incision fémorale. Serpentez les cathéters à travers la tige creuse et hors de l'incision du cou. Retirez la tige creuse. L'implantation subderformelle des cathéters empêchera les souris d'endommager les cathéters.
   5. Appliquer la bupivacaine sur les côtés de la plaie. Fermer l'incision fémorale avec de la suture. Ajouter la pommade de lidocaïne sur la plaie fermée et suture.
   6. Serpentez les cathéters à travers un tube creux flexible de 30 cm (attache de ressort) et suturez le bouton de l'attache de ressort sous la peau. Appliquer la bupivacaine sur les côtés de la plaie. Suturer le bouton de l'attache de ressort sous la peau. Ajouter la pommade de lidocaïne sur la plaie fermée et suture.
   7. Déplacer la souris dans un récipient cylindrique clair (20 cm de haut, 13 cm de diamètre) avec une monture pivotante et un bras pour loger l'animal pendant la période de récupération. Placez un chauffe-mains sous le récipient pour garder l'animal au chaud.
   8. Visser le haut de l'attache de ressort à un pivot et fixer le pivot vers le bras pivotant attaché au récipient cylindrique. Assurez-vous que la souris a une gamme complète de mouvement et les cathéters peuvent être consultés.
   9. Placez un couvercle à fentes qui n'interfère pas avec le mécanisme pivotant au-dessus de l'enclos des animaux. Reportez-vous à la figure 3 pour la configuration complète.
   10. Laisser la souris récupérer. Au moins 22 h est recommandé.

2. Préparer l'onde L-[1-¹⁴C]leucine pour l'injection et 16 % (w/v) solution de déshydratation à 5 sulfosalicyliques (SSA) pour la déprotéinification des échantillons de plasma. Dans la solution SSA, inclure également 0,04 mM de norleucine et 1 'Ci/mL [H³]leucine comme normes internes pour l'analyse des acides aminés et l'analyse de la concentration de traceurs dans les fractions plasmatiques solubles dans l'acide, respectivement. Conserver l'ESS jusqu'à deux mois à 4 oC.

1. Acheter l'al-[1-¹⁴C]leucine disponible dans le commerce (50-60 mCi/mmol), qui est vendu comme solution en éthanol à 2 % ou 0,1 N HCl. Soufflez sécher une activité connue du traceur sous un doux flux d'azote et reconstituer dans une solution de saline normale stérile fabriquée jusqu'à une concentration de 100 'Ci/mL.

3. Administrer L-[1-¹⁴C]leucine par voie intraveineuse et recueillir des échantillons de sang artériel.

1. Rassembler les matériaux nécessaires : 18 microtubes de 1,5 ml pour la déprotéinisation des échantillons de plasma (ajouter 70 mL d'eau déionisée à chaque tube), 17 insertions de flacons de verre de 250 ml (15 inserts pour la collecte d'échantillons de sang artériel et 2 inserts pour la collecte de sang mort-vivant à être réinjectés. Pour limiter la collecte de sang supplémentaire et inutile, de petits inserts minces de flacon de verre avec des fonds effilés qui permettent le pipetting accessible du plasma supernatant est recommandé), 2 tubes microcapillaires (32 X 0.8mm, pour la mesure d'hématocrit), 1 héparine et tube microcentrifuge enduit de fluorure de lithium (pour prévenir la coagulation et la glycolyse, respectivement), hemostats (couvrir les pointes avec des tubes de tygon de sorte que les pinces n'endommageront pas les tubes PE), moniteur de glycémie, transduceur de pression artérielle, 1 mL de seringues stériles (pour solution d'euthanasie disponible dans le commerce (dilué1:1 dans de l'eau déionisée (pour les souris)).
2. Assurez-vous que l'animal est dans un état physiologique normal au début de l'expérience.
   1. Clamp le tube artériel à environ 2 cm de l'extrémité et couper la pointe, créant une ouverture pour le sang à couler. Ensuite, dépincez les tubes et collectez du sang mort dans l'espace ((c. 30 ml) pour recueillir tout salin résiduel et/ou sang des prélèvements précédents) et, dans un tube séparé, recueillez un échantillon témoin (environ 30 l), des échantillons d'hématocrit (environ la moitié du volume du tube capillaire) et un glucose (environ 20 l).
   2. Mesurer l'hématocrit en branchant une extrémité avec du mastic et de la centrifugeuse scellants pendant 1 min à 4500 x g. Mesurer le rapport du volume des globules rouges au volume sanguin total. Si un animal a un hématocrit inférieur à 30%, ne poursuivez pas l'étude.
   3. Utilisez un moniteur de glycémie disponible dans le commerce pour mesurer le taux de glucose dans une goutte de sang.
   4. Échantillon de contrôle centrifugeuse pendant 2 min à 18 000 x g pour séparer le plasma. Déprotéiculer les échantillons de plasma comme suit : ajouter 5 l de plasma à 70 l d'eau déionisée dans un microtube de 1,5 ml, ajouter 25 l de la solution SSA de 16 % et du vortex. Placer sur la glace pendant 30 min avant de geler sur de la glace sèche.
   5. Retournez le sang mort de l'espace à l'animal par la ligne veineuse, suivi d'une chasse d'eau saline héparinisée pour empêcher la perte de sang excédentaire.
   6. Connectez la ligne artérielle à un transducteur de tension artérielle pour mesurer la tension artérielle moyenne.
   7. Après avoir pris les échantillons assurez-vous de re-serrer la ligne artérielle et de rincer la ligne avec un petit volume (50 ml) de saline héparinisée.
3. Administrer le traceur par voie intraveineuse et recueillir des échantillons de sang artériel chronométrés.
   1. Utilisez un connecteur Y pour attacher une seringue avec le traceur (100 ci/kg) et une seringue avec saline stérile de 50 ml pour rincer la ligne veineuse après l'injection de traceur. Connectez Y-connecteur à la ligne veineuse.
   2. Lancez l'étude en commençant simultanément un chronomètre et en injectant le traceur. Rincer la ligne veineuse avec de la saline (c. 100mL) immédiatement après l'injection.
   3. Recueillir des échantillons de sang 1-7 en continu tout au long des 2 premières min de l'expérience de la même manière. Après avoir prélevé le 7e échantillon, prélever 30 ll de sang mort-espace avant chaque échantillon restant. Les échantillons 8-14 sont recueillis à 3, 5, 10, 15, 30, 45 et 60 min, respectivement.
   4. Traiter les échantillons de sang immédiatement après la collecte, tel qu'il a été décrit pour l'échantillon témoin. En cas de retard, placez les échantillons sur la glace. Réinjectez soigneusement le sang mort d'espace dans l'artère par l'intermédiaire du cathéter artériel et rincer avec la saline d'héparine.
   5. À un moment donné au cours de l'expérience, traiter trois normes internes en ajoutant 25 L 16% SSA, 0,04 mM norleucine, et 1 mCi/mL [³H]leucine à 75 'L eau, vortex et place sur la glace.
   6. Après avoir recueilli le 14e échantillon à 60 min, injecter environ 0,2 ml de B-euthanasie-D dans la ligne veineuse pour euthanasier l'animal. Enregistrez l'heure de la mort.
   7. Dévisser l'animal de la monture pivotante et retirer de l'enclos des animaux. Retirez soigneusement le cerveau, placez-le sur du papier d'aluminium et congelez-le sur de la glace sèche. Ne gèlez pas les cerveaux avec de l'azote liquide car le cerveau peut se fissurer. Entreposez le cerveau, les échantillons et les normes internes à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour le traitement. Le traitement peut être effectué à tout moment par la suite.

4. Analyser les concentrations de leucine et de L-[1-¹⁴C]leucine dans des échantillons de plasma.

1. Dégel des échantillons et des normes internes sur la glace, le vortex et la centrifugeuse 18 000 x g pendant 5 min à 2 oC. La fraction supernatant contiendra la leucine libre étiquetée et non étiquetée.
2. Transférer 40 l de supernatant dans un flacon de scintillation liquide et ajouter le cocktail de scintillation. Quantifier les désintégrations par min (DPM) de ³H et ¹⁴C au moyen du comptage de la scintillation liquide et d'une courbe d'étance conçue pour le comptage simultané à double étiquette (3 H et ¹⁴C).
3. Pour quantifier les concentrations plasmatiques de leucine, utilisez un système HPLC avec une colonne d'échange de cation de sodium et une dérivatisation post-colonne avec o-phthaldéhyde et détection fluorométrique.
   1. Définir HPLC selon les spécifications suivantes : excitation fluoromètre de 330 nm et émission de 465 nm. La phase mobile se compose de l'éluant de sodium, pH 7,40, et de l'éluant de sodium - 5% sulfolane, pH 3.15. Définir le débit tampon de 0,400 ml/min et le débit de l'instrument de dérivation à 0,300 ml/min. Fixer la température de la colonne à 48 oC et la température du réacteur à 45 oC.
   2. Calibrer le système avec une gamme de concentrations d'acides aminés (y compris la norleucine) entre 30 et 500 pmol/10mL. La courbe d'étalonnage est linéaire. Les concentrations d'acides aminés des échantillons d'injection testés de 10 ml se situent dans les fourchettes de cette courbe d'étalonnage.

5. Effectuer l'autoradiographie quantitative.

1. Préparer des sections cérébrales de 20 m d'épaisseur pour l'autoradiographie. Section du cerveau au moyen d'un cryostat à -20 oC.
2. Décongeler les sections du cerveau en série sur des lames recouvertes de gélatine. L'air sec.
3. Laver les glissières en cinq changements de formaline de 10 % pendant 30 min par changement, suivie d'un débit continu d'eau déionisée pendant 1 h. Couvrir les glissières lâchement de papier d'aluminium pour éviter la poussière et laisser sécher pendant 24 h.
4. Disposer des diapositives dans une cassette de film à rayons X (des cassettes qui s'adaptent à des films de mammographie de 20X25 cm sont recommandées) ainsi qu'un ensemble de [¹⁴C]méthylmethacrylate standards, qui ont été précédemment calibrés contre des tissus de concentrations connues de ¹⁴C comme décrit²⁹. Les normes peuvent être achetées commercialement, mais elles garantissent qu'elles couvrent une plage de 2 à 300 mCi/g de tissu et qu'elles sont calibrées sur une épaisseur de tissu de 20 m. Sous le feu rouge, placez un morceau de film de mammographie, côté émulsion vers le bas, sur le dessus des sections.
5. Scellez les cassettes et placez-les dans un sac à louage noir et entreposez-les dans une armoire pendant 40 à 45 jours.
6. Développer des films selon les directives du fabricant. Remarque : Le développement automatisé de films n'est pas recommandé parce que l'arrière-plan peut être inégal et affecter la quantification.

6. Analyser les images.

Remarque : Il est recommandé d'avoir un programme d'analyse d'image disponible dans le commerce, couplé à une caméra CCD et à une boîte lumineuse fluorescente avec un éclairage uniforme. Les densités optiques relatives dans le film illuminé sont détectées par la caméra CCD.

1. Construire une courbe d'étalonnage de densité optique (OD) c. concentration de tissu ¹⁴C basée sur les OD de l'ensemble de normes calibrées sur le film. Adéquation de ces données (y compris le blanc ou le fond) à une équation polynomiale. Une équation polynomiale de deuxième ou troisième degré s'adapte très bien.
2. Pour analyser des régions spécifiques du cerveau, localisez la région d'intérêt (ROI) en six à huit sections par rapport à un atlas cérébral. Enregistrez les OD des pixels dans un retour sur investissement dans toutes les sections et, en fonction de la courbe d'étalonnage, calculent la concentration de ^{tissu 14}C dans chaque pixel. Calculer la concentration moyenne de ¹⁴C de tissu dans le roi-roi.

7. Calcul de rCPS. Calculer rCPS dans chaque ROI au moyen de l'équation suivante :

Là où la concentration moyenne pondérée de tissu de ¹⁴C dans le ROI, C_p(t) et C^p(t) sont les concentrations artérielles de plasma de leucine non étiquetée et étiquetée à l'époque, t, T est le moment où l'animal est mort ( environ 60 min), et est la fraction de leucine dans le bassin de précurseurs tissulaires qui provient du plasma. L'évaluation de l'aétée est effectuée dans le cadre d'une expérience distincte ⁶. a été évalué en WT, Fmr1 knock-out, Tsc^-, et pKU souris ^6,22,25,28. Si une expérience implique des changements génétiques ou pharmacologiques qui pourraient affecter les taux de synthèse, de dégradation ou de métabolisme des protéines, il faut évaluer les nouveaux taux de synthèse, de dégradation ou de métabolisme de la leucine.

Résultats

Ici nous montrons une expérience représentative démontrant les effets de l'administration antérieure d'un inhibiteur de synthèse de protéine sur rCPS. L'anisomycine dans la saline normale a été administrée à une souris sauvage de type sauvage de C57/BL6 adulte sous-cutanée (100 mg/kg) 30 min avant l'initiation de la détermination de rCPS. Les effets du traitement de l'anisomycine par rapport à un animal témoin traité par véhicule montrent que le RCPS est presque indétectable chez la souri...

Discussion

Nous présentons une méthode quantitative pour déterminer les taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (rCPS) in vivo chez les animaux expérimentaux. Cette méthode présente des avantages considérables par rapport aux méthodes existantes : 1. Les mesures sont effectuées chez l'animal qui se comporte éveillé, de sorte qu'elles reflètent les processus continus dans le cerveau qui fonctionne. 2. Les mesures sont faites au moyen de l'autoradiographie quantitative offrant la capacité de déterminer rCPS dans toutes le...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris	The Jackson Laboratory	003024	Fmr1 knockout couples reproducteurs
Anisomycine	Tocris Bioscience	1290
Tubes microhématocrites	Drummond Scientific	1-000-3200-H	Tubes capillaires
Critoseal Tube capillaire Mastic	Leica Microsystems	39215003	mastic d’étanchéité
Flacon en verre inserts	Agilent	5183-2089	utilisés pour prélever des échantillons de sang
Digi-Med Blood Pressure Analyzer	Micro-Med Inc.	Tensiomètre	BPA-400
Bayer Breeze 2 Système de surveillance de la glycémie	Bayer Breeze	9570A	Glucomètre
Seringue étanche	Hamilton Co.	1710	seringue en verre à la tuberculine
HeatMax HotHands-2 Chauffe-mains	HeatMax	Model HH2	coussins chauffants
Heparin Lock Flush Solution	Fresenius Kabi USA, LLC	504505	héparine saline
Conteneur pour animaux transparent Instech	MTANK/W	enclos pour animaux	Attache
à ressort	Instech	PS62	tube de cathéter/accessoire pour rongeurs
Crochets pivotants	Instech	375/25	pour sangle à ressort
Bras pivotant et support	Instech	SMCLA	crochets pour pivot et enclos pour animaux
Bouton d’attache	Instech	VAB62BS/22	se fixe au bas de la sangle à ressort
Tube en acier inoxydable	Fabriqué en interne	N/A	utilisé pour serpenter les cathéters à travers la souris
Matrx VIP 3000	Matrx	91305430	vaporisateur d’isoflurane
Isoflurane	Stoelting Co.	50207	Adsorbeur isoflurane/halothane
Clippers	Oster Finisher	Modèle 59
Crochets chirurgicaux pour la peau	Fabriqués en interne ( ??)	N/A ( ??)
0,9 % Chlorure de sodium Saline	APP Pharmaceuticals LLC	918610
Forceps	Outils de sciences fines	11274-20
Ciseaux chirurgicaux	Outils de sciences fines	14058-11
Microciseaux	Outils de sciences fines	15000-00
UNIFY sutures chirurgicales en soie	AD Chirurgien	#S-S618R13	6-0 USP,
tube en polyéthylène PE-8	SAI Infusion Technologies	PE-8-25
Seringue	Becton Dickinson and Co.	309659	1cc/mL
	Clay Adams	427400
MCID Analysis	Imaging Research Inc.	Version 7.0	Analyse de la densité optique
Lames recouvertes de gélatine (75x25mm)	FD Neurotechnologies	PO101
Cryostat	Leica	CM1850
Super RX-N film radiographique médical	Fuji	47410-19291
Hypercassettes (8x10 in)	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-14C]leucine	Moravek	MC404E
Tube de microcentrifugation	Sarstedt Aktiengesellschaft & Co.	72.692.005	utilisé pour déprotéiniser des échantillons de sang
Pipette pasteur en verre	Wheaton	357335
Laine de verre	Sigma-Aldrich	18421
azote	NIH	6830009737285
Fluide de scintillation	CytoScint	882453
Compteur de scintillation liquide	Packard Tri-Carb	2250CA
Analyseur d’acides aminés	Pickering Laboratories	Pinnacle PCX
Unité HPLC	Agilent Technologies	1260 Infinity	comprend 1260 Pompe bio-inerte
Microscope chirurgical	Wild Heerbrugg	M650
Acide sulfosalicylique	Sigma-Aldrich	MKBS1634V	Acide 5-sulfosalicylique dihydraté
Norleucine	Sigma	N8513
1.0 N HCl	Sigma-Aldrich	H9892
[H3]leucine	Moraevk	MC672
Tube Falcon	Thermo Scientific	339652	50 mL Tubes à centrifuger coniques
Chronomètre	Heuer Microsplit	Modèle 1000	1/100 min
Euthanasie Solution	Vet One	H6438
Northern Light Precision Illuminator	Imaging Research Inc.	Modèle B95	caisson fluorescent
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8	Nikon	1442	CDD appareil photo