Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence

Résumé

ICP0 subit une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. On ne connaît pas le mécanisme moléculaire de cet événement. Nous décrivons ici l’utilisation du microscope confocal comme un outil permettant de quantifier le mouvement ICP0 dans l’infection HSV-1, qui jette les bases pour l’analyse quantitative ICP0 translocation dans de futures études mécanistes.

Résumé

Cellule infectée protéine 0 (ICP0) de l’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) est une protéine début immédiate contenant une anneau de type E3 ubiquitine ligase. Il est responsable de la dégradation de proteasome des facteurs restrictifs de l’hôte et l’activation des gènes viraux ultérieures. ICP0 contient une séquence de localisation nucléaire canonique (NLS). Il pénètre dans le noyau immédiatement après la synthèse de novo et exécute ses fonctions de défense de l’hôte contre principalement dans le noyau. Cependant, plus tard dans l’infection, ICP0 se trouve exclusivement dans le cytoplasme, ce qui suggère la présence d’une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. Sans doute ICP0 translocation permet ICP0 de moduler ses fonctions selon ses emplacements sous-cellulaires lors des phases d’infection différents. Afin de délimiter la fonction biologique et le mécanisme de régulation de la translocation nucléaire-à-cytoplasmique ICP0, nous avons modifié une méthode de microscopie par immunofluorescence pour surveiller ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1. Ce protocole consiste immunofluorescence, microscope confocal imagerie nucléaire vs distribution cytoplasmique analyse et. Le but du présent protocole est d’adapter les images confocales état stationnaire, pris dans une évolution temporelle dans une documentation quantitative du mouvement ICP0 tout au long de l’infection lytique. Nous proposons que cette méthode peut être généralisée pour analyser quantitativement nucléaire vs localisation cytoplasmique d’autres protéines virales ou cellulaires sans faire appel à une technologie d’imagerie live.

Introduction

L’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) provoque un large éventail de légère à sévères maladies herpétiques, y compris l’herpès labial, l’herpès génital, kératite stromale et l’encéphalite. Une fois infecté, le virus crée une vie latente dans les neurones des ganglions. Parfois, le virus peut être réactivé par différentes raisons telles que la fièvre, le stress et immunodépression¹, conduisant à l’infection par l’herpès récurrent. Protéine de la cellule infectée 0 (ICP0) est un important régulateur viral crucial pour les lytique et latente infection HSV-1. Il transactive virus en aval gènes via contrecarrer l’hôte des défenses antivirales intrinsèque/innée^2,3. ICP0 a une activité de ligase E3 ubiquitine, qui s’adresse à plusieurs facteurs cellulaires pour la dégradation du protéasome dépendante³. Il interagit aussi avec les diverses voies de cellule de réglementer leurs activités et par la suite pour compenser l’hôte antiviral restrictions³. ICP0 est connu pour localiser à différents compartiments subcellulaires à mesure que l’infection progresse^3,4,5. La protéine a un signal de localisation nucléaire riche en lysine/arginine (NLS) situé à résidus 500 à 506⁶. Lors de la synthèse de novo au début infection HSV-1, ICP0 est immédiatement importées dans le noyau. Il est tout d’abord détecté à une dynamique nucléaire structure appelé domaine nucléaire 10 (ND10)⁷. L’activité de ligase E3 ubiquitine de ICP0 déclenche la dégradation des protéines organisateur ND10, protéine (PML) la leucémie promyélocytaire et protéine moucheté 100 kDa (Sp100)^8,9,10. Après la perte de protéines de l’organisateur, ND10 corps nucléaires sont dispersées et ICP0 est diffusée pour remplir le noyau entier^4,11.

Fait intéressant, après le début de la réplication de l’ADN viral, ICP0 disparaît du noyau. On le trouve uniquement dans le cytoplasme, ce qui suggère la présence d’une translocation nucléaire-à-cytoplasmique fin de HSV-1 infection^4,12. L’exigence de la réplication de l’ADN implique l’implication potentielle d’un fin ou des protéines virales dans la facilitation de la translocation cytoplasmique de HSV-1 ICP0^4,12. Apparemment ICP0 traite entre les différents compartiments au cours de l’infection confère le pouvoir ICP0 de moduler ses interactions à diverses voies cellulaires de façon spatio-temporelle et donc coordonner ses multiples fonctions à fine tune l’équilibre entre lytique et latente HSV-1 infection¹³. Pour mieux comprendre ICP0 multifonctionnalité et la coordination des domaines fonctionnels ICP0 tout au long de l’infection lytique, nous avons soigneusement disséqué la base moléculaire de la dynamique de la translocation de ICP0¹². Pour mener les études mécanistiques rapportées antérieurement¹², nous avons appliqué une méthode de coloration par immunofluorescence pour visualiser la localisation sous-cellulaire ICP0 au statut de différentes infections sous microscope confocal. Nous avons également développé un protocole quantitatif pour analyser la nucléaire vs cytoplasmique distribution de ICP0 en utilisant le logiciel confocal. La population de cellules infectés par HSV-1 a été tabulée pendant les phases de l’infection et les tendances du mouvement ICP0 ont été analysés, sous différents traitements biochimiques¹². Nous décrivons ici le protocole détaillé que la translocation de documents ICP0 dans l’infection par HSV-1. Nous proposons que cette méthode puisse être adoptée comme une méthode générale pour étudier la translocation nucléaire vs cytoplasmique d’autres protéines virales ou cellulaires, qui peut servir d’alternative aux direct imaging lorsque la technique d’imagerie live est inapplicable en raison de problèmes tels que l’étiquetage méthode, intensité du signal ou l’abondance de la protéine.

Protocole

1. cellule ensemencement et infection par le Virus

1. 20 – 24 h avant l’infection par le virus, des graines de 5 x 10⁴ cellules fibroblastes pulmonaires embryonnaires humaines (HEL) ou d’autres cellules pour être examiné sur une lame de 4 puits 11 mm décalées dans le milieu de croissance (de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % fœtale bovine sérum (FBS)). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
   NOTE : Chaque bien doit avoir confluence de cellules de 70 à 80 % au moment de l’infection.
2. Le lendemain, retirer le milieu de croissance et infectent les cellules avec les virus en milieu-199 à une distance de 4 à 10 pfu/cellule. Incuber les cellules infectées par le virus pendant 1 h à 37 ° C. Garder secouant la diapositive au cours de la période d’incubation.
3. Après l’incubation de 1 h, enlever le milieu-199 et compléter avec un milieu de croissance.
   Remarque : Les médicaments qui interfèrent avec les phases de l’infection à différents peuvent être ajoutés à cette étape ou avant l’absorption virale.
4. Incuber les cellules infectées par le virus à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pour diverses durées de période d’infection.

2. fixation et Permeabilization

1. Au moment de l’infection adéquate, vite laver les cellules infectées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois et ajouter 200 μl de paraformaldéhyde 4 % fraîchement préparé dans du PBS. Incuber les cellules avec du paraformaldéhyde pendant 8 à 10 min à température ambiante pour fixer les cellules dans chaque puits.
2. Aspirer la paraformaldéhyde et laver les puits avec 200 μl de PBS pour 3 fois. Aspirer complètement PBS après le lavage 3^rd .
3. Ajouter 100 μL de surfactant non ionique de 0,2 % dans chaque puits pour permeabilize les cellules pendant 5 – 10 min.
4. Aspirer le surfactant non ionique et laver les puits avec 200 μl de PBS pour 3 fois.

3. immunofluorescence

1. Totalement aspirer PBS et ajouter 200 μl de tampon de blocage (1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 5 % de sérum de cheval dans du PBS) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 ° C durant la nuit.
2. Ajouter la concentration déterminée expérimentalement d’anticorps primaire (¹²d’anticorps polyclonal de lapin anti-ICP0) dans un tampon bloquant et incuber l’anticorps primaire à température ambiante pendant 2 h ou à 4 ° C jusqu’au lendemain.
3. Lavez avec un tampon de blocage 3 fois avec 10 min d’incubation. Ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué Alexa 594 chèvre (1 : 400 dilué dans un tampon de blocage) et incuber les lames à température ambiante pendant 1 h. Puis laver les lames 3 fois avec un tampon de blocage à 10 min d’intervalle.
4. Enfin laver la lame une fois avec du PBS pour enlever les BSA résiduel et sérum de cheval.
5. Ajouter une goutte de milieu de montage antifade avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour monter la diapositive et scellez-la avec lamelle couvre-objet à l’aide de vernis à ongles transparent.

4. confocal imagerie

1. Avec un microscope confocal, définissez la longueur d’onde à 590 – 650 nm pour Alexa 594 et 410 – 520 nm pour DAPI. Sélectionnez le format d’image en 1024 x 1024 et de la ligne moyenne de 8 à acquérir des images à haute résolution.
2. Analyser chaque puits sur la lame de 4 puits sous microscope confocal. Acquisition d’images représentant cellule sous l’objectif X 100, comme illustré dans la Figure 1 et Figure 2.
3. Pour compter un grand nombre de cellules, prendre des photos des champs consécutifs au titre de l’objectif X 40.
   Remarque : Il faut 5 à 10 images d’accumuler plus de 200 cellules infectées de chaque instant de chaque infection.
4. Pour chaque expérience, prendre des photos avec des paramètres constants confocal pour tous les échantillons doivent être comparés.

5. analyse nucléaire vs cytoplasmique Distribution

1. Ouvrir un projet avec le logiciel d’application confocale. Sélectionnez une image dont les cellules ont besoin être compilées pour nucléaire vs cytoplasmique distribution de ICP0.
2. Cliquez sur l’onglet « Quantité » du menu principal et sélectionnez « trier les ROIs » dans le menu outils.
3. Tracer une ligne longitudinale dans l’ensemble de la cellule à analyser en sélectionnant « Draw line » du menu principal.
   Remarque : Histogramme s’affiche indiquant l’intensité de fluorescence le long de la ligne pour les ICP0 et DAPI. Dans l’histogramme, la ligne bleue représente les pixels DAPI et marque la limite du noyau, alors que la ligne rouge représente ICP0 pixels.
4. Basé sur la coloration de fond, mis en place un seuil constant pour l’intensité de ICP0 analyser la distribution subcellulaire ICP0 dans chaque expérience.
   1. Tel qu’illustré dans Figure 2, si le rouge signal en moyenne est inférieure au seuil de la région nucléaire mais est supérieur au seuil au-delà de la frontière bleue, classer le signal rouge comme principalement situé dans le cytoplasme.
   2. Si le signal rouge est supérieur au seuil dans tout le noyau et au-delà de la limite du signal bleu, groupe le signal rouge comme noyau plus localisation cytoplasmique.
   3. Si le signal rouge est au-dessus du seuil dans le noyau mais en moyenne est inférieure à elle en dehors de la limite du signal bleu, groupe le signal rouge comme localisation nucléaire.
5. Totaliser plus de 200 cellules infectées chaque échantillon au moment de l’infection par différentes et parcelle en graphique à barres pour illustrer le mouvement de ICP0 fonction de l’heure (Figure 3).

Résultats

Pour comprendre les bases moléculaires et les fonctions biologiques de la ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1, nous utilisons une méthode de microscopie par immunofluorescence pour analyser ICP0 distribution subcellulaire lors des phases d’infection différents. La figure 1 montre les cellules représentant avec distinctif ICP0 localisation en cours de l’infection. Afin de quantifier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de ICP0, nous analysons l...

Discussion

Ce protocole a été utilisé pour étudier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de HSV-1 ICP0. ICP0 subit le trafic sous-cellulaire au cours de l’infection par HSV-1 (Figure 1). Sans doute, ICP0 interagit avec différentes voies cellulaires à des fonctions différentes à différents endroits. Cette mesure ICP0 affiner ses multiples fonctions dans le bras de fer avec l’hôte humain¹³. Cependant, comment ICP0 coordonne les multiples fonctions d’une manière spatio-tempore...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cells and virus
Embryonic Lung Fibroblasts (HEL Cells)	Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)		Des cellules HEL ont été cultivées dans du DMEM complété par 10 % de
stock viral FBS HSV-1 (souche F)	Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)	Invitrogen	; 11965-092
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma	F0926-500ml
Medium-199 (10x)	Gibco	11825-015
Reagents
4- well 11 mm Lame décalée	Cel-Line/Thermofisher Scientific	; 30-149H-BLACK
Solution de paraformaldéhyde à 16 % (p/v) Sans méthanol	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Réactifs Fisher	BP151-1C0
Abumine sérique bovine (BSA)	Calbiochem	CAS 9048-46-8
Sérum de cheval	Sigma	H1270
Saline tamponnée au phosphate (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4)	Dr. Haidong Gu lab
NaCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Bioréactif	BP358-212
KH2PO4  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Bioréactif	BP362-500
KCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Scientific  ;	BP366-500
Na2HPO4  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Bioreagent	BP332-500
Tampon bloquant (PBS avec 1 % BSA et 5 % sérum de cheval )	Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anticorps anti-ICP0	Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Souris monoclonale IgG	santa Cruz Biotechnology	SC-966
Alexa Fluor 594-chèvre anti-lapin IgG	invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488-chèvre anti-souris	IgG invitrogen	A11001
Vectashield Médium de montage avec DAPI	Vector laboratories	H-1200
Pipette Pasteur	Fisher Brand	13-678-20D
Vernis à ongles	Sally Hansen
Equipment
Microscope	confocalLeica SP8
Logiciel confocal	Leica LAS X Suite
Logiciel Excel	Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2	incubateur Thermo Scientific	Code de commande 51026282