Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence

Résumé

ICP0 subit une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. On ne connaît pas le mécanisme moléculaire de cet événement. Nous décrivons ici l’utilisation du microscope confocal comme un outil permettant de quantifier le mouvement ICP0 dans l’infection HSV-1, qui jette les bases pour l’analyse quantitative ICP0 translocation dans de futures études mécanistes.

Résumé

Cellule infectée protéine 0 (ICP0) de l’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) est une protéine début immédiate contenant une anneau de type E3 ubiquitine ligase. Il est responsable de la dégradation de proteasome des facteurs restrictifs de l’hôte et l’activation des gènes viraux ultérieures. ICP0 contient une séquence de localisation nucléaire canonique (NLS). Il pénètre dans le noyau immédiatement après la synthèse de novo et exécute ses fonctions de défense de l’hôte contre principalement dans le noyau. Cependant, plus tard dans l’infection, ICP0 se trouve exclusivement dans le cytoplasme, ce qui suggère la présence d’une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. Sans doute ICP0 translocation permet ICP0 de moduler ses fonctions selon ses emplacements sous-cellulaires lors des phases d’infection différents. Afin de délimiter la fonction biologique et le mécanisme de régulation de la translocation nucléaire-à-cytoplasmique ICP0, nous avons modifié une méthode de microscopie par immunofluorescence pour surveiller ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1. Ce protocole consiste immunofluorescence, microscope confocal imagerie nucléaire vs distribution cytoplasmique analyse et. Le but du présent protocole est d’adapter les images confocales état stationnaire, pris dans une évolution temporelle dans une documentation quantitative du mouvement ICP0 tout au long de l’infection lytique. Nous proposons que cette méthode peut être généralisée pour analyser quantitativement nucléaire vs localisation cytoplasmique d’autres protéines virales ou cellulaires sans faire appel à une technologie d’imagerie live.

Introduction

L’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) provoque un large éventail de légère à sévères maladies herpétiques, y compris l’herpès labial, l’herpès génital, kératite stromale et l’encéphalite. Une fois infecté, le virus crée une vie latente dans les neurones des ganglions. Parfois, le virus peut être réactivé par différentes raisons telles que la fièvre, le stress et immunodépression¹, conduisant à l’infection par l’herpès récurrent. Protéine de la cellule infectée 0 (ICP0) est un important régulateur viral crucial pour les lytique et latente infection HSV-1. Il transactive virus en aval gènes via contrecarrer l’hôte des défenses antivirale....

Protocole

1. cellule ensemencement et infection par le Virus

1. 20 – 24 h avant l’infection par le virus, des graines de 5 x 10⁴ cellules fibroblastes pulmonaires embryonnaires humaines (HEL) ou d’autres cellules pour être examiné sur une lame de 4 puits 11 mm décalées dans le milieu de croissance (de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % fœtale bovine sérum (FBS)). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
   NOTE : Chaque bien doit avoir confluence de cellules de 70 à 80 % au moment de l’infection.
2. Le lendemain, retirer le milieu de croissance et infectent les cellules avec les virus en milieu-199 à ....

Résultats

Pour comprendre les bases moléculaires et les fonctions biologiques de la ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1, nous utilisons une méthode de microscopie par immunofluorescence pour analyser ICP0 distribution subcellulaire lors des phases d’infection différents. La figure 1 montre les cellules représentant avec distinctif ICP0 localisation en cours de l’infection. Afin de quantifier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de ICP0, nous analysons l.......

Discussion

Ce protocole a été utilisé pour étudier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de HSV-1 ICP0. ICP0 subit le trafic sous-cellulaire au cours de l’infection par HSV-1 (Figure 1). Sans doute, ICP0 interagit avec différentes voies cellulaires à des fonctions différentes à différents endroits. Cette mesure ICP0 affiner ses multiples fonctions dans le bras de fer avec l’hôte humain¹³. Cependant, comment ICP0 coordonne les multiples fonctions d’une manière spatio-tempore.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cells and virus
Embryonic Lung Fibroblasts (HEL Cells)	Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)		Des cellules HEL ont été cultivées dans du DMEM complété par 10 % de
stock viral FBS HSV-1 (souche F)	Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)	Invitrogen	; 11965-092
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma	F0926-500ml
Medium-199 (10x)	Gibco	11825-015
Reagents
4- well 11 mm Lame décalée	Cel-Line/Thermofisher Scientific	; 30-149H-BLACK
Solution de paraformaldéhyde à 16 % (p/v) Sans méthanol	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Réactifs Fisher	BP151-1C0
Abumine sérique bovine (BSA)	Calbiochem	CAS 9048-46-8
Sérum de cheval	Sigma	H1270
Saline tamponnée au phosphate (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4)	Dr. Haidong Gu lab
NaCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Bioréactif	BP358-212
KH2PO4  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Bioréactif	BP362-500
KCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Scientific  ;	BP366-500
Na2HPO4  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	Fisher Bioreagent	BP332-500
Tampon bloquant (PBS avec 1 % BSA et 5 % sérum de cheval )	Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anticorps anti-ICP0	Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Souris monoclonale IgG	santa Cruz Biotechnology	SC-966
Alexa Fluor 594-chèvre anti-lapin IgG	invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488-chèvre anti-souris	IgG invitrogen	A11001
Vectashield Médium de montage avec DAPI	Vector laboratories	H-1200
Pipette Pasteur	Fisher Brand	13-678-20D
Vernis à ongles	Sally Hansen
Equipment
Microscope	confocalLeica SP8
Logiciel confocal	Leica LAS X Suite
Logiciel Excel	Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2	incubateur Thermo Scientific	Code de commande 51026282

Human d’applications