Visualisation de la Migration cellulaire tangentielle dans le Tectum optique de poussin en développement

Summary

Nous décrivons les méthodes de marquage fluorescent tangentiellement liés à la migration des cellules par électroporation et pour l’imagerie Time-lapse du mouvement cellulaire étiquetées dans une culture de montage plat afin de visualiser la migration cellulaire comportement dans le tectum optique de poussin en développement .

Abstract

Time-lapse imagerie est une méthode puissante pour analyser le comportement de cellules migratrices. Après cellule fluorescente d’étiquetage, le mouvement des cellules marquées en culture peut être enregistré sous microscopie vidéo. Pour l’analyse de la migration cellulaire dans le développement du cerveau, tranche la culture est couramment utilisée pour observer la migration cellulaire parallèle à la section de la tranche, comme la migration de cellules radiales. Cependant, peu d’informations peut être obtenue de la méthode de culture de tranche pour analyser la migration cellulaire perpendiculaire à la section de la tranche, notamment la migration cellulaire tangentielle. Nous présentons ici les protocoles d’imagerie de Time-lapse afin de visualiser la migration tangentielle cellulaire dans le tectum optique de poussin en voie de développement. Une combinaison de cellules étiquetant par électroporation in ovo et une culture de plat-montage ultérieure sur l’insert de culture cellulaire permet une détection des mouvements de cellules migratrices dans le plan horizontal. De plus, notre méthode facilitant la détection de comportement de la cellule individuelle et l’action collective d’un groupe de cellules à long terme. Cette méthode peut potentiellement être appliquée pour détecter la modification séquentielle de la fluorescent-étiquetées microstructure, y compris l’allongement axonale dans le déplacement de tissu ou de cellules neural dans le tissu non neural.

Introduction

L’étude de la migration cellulaire progresse avec la technique avancée d’imagerie live. Après cellule fluorescente d’étiquetage, le mouvement temporel de cellules marquées dans une boîte de Petri ou in vivo peut être enregistré sous microscopie vidéo. Dans l’étude du développement neuronal, les modifications morphologiques de la migration des cellules ou allongeant des axones ont été analysées à l’aide de l’imagerie Time-lapse. Pour l’imagerie efficace, il est essentiel d’appliquer une méthode appropriée pour la préparation d’étiquetage et de tissu cellulaire fluorescent, fondée sur le but de l’expérience et l’analyse. Pour l’analyse de la migration cellulair....

Protocol

1. Électroporation In Ovo

1. Préparer l’ADN de plasmide expression pour marquage fluorescent à haute concentration. Isoler l’ADN de 200 mL de culture bactérienne par la méthode de lyse alcaline à l’aide de colonnes échangeuses d’anions selon le protocole du fabricant (Table des matières). Mix pCAGGS-EGFP et pCAGGS-mCherryNuc à une concentration finale de 4 µg/µL de chaque.
   NOTE : Purification d’ADN plasmidique exempte d’endotoxine peut être préférable pour l’électroporation.
2. Incuber des oeufs de poulet fertile horizontalement à 38 ° C, humidité relative de 70 %.
3. Après 2,5 jours, éliminer 5 mL d’albumine (blanc d’....

Results

La figure 2 montre la migration tangentielle superficielle visualisée dans une culture de plat-Mont à un temps écoulé (0, 9, 18, 27 h) après le début de l’enregistrement. Film 1 est un film Time-lapse des intervalles de 10 min sur une période de 28 h et 50 min. Le cadre est sélectionné pour se concentrer sur les cellules migratrices du coin en bas à gauche marqué de la trame à l’espace sans étiquette (Fig.......

Discussion

Le protocole décrit ci-dessus est optimisé pour la détection de la migration cellulaire dans les couches superficielles^6,8. Elle est applicable pour la détection de couche intermédiaire migration flux (film 5)^6,7, juste en déplaçant le timing de l’électroporation (E5.5 à E4.5) et l’apparition de la culture et en imagerie (E7.0 à E6.0).

La proc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	kit de purification de l’ADN plasmidique sans endotoxines
Seringue de 20 ml	TERUMO	SS-20ESZ
Aiguille de calibre 18	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x pénicilline et streptomycine	Gibco	15140-122
tube capillaire en verre	Narishige	G-1
insert de culture cellulaire	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	revêtement de l’insert de culture
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	revêtement de l’insert de culture
plat à fond en verre	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	milieu de culture
F12	Gibco	11765-054	milieu de culture
sérum fœtal bovin	Gibco	12483	milieu de culture
sérum de poussin	Gibco	16110082	milieu de culture
10xHBSS	Gibco	14065-056
couteau microchirurgical	Coopération en spécialités chirurgicales	72-1501
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>Equipment
curved ciseaux	AS ONE	No.11
Processeur de micropipettes	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
BEX	LF646P3x3
Générateur d’impulsions	Électroportateur	CUY21EX BEX
Microscope stéréoscopique à fluorescence	Leica	MZ16F
Contrôleur
	Régulateur	de température Tokken MIGM/OL-2
Unité confocale laser