Nous présentons par la présente un protocole pour mesurer au chevet de l'activité endotoxine des échantillons de sang entiers humains. L'analyse d'activité d'endotoxine est un essai simple à exécuter et peut être un biomarqueur utile dans les patients gravement malades présentant le sepsis.
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Article de méthode
Test d'activité d'endotoxine pour la détection de l'endotoxémie de sang entier dans les patients gravement malades
Dans cet article
Résumé
Résumé
Lipopolysaccharide, également connu sous le nom d'endotoxine, est un composant fondamental des bactéries gram-négatives et joue un rôle crucial dans le développement de la septicémie et le choc septique. L'identification précoce d'un processus infectieux qui évolue rapidement vers une maladie grave pourrait entraîner un traitement plus rapide et plus intensif, ce qui pourrait mener à de meilleurs résultats pour les patients. L'analyse de l'activité d'endotoxine (EA) peut être utilisée au chevet comme biomarqueur fiable de l'endotoxémie systémique. La détection des niveaux élevés d'activité d'endotoxine a été à plusieurs reprises montrée pour être associée à une sévérité accrue de la maladie dans les patients présentant le sepsis et le choc septique. L'astodonte est rapide et facile à réaliser. En bref, après l'échantillonnage, un aliquot de sang entier est mélangé avec un anticorps anti-endotoxine et avec ajouté LPS. L'activité d'endotoxine est mesurée comme l'éclatement oxydant relatif des neutrophiles apprêtés tel qu'détecté par chemioluminescence. La production de l'assay est exprimée sur une échelle de 0 (absent) à 1 (maximum) et classée comme « faible » (0,4 unité), « intermédiaire » (0,4 à 0,59 unité) ou « élevée » (0,6 unité). La méthodologie détaillée et la justification de la mise en œuvre de l'analyse de l'EE sont indiquées dans ce manuscrit.
Introduction
Le Lipopolysaccharide (LPS), également connu sous le nom d'endotoxine, est un composant clé de la structure membranaire des bactéries Gram-negative (GN). Il représente environ 10% de la paroi cellulaire, étant vital pour l'intégrité de la membrane externe et l'homéostasie. En outre, il est un activateur puissant du système immunitaire inné hôte1,2.
L'exposition in vitro des cellules innées du système immunitaire au LPS entraîne des changements dans l'expression de plusieurs gènes3. L'administration de très petites quantités de LPS chez des volontaires humains en bonne santé déclenche la cascade d'inflammation systémique aigue, tandis que la septicémie et le choc septique peuvent survenir avec des concentrations plus élevées d'endotoxine4,5.
La septicémie est une affection potentiellement mortelle qui, si elle n'est pas rapidement reconnue, peut entraîner une défaillance et la mort de plusieurs organes. Les patients septiques doivent être traités en temps opportun, avec la réanimation agressive, la thérapie antibiotique proportionnelle, le contrôle optimal de source, et les stratégies promptes de soutien d'organe. Le diagnostic de l'étiologie de la septicémie est principalement basé sur la reconnaissance clinique et la détection d'agents pathogènes basée sur la culture6. Cependant, les résultats des cultures microbiennes peuvent prendre jusqu'à 48 h et ne sont pas concluants dans jusqu'à 30% des cas7. L'identification et l'intervention précoces peuvent mener à de meilleurs résultats pour les patients. Chez les patients chez qui la septicémie est soupçonnée, les décisions sont souvent prises sur la base de paramètres physiologiques et biochimiques, sans un signe clair d'endotoxémie.
La mesure de l'activité d'endotoxine (EA) peut être obtenue au moyen d'un test commercial (voir Tableau des matériaux) dans le sang entier. Il peut être employé comme biomarqueur de l'endotoxémie systémique pour la stratification tôtde la sévérité de la maladie, particulièrement dans les patients à risque pour développer le choc septique 8. L'essai a été employé pour guider la thérapie d'hémoperfusion de Polymyxin B dans unessai clinique randomisé randomisé-commandé récemment édité dans les patients présentant le choc septique 9. Chez les patients gravement malades, l'étude MEDIC a montré que les niveaux accrus d'EE étaient associés à un dysfonctionnement multiple des organes, à la durée du séjour de l'unité de soins intensifs (USI) et à la mortalité10.
Différents essais ont été développés pour détecter l'endotoxine. L'essai de Lysate d'amoebocyte de Limulus (LAL), sous forme de gel-caillot, de test turbidimétrique ou chromogénique, a été jusqu'ici le plus fréquemment adopté pour l'estimation de l'endotoxine de sérum. Il est basé sur la capacité de l'endotoxine à induire la coagulation de l'hémolymphe du crabe fer à cheval, Limulus polyphémus. Cependant, cet examen a quelques limites en termes de spécificité. En particulier, il peut également être activé par des produits microbiens autres que l'endotoxine, tels que les composants de la paroi cellulaire fongique, et il peut être inhibé par diverses protéines plasmatiques humaines11.
Au cours de la dernière décennie, la mesure de l'EE a été développée et validée comme biomarqueur de l'endotoxémie circulante. Par rapport au test LAL, eA est plus rapide et plus facile à mettre en œuvre en milieu clinique. En outre, il s'est avéré plus précis que la LAL dans le sang entier, avec une sensibilité et une spécificité accrues, à la fois in vitro et in vivo12.
En dépit de sa mise en œuvre initiale comme outil de diagnostic précoce pour l'identification rapide des bactéries GN comme agents causatifs de sepsis, le niveau d'EE a également été étudié comme biomarqueur de la sévérité de la maladie. Dans ce contexte, il s'est avéré particulièrement utile d'évaluer l'état d'hypoperfusion dû à une maladie critique en cours, comme un choc septique ou un syndrome d'arrêt post-cardiaque13. Plus récemment, depuis le développement de systèmes d'hémopurification, un résultat positif de l'EE a également été proposé comme outil de dépistage pour identifier avec précision les candidats potentiels pour une telle thérapie14. Nous avons récemment mené une étude rétrospective observationnelle sur la prédominance et l'importance clinique des niveaux élevés tôt d'EE dans 107 patients présentant le choc septique. Conformément à d'autres résultats récents, nous avons constaté que l'EE est un marqueur prometteur de la sévérité de la maladie chez les patients présentant le choc septique15.
Le but du présent manuscrit est de décrire la méthode pour effectuer l'analyse de l'EE, soit au chevet du patient ou en laboratoire, et de décrire son utilisation potentielle dans un scénario représentatif de choc septique. Cette technique peut détecter l'activité de LPS en mesurant l'éclatement oxydant amélioré dans les neutrophiles suivant leur amorçage par des complexes d'un anticorps anti-endotoxine et de LPS. L'augmentation de l'éclatement respiratoire est détectée par un chemiluminomètre et la quantité de lumière émise est considérée comme proportionnelle à la quantité d'endotoxine dans l'échantillon de sang. L'analyse nécessite peu de réactifs, prend environ 30 minutes à effectuer et utilise aussi peu que 40 L de sang entier12.
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Protocole
Le protocole est réalisé selon les directives institutionnelles relatives à la manipulation des biospécimens humains et suivant les procédures opérationnelles standard actuelles de notre laboratoire clinique. L'utilisation des données d'évaluation de l'évaluation du travail et de l'information clinique sur les patients testés suit les lignes directrices du comité d'éthique de la recherche humaine de notre établissement.
1. Matériel de laboratoire et contenu de kit d'essais
- Conservez le kit EA à 2'8 oC lorsqu'il n'est pas utilisé.
-
Chaque test d'EA se compose de 5 différents types de tubes; utiliser chacun d'eux pour une partie différente du test (voir la section 2).
- Utilisez le tube #1 (le tube « Control ») pour mesurer l'activité basale de l'éclatement oxydatif non spécifique des neutrophiles du patient en l'absence d'un anticorps spécifique.
- Utilisez #2 de tube (le tube « échantillon ») pour mesurer l'éclatement oxydant en réponse au complexe lPS-anticorps.
- Utilisez le tube #3 (le tube " Max ") pour mesurer l'éclatement oxydatif maximal des neutrophiles du patient en réponse à un excès d'endotoxine.
- Utilisez le tube #4 (le tube « LPS ») comme source d'endotoxine exogène.
- Utilisez le tube #5 (tube Aliquot) pour le stockage du sang.
REMARQUE: Des doublons de tubes #1, #2 et #3 sont fournis pour un total de 8 tubes à utiliser pour chaque échantillon de sang testé (la bouteille de réactif EA et le test de contrôle de la qualité peuvent être utilisés pour tous les tests contenus dans une poche).
- Recueillir des échantillons de sang de patients dans des tubes stériles contenant de l'anticoagulant EDTA. Conservez les échantillons de sang à température ambiante avant d'exécuter le test d'eE.
- Avant de commencer le test, allumez le chemiluminomètre et le shaker de l'incubateur. Réchauffer l'incubateur à la température de 37 oC.
- Idéalement, commencer à traiter l'échantillon dans les 30 minutes de la collecte de sang.
2. Exemple d'activité d'endotoxine
- Préparez les tubes à essai EA pour l'échantillon de sang de chaque patient que vous devez tester. Mettre les tubes dans des grilles à tubes. Retirez ensuite les bouchons.
- À l'aide d'une combipipette, pipette un volume de 1 ml du réactif EA de la bouteille dans des tubes #1 (tube de contrôle), #2 (tube d'échantillon) et #3 (tube Max), chacun en double.
REMARQUE: Pipette sur le côté du tube pour éviter la solution éclaboussures de retour. - Mélanger l'échantillon de sang du patient en inversant doucement le tube de collecte de sang pendant 20 fois. Ensuite, pipette 0,5 ml de sang patient dans le tube #4 (tube LPS max) et le tube #5 (tube Aliquot). Tube de vortex #4 pour 10 s.
- Placez les grilles de tube avec tous les tubes à essai EA dans le shaker de l'incubateur. Fermer le couvercle et couver pendant 10 min à la température de 37oC.
- Ouvrez le couvercle et retirez les grilles de tube du shaker de l'incubateur. #5 de tube de Vortex (tube d'Aliquot). À l'aide d'une pointe stérile, pipette 40 l de sang dans des tubes #1 et #2, en double.
- #4 de tube de Vortex (tube de LPS). En utilisant la même pointe de pipette, pipette 40 'L de sang de #4 tube dans le tube #3 (tube Max), en double.
- Vortex les six tubes à essai finals (#1, #2, #3 et les doublons respectifs), puis les remettre dans leurs racks.
REMARQUE: Assurez-vous que tous les tubes sont vortexés pendant la même quantité de temps. - Remettez les grilles tubulaires dans le shaker d'incubation et fermez le couvercle. Placez le shaker à 100 tr/min, puis commencez le mouvement pendant 14 min.
- Insérez la carte à puce étiquetée EA dans le chemiluminometer et appuyez sur le démarrage. Après l'incubation de 14 min, suivez les instructions affichées sur le chemiluminomètre pour lire les tubes EA dans le bon ordre.
- Vortex doucement chaque tube pendant 10 s avant de le placer sur le porte-échantillon du chemiluminomètre. Ouvrez le tiroir de l'échantillon et placez le tube #1 dans le support de l'échantillon. Ensuite, fermez le tiroir de l'échantillon et attendez la lecture de l'unité de lumière relative (RLU).
- Répétez l'étape 2.10 pour le tube 2 et le tube 3.
- Répétez l'étape 2.10 pour les tubes en double 1, 2 et 3.
REMARQUE: Essayez de vortex tous les tubes pour la même quantité de temps pendant les étapes 2.10-2.12. - Une fois que tous les tubes ont été traités, notez que les résultats de l'EA seront calculés et imprimés automatiquement. Les niveaux sont exprimés en tant qu'unités d'EE et représentent la moyenne des déterminations en double à partir des mêmes échantillons.
- Répétez les étapes 2.2 à 2.13 pour chaque échantillon de sang qui doit être testé.
- Une fois l'essai terminé, entreposez les tubes à essai restants et les réactifs EA à 2 à 8 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à 30 jours.
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Résultats
Un homme de 72 ans a été admis au service des urgences (ED) d'un hôpital urbain universitaire. Quelques jours plus tôt, il s'était présenté à son médecin de soins primaires se plaignant de brûlure à la miction. Une thérapie de court-cours avec la phosphomycine orale a été recommandée. Ses antécédents médicaux ont inclus l'hypertension, le diabète simple de type-2 et l'hyperplasie prostatique bénigne. Ses médicaments comprenaient l'enalapril, l'atorvastatine, la tamsulosine et la metformin...
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Discussion
Le choc septique est encore aujourd'hui associé à une mortalité aussi élevée que 40%, bien que ce taux varie selon les rapports considérés16. La plupart des experts dans le domaine préconisent la nécessité de nouveaux biomarqueurs et de meilleurs biomarqueurs afin d'aiderles cliniciens à établir un diagnostic précoce, à mieux prendre en charge et à pronostiquer les patients atteints d'un choc septique 6.
L'exécution d'un test d'eE ne nécessite pa...
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Déclarations de divulgation
Estor SpA a couvert le coût de la publication de la revue et des frais de production vidéo. Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Paolo Braganet Lisa Mathiasen, Ph.D., pour leur examen de la méthodologie du protocole d'analyse. Dario Winterton, MD a fourni une aide substantielle pour examiner le manuscrit pour la maîtrise de la langue anglaise.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kit EAA | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package avec 20 tests + 1 contrôle qualité |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminomètre |
| Agitateur d’incubateur | GRANT | ES-20 | Mini-incubateur |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Instrument Vortex |
Références
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Réimpressions et autorisations
