Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’intégrité de barrière de sang-testicule en injectant d’inuline-FITC dans les testicules. Il s’agit d’une méthode efficace in vivo pour étudier l’intégrité de barrière de sang-testicule qui peut être compromise par des éléments génétiques et environnementaux.
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Article de méthode
Une méthode In Vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La spermatogenèse est le développement de spermatogonies en spermatozoïdes matures dans les tubules séminifères des testicules. Ce processus est soutenu par des jonctions de cellules de Sertoli à la barrière sang-testicule (BTB), qui est la barrière de tissu plus serrée dans l’organisme chez les mammifères et sépare l’épithélium séminifère en deux compartiments, une base et un adluminales. BTB crée un micro-environnement unique pour les cellules germinales de la méiose I / II et pour le développement de post-méiotique spermatides en spermatozoïdes par l’intermédiaire de la spermiogenèse. Nous décrivons ici une méthode fiable pour surveiller l’intégrité BTB de souris testicule in vivo. Un BTB intact bloque la diffusion d’inuline conjugué FITC de la basale au compartiment apical des tubes séminifères. Cette technique est adaptée pour l’étude des candidats de gène, de virus ou des substances toxiques environnementales qui peuvent affecter la fonction BTB ou intégrité, avec une procédure simple et une exigence minimale de compétences chirurgicales par rapport à d’autres méthodes.
Introduction
La spermatogénèse chez les mammifères est considéré comme un processus hautement structuré qui englobe les spermatogonies autorenouvellement et différenciation par le biais de spermatocytes en spermatozoïdes haploïdes par mitose et méiose spermiogenèse, au cours de laquelle dramatique modifications morphologiques et biochimiques se produisent. Développement des cellules germinales sont progressivement transportés de la base de la tube séminifère vers la lumière. Ce processus est réglé par contacts cellules entre les cellules germinales et les cellules de Sertoli1,2. Les cellules de Sertoli adjacentes forment le BTB qui se trouve près de la base du tube séminifère. BTB divise physiquement l’épithélium en une basale et un compartiment adluminales. Stades VIII - IX du cycle épithélial, preleptotene/leptotène spermatocytes des compartiments basales qui traversent le BTB, entrant dans les compartiments d’adluminales3. Par conséquent, la fonction de BTB est de fournir un microenvironnement immunoprivileged pour l’achèvement de la méiose et la spermiogenèse4,5,6. Contrairement à d’autres obstacles de la sang-tissus (p. ex., barrière hémato - encéphalique) qui sont composées uniquement de jonctions serrées (TJs), le BTB est formé par quatre jonctions différentes (TJs, spécialisations ectoplasmique, jonctions lacunaires et intermédiaire axée sur le filament desmosomes) entre Sertoli, cellules de1,7.
De nombreuses études ont utilisé des souris génétiquement modifiées, infections virales et substances toxiques environnementales pour étudier les mécanismes de BTB intégrité7,8,9. La perturbation de BTB induit une déficience de la spermatogenèse et hypofertilité ou d’infertilité. Depuis la formation de BTB et l’intégrité ont été confirmés d’être affectés par des contacts entre les cellules de Sertoli8, un modèle in vitro basé sur des cultures primaires de cellules de Sertoli isolées a été utilisé pour l’étude BTB. Toutefois, ce modèle ne peut pas imiter avec précision BTB dynamics in vivo. En outre, aucune telle co-culture de cellules germinales avec les cellules de Sertoli n’a été établie comme capables de refléter tous les éléments pertinents de structurelles et fonctionnelles du BTB10,11.
En général, en vivo BTB intégrité tests reposent généralement sur petites molécules, telles que EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine et inuline conjugué FITC (inuline-FITC). Normalement, la diffusion de la biotine ou inuline-FITC du compartiment basal est bloquée par la structure de BTB. Par conséquent, nous sommes en mesure d’utiliser cette méthode pour évaluer l’étendue des dégâts BTB comparée aux groupes témoins. BTB peut être compromise avec certains types de stimulations, telles que le traitement avec cadmium chlorure (CdCl2)12, BTB devient accessible aux petites molécules, qui finit par pénétrer dans le compartiment d’adluminales comme indicateurs.
Un début essai in vivo BTB intégrité avec consiste à injecter de la biotine ou inuline-FITC dans la veine jugulaire, qui implique une chirurgie et est envahissante, compliqué et chronophage. En outre, comme les substances journaliste diffusent à travers tout le corps par l’intermédiaire de la circulation, la concentration locale de biotine ou inuline-FITC dans les tubules séminifères est limitée. En outre, l’exposition systémique peut induire des réactions immunitaires. Nous présentons ici un simple et efficace essai in vivo BTB intégrité avec permettant une injection directe d’une petite aliquote d’inuline-FITC dans l’interstitium d’un testicule. En utilisant la fluorescence méthode d’étiquetage, le processus de coloration est commode, comme anticorps secondaires ne sont pas nécessaires. Ici, le processus de colorant fluorescent entrant dans le testicule est visualisé.
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Protocole
Toutes les expériences animales effectuées ont été approuvés par le Comité de l’Université médicale de Nanjing. Les souris C57BL/6 mâles ont été détenus dans des conditions contrôlées de photopériode et étaient approvisionnées en nourriture et en eau.
1. les préparatifs
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Capillaires de microinjection
- Utilisez les capillaires microinjection avec un diamètre extérieur et intérieur dimeter longueur de 1,0 mm, 0,8 mm et 10,0 cm, respectivement.
- Tirez des capillaires en verre avec un extracteur capillaire (Figure 1 a). Tester et ajuster les paramètres selon la machine extracteur capillaire qui est utilisé.
- Briser les pointes de pipette avec une pince à utiliser pour obtenir des capillaires d’un diamètre de 50 µm à la pointe.
Remarque : Les conseils peuvent être trop longues à pénétrer dans le testicule. - Aiguiser la pointe dans un angle de 30° à l’aide d’un chaflanador d’une micropipette (Figure 1).
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Réactifs
- Préparer 1 % pentobarbital sodique : dissoudre pentobarbital sodique 100 mg dans 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (étape 2.3.3).
- Préparer 10 mg/mL d’inuline-FITC : dissoudre inuline-FITC 1 mg dans 100 μl de PBS (étape 2.1.6).
- Préparer 4 % paraformaldéhyde : dissoudre paraformaldéhyde (PFA) 4 g dans 100 mL de PBS (étape 2.3.3).
- Préparer 30 % de saccharose : dissoudre 3 g dans 10 mL de PBS (étape 2.3.4) de sucrose.
- Préparer les 0,1 % de chlorure de cadmium : dissoudre 10 mg dans 10 mL de PBS (étape 2.1.1) de chlorure de cadmium.
2. méthodes
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Préparation de l’anesthésie et presurgery
- Peser les souris mâles C57BL/6 8 semaines et calculer la dose nécessaire de CdCl2. Traiter un groupe de souris (n = 3) avec CdCl2 (5 mg/kg de poids corporel, i.p.) pendant 3 jours avant la chirurgie. Traiter un autre groupe de souris mâles de 8 semaines C57BL/6 (n = 3) avec du PBS comme contrôle.
- Opérer dans des conditions aseptiques à l’aide de pinces, aiguilles, ciseaux et seringue stérile.
- Préparer la solution d’anesthésie fraîchement. La dose nécessaire de l’anesthésie est de 70 mg de pentobarbital sodique/kg de poids corporel. En moyenne, une souris C57BL/6 adulte à l’âge de 8 semaines pèse environ 25 g, ce qui correspond à 175 μL de 1 % pentobarbital sodique (1,75 mg / souris).
Remarque : Le pentobarbital sodique est dissous dans stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La solution est filtrée par 0.22 um unité de filtration avant d’être utilisé. - Nettoyez la zone pour la chirurgie avec 75 % d’éthanol et couvre la zone avec une serviette de tissu propre.
- Allumez le chauffage thermostatique et ajuster la température à 37 ° C.
- Préparer la solution de travail inuline-FITC (10 mg/mL) le jour de la chirurgie.
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Intervention chirurgicale
- Peser les souris mâles C57BL/6 8 semaines et calculer la dose nécessaire de l’anesthésie.
- Effectuer une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à l’aide de la seringue stérile 1 mL. Maintenez la souris dans une cage propre.
- Observer la réponse réflexe œil et la respiration de la souris pour confirmer qu’il est sous anesthésie complète.
Remarque : Généralement, 10-15 min sont nécessaires jusqu'à ce que la souris est profondément anesthésiée, avec une absence totale de réponse de pincement orteil et l’entretien de la respiration lente et régulière. - Déplacez la souris vers la zone d’opération et couvrir sa zone de le œil avec un papier de soie humide pour éviter la sécheresse pendant l’anesthésie (Figure 2 a).
- Ses cheveux abdominaux vous raser avec un rasoir et désinfecter la zone de chirurgie avec 75 % d’éthanol.
- Avec des ciseaux pointus, faire une incision de 1 cm de peau au-dessus les glandes préputiales pour exposer la paroi abdominale. Soulevez la paroi abdominale à l’aide de petites pinces et pratiquer une incision de 0,5 cm pour exposer la cavité péritonéale (Figure 2 b).
- Utiliser les pinces pour rechercher des coussinets adipeux autour de l’épididyme et les testicules. Retirez soigneusement les coussinets adipeux pour exposer les testicules attachées clairement (Figure 2 et 2D). Ordinairement, pour effet sur un testicule à la fois.
Remarque : Ne pas toucher les coussinets adipeux et les testicules avec les mains. - Placer un papier (9 cm de diamètre) sous les coussinets adipeux et les testicules (Figure 2).
- Injecter une pipette de micro-injection d’inuline-FITC et connectez-le à l’unité micromanipulateur (Figure 1). Doucement, insérer la pipette de micro-injection sous l’albuginée et charger un total de 20 μL d’inuline-FITC dans l’interstitium du testicule (Figure 2E et 2F).
NOTE : Enfoncer soigneusement la pipette de micro-injection pour éviter de le déplacer. - Surveiller les mouvements de l’inuline-FITC dans le testicule (Figure 2).
- Immédiatement remettre les testicules dans la cavité abdominale après l’achèvement de l’injection.
- Répétez la procédure sur le testicule controlatéral. Ce testicule est injecté avec 20 μl de PBS comme un contrôle.
- Fermer la peau avec une suture chirurgicale et déplacez la souris à un pad thermique d’un radiateur thermostatique (Figure 1 b). Administrer une dose de 1 mg d’analgésiques (buprénorphine) par 1 kg de poids corporel par injection sous-cutanée.
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Récolte les testicules et la préparation des coupes congelées
- 40 min après l’injection, euthanasier la souris bénéficiaire par dislocation cervicale selon les soins aux animaux et l’utilisation des lignes directrices.
- Utiliser une paire de ciseaux pointus pour recueillir les testicules. Placez les testicules dans 1 mL de PBS glacée pour éliminer toute contamination du sang.
- Difficulté les testicules à la paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 ° C pendant 12 à 24 h. jeter les 4 % PFA et laver le tissu 3 x 1,5 ml de PBS 1 % à la température ambiante.
- Déshydrater le tissu en saccharose 30 % du jour au lendemain. Mettre les testicules dans le cadre d’encastrement et couvrir le tissu avec la température de coupe optimale composé (OCT). Après que l’OPO est gelé, remplir le cadre encastrement avec OCT afin que le testicule entier peut être recouvert d’OCT.
- Couper 5-μm d’épaisseur, gelées les sections efficaces des testicules dans un cryostat à-20 ° C et qu’ils adhèrent aux lames de microscope.
Remarque : Regel tissus incorporés dans la glace sèche peut augmenter la rigidité pour la coupe.
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Demande d’image
- Déposer les lames dans une boîte humidifiée. Réchauffer les diapositives à température ambiante pendant 10 min.
- Laver les sections 3 x avec tampon Tris salin (SCT) à température ambiante.
- Sécher à l’air pendant 5 min dans le noir. Essuyez tout TBS résiduelle avec poussière de papier.
- Couvrir les coupes avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Placer la lamelle inversée sur une lame de microscope.
- Acquisition d’images à l’aide d’un microscope confocal. Un total de 20 X grossissement est généralement suffisant pour détecter le signal brillamment fluorescent.
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Résultats
Le montage expérimental pour la réalisation de l’essai d’intégrité BTB est illustré à la Figure 1. Tirez et aiguiser les capillaires de microinjection avec un extracteur capillaire et chaflanador d’une micropipette, respectivement (Figure 1 a et 1C). Le radiateur thermostatique Materiel pour microinjection sont illustrées dans la Figure 1 b et 1D.
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Discussion
La spermatogenèse se déroule dans l’épithélium séminifère et est un processus dynamique et hautement ordonné qui est régi par les cellules germinales et les cellules somatiques (par exemple, les cellules de Sertoli)13. La structure BTB, ce qui est construite par les cellules de Sertoli, divise l’épithélium séminifère en une basale et un compartiment apical. Le développement des cellules germinales méiotiques et haploïdes se produit dans le compartiment apical qui forme une barriè...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le National clé de R & D programme de la Chine (2016YFA0500902), la Fondation National sciences naturelles de Chine (31471228, 31771653), le Jiangsu Science Foundation for Distinguished Young Scholars (BK20150047), sciences naturelles Fondation de la Province du Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) et le programme d’innovation et de la Province du Jiangsu à K.Z.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Extracteur capillaire ; | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution à 1× ; in ddH2O |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Lames de microscope à adhérence | CITOGLAS (Chine) | 80312-3161 | |
| Chlorure de cadmium | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Microscope confocal | Zeiss (Allemagne) | LSM700 | |
| Papier sans poussière | Kimberly-Clark (États-Unis) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (États-Unis) | F3272 | |
| Capillaires de micro-injection | Zhengtianyi (Chine) | BJ-40 | 1,0 mm ; 0,8 mm ; × ; 100 mm |
| Biseauteur de micropipette | NARISHIGE (JAPON) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPON) | 4583 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma (États-Unis) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Allemagne) | P11011 | |
| Rasoir ; | Yashen (Chine) | ||
| Stéréomicroscope | Nikon (JAPON) | SMZ1000 | |
| Saccharose ; | Sangon Biotech (Chine) | A610498 | |
| Instruments chirurgicaux | Stronger (Chine) | ciseaux, pinces, porte-aiguille | |
| Seringue | KDL (Chine) | 20163150518 | 0,45 mm × ; 0,16 mm RW LB |
| chauffage thermostatique | KELL (Nanjing, Chine) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7,6 | |||
| 0,2 M Tris | Sangon Biotech (Chine) | A600194 | |
| 1,37 M Nacl | Sangon Biotech (Chine) | A610476 |
Références
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Réimpressions et autorisations
