Article de méthode

Stimulation transcrânienne courant continu (CDV) chez la souris

DOI :

10.3791/58517

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23 septembre 2018

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1Centro de Tecnologia em Medicina Molecular (CTMM), Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais

Dans cet article

Résumé

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La stimulation transcrânienne courant continu (CDV) est une technique thérapeutique proposée pour traiter les maladies psychiatriques. Un modèle animal est essentiel pour comprendre les altérations biologiques spécifiques évoquées par STD. Ce protocole décrit un modèle de souris de CDV qui utilise une électrode chroniquement implantée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La stimulation transcrânienne courant continu (CDV) est une technique non invasive de neuromodulation proposée comme un traitement alternatif ou complémentaire pour plusieurs maladies neuropsychiatriques. Les effets biologiques des CDV ne sont pas totalement comprises, qui s’explique en partie en raison de la difficulté à obtenir des tissus cérébraux humains. Ce protocole décrit un modèle de souris de CDV qui utilise une électrode chroniquement implantée permettant l’étude des effets biologiques durables de STD. Dans ce modèle expérimental, tDCS modifie l’expression des gènes corticale et offre une contribution importante à la compréhension de la justification de son utilisation thérapeutique.

Introduction

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La Stimulation transcrânienne courant continu (CDV) est une technique non invasive, peu coûteux, thérapeutique, qui met l’accent sur la modulation neuronale par l’utilisation de courant continu de faible intensité1. Il y a actuellement deux configurations (anodiques et cathodiques) pour CDV. Tandis que la stimulation anodique exerce un champ électrique courant trop faible pour déclencher des potentiels d’action, les études électrophysiologiques ont montré que cette méthode produit des changements dans la plasticité synaptique2. Par exemple, les éléments de preuve montrent que tDCS induit des effets de potentialisation (pp) à long terme tels que l’amplitude de crête accrue des potentiels postsynaptiques excitateurs3,4 et la modulation de l’excitabilité corticale5.

À l’inverse, cathodique stimulation induit une inhibition, résultant dans hyperpolarisation de la membrane6. Une hypothèse pour ce mécanisme repose sur les constatations physiologiques où tDCS est décrite pour moduler la fréquence de potentiel d’action et la durée dans le corps neuronaux3. Notamment, cet effet n’évoque pas directement les potentiels d’action, même si elle peut passer le seuil de dépolarisation et faciliter ou entraver neuronale tir7. Ces effets contrastants ont été précédemment démontrés. Par exemple, stimulation anodique et cathodique produit des effets adverses conditionné réponses enregistrées par électromyographie activité lapins8. Cependant, les études ont également montré que des séances de stimulation anodiques prolongée peuvent diminuent l’excitabilité tandis qu’augmentant courants cathodiques peut conduire à l’excitabilité, présentant Self contrastées effets3.

Des stimuli fois anodiques et cathodiques agrègent l’utilisation de paires d’électrodes. Par exemple, stimulation anodique, « actif » ou « anode » électrode est placée au-dessus de la région du cerveau pour être modulé, tandis que l’électrode « référence » ou « cathode » est situé dans une région où l’effet du courant est censé pour être insignifiante9. Dans la stimulation cathodique, disposition de l’électrode est inversée. L’intensité de stimulation pour tDCS efficace dépend de l’intensité du courant et dimensions des électrodes, qui affectent l’électrique sur le terrain différemment10. Dans la plupart des études publiées, l’intensité du courant moyenne est entre 0,10 à 2,0 mA et 0,1 mA à 0,8 mA pour l’homme et la souris, respectivement de6,11. Bien que la taille de l’électrode de 35 cm2 est généralement utilisée chez l’homme, il n’y a aucune bonne compréhension concernant les dimensions de l’électrode pour rongeurs et une enquête plus approfondie est nécessaire6.

TDC a été proposé dans les études cliniques avec la tentative de proposer un traitement alternatif ou complémentaire pour plusieurs troubles neurologiques et neuropsychiatriques11 tels que l’épilepsie12/12,13de trouble bipolaire, AVC5 , major dépression,14,15de la maladie d’Alzheimer, sclérose en plaques,16 et17de la maladie de Parkinson. Malgré l’intérêt croissant STD et son utilisation dans des essais cliniques, cellulaire détaillée et des altérations moléculaires évoquées dans le tissu cérébral, court et effets de longue durée, ainsi que résultats comportements, sont encore pour être plus profondément étudié18, 19. comme une approche humaine directe à étudier en profondeur tDCS n’est pas viable, l’utilisation d’un modèle animal de la TDC peut offrir des renseignements précieux sur les événements cellulaires et moléculaires qui sous-tendent les mécanismes thérapeutiques de STD en raison de l’accessibilité à la tissus cérébraux de l’animal.

Éléments de preuve disponibles est limitée concernant les modèles de CDV chez la souris. La plupart des modèles signalés utilisé différentes mises en page implanter, les dimensions de l’électrode et matériaux. Par exemple, Winkler et al. (2017) implanté l’électrode tête (Ag/AgCl, 4 mm de diamètre) rempli de solution saline et fixé au crâne avec vis et ciment acrylique20. Différent de notre approche, les électrodes de la poitrine a été implanté (platine, 20 x 1, 5 mm). Ngoudjou et al. (2017) a utilisé une procédure très semblable aux nôtres, même si l’électrode thoracique était issu d’une éponge imbibée d’une solution saline (carbone remplis, 9,5 cm2)21. Une autre étude implanté les deux électrodes dans la tête de l’animal, qui a été réalisée en utilisant des plaques fixes et couvrant la tête de l’animal avec un hydrogel conducteur22. Nous décrivons ici un modèle de souris de CDV qui utilise une électrode chroniquement implantée par simple configuration TDC et les procédures chirurgicale (Figure 1).

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Protocole

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Logement individuel mâle adulte (8-12 semaines) souris C57BL/6 ont été utilisés dans cette expérience. Les animaux ont reçu des soins appropriés avant, pendant et après les procédures expérimentales avec la nourriture et l’eau ad libitum. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’éthique animale de l’Université fédérale de Minas Gerais (protocole numéro 59/2014).

1. Placement des électrodes

  1. Sédatifs et fixer l’animal sur l’appareil stéréotaxique
    1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux nécessaires.
      Roman Instruments chirurgicaux ont été stérilisés pendant 3 minutes à 440 ° C. Tampons de coton ont été stérilisés à l’autoclave à 20 psi (livres par pouce carré) à 121 ° C pendant 20 min.
    2. Régler le régulateur thermique plate-forme à 37 ° C.
    3. Peser l’animal et de calculer la dose appropriée pour l’induction de l’anesthésie. Utilisez un mélange de kétamine et de xylazine à une dose de 100 mg/kg la kétamine et 8 mg/kg de xylazine, donné par voie intrapéritonéale (aiguilles, 31 G). L’animal doit s’endormir dans les 2 à 3 min.
    4. Utilisez un rasoir électrique ou un rasoir pour raser vers le bas du site chirurgical.
    5. Plaque chauffante place l’animal sur l’appareil stéréotaxique sur la pré chauffé.
    6. Tenir la tête de l’animal et insérer les barres d’oreilles pointe dans chacun des oreilles de l’animal pour le fixer à la plate-forme stéréotaxique.
    7. Vérifier il n’y aucun déplacement tête latérale et le mouvement vertical peu après en le déplaçant lentement de positionnement de la tête de l’animal.
    8. Doucement glisser le masque d’anesthésie sur nez de la souris et le fixer en place en serrant la vis.
    9. Affectez l’isoflurane 1 % à 1,0 L/min d’O2.
    10. Pommade oculaire aux yeux de l’animal pour éviter le dessèchement cornée au cours de la chirurgie.
  2. Fixation de l’implant à la tête de l’animal
    1. Les écouvillons en coton permet de préparer le site chirurgical avec trois gommages alternance de povidone-iode (ou chlorhexidine 2 %) et l’éthanol à 70 %.
    2. Utilisez une paire de pincettes pour vérifier la profondeur de l’anesthésie par légèrement serrant les orteils de l’animal et la vérification de la perte du réflexe de retrait pédale (pincement de l’orteil) de l’animal.
    3. Faire une incision de 3 mm en arrière de la ligne d’oreille de l’animal et arrêt à la ligne des yeux. Le site d’incision doit avoir environ 1 cm de longueur pour être assez grand pour recevoir l’implant.
    4. Grattez légèrement le crâne avec un grattoir d’OS pour améliorer la colle et l’adhérence du ciment. Faire cette lumière lui tout dans le but de créer des micro rayures.
    5. Placez soigneusement agrafes chirurgicales pour la peau lâche de maintenir un champ opératoire ouvert et libre d’obstacles tels que peau et fourrure.
    6. Utiliser un coton-tige stériles pour sécher le cuir chevelu de l’animal.
    7. Un microscope à dissection permet de visualiser le haut du crâne de l’animal.
    8. Raccorder une aiguille au titulaire stéréotaxique et pousser le bregma. Placez l’aiguille directement au-dessus de la tête de l’animal toucher légèrement le bregma.
    9. Toutes les coordonnées sur le traceur numérique à zéro et puis relever l’aiguille.
    10. Fixer l’implant CDV sur le support stéréotaxique. Positionner l’implant sur la tête de l’animal et l’abaisser lentement sur la région d’intérêt en utilisant les coordonnées stéréotaxiques appropriées.
    11. Utilisez une aiguille pour écarter 1 goutte (environ 35 μL) de la super colle sur base de l’implant.
    12. Déplacez lentement vers le bas le support jusqu'à ce qu’il touche le crâne. N’oubliez pas que la base de l’implant est entièrement en contact avec la surface.
    13. Préparer le ciment chirurgical selon les instructions du fabricant.
    14. Après un positionnement précis, appliquer 3, mince couche uniforme de ciment entre le crâne et sur la partie inférieure de l’implant. Verser goutte par goutte d’eau à l’aide d’une brosse d’application. Couches doivent former une structure en forme de colline pour davantage de soutien structurel de l’implant.
    15. Quitter le pas de vis de l’implant de ciment pour permettre une connexion lisse, vue dégagée.
    16. Permettre à chaque couche sécher pendant environ 4 minutes.
    17. Lorsqu’il est sec, enlever soigneusement le support jusqu'à ce qu’il est complètement détaché de l’implant. Toujours faire très attention lorsque vous manipulez l’implant, car elle peut être accidentellement extraite du crâne de l’animal.
  3. Finition de la chirurgie et les soins post-opératoires
    1. Hydrater la peau de l’animal dans l’incision avec un coton-tige imbibé d’une solution saline.
    2. Enduire la peau au-dessus de la base de l’implant de STD.
    3. Utilisez une paire de pinces à réunir le tissu et refermer l’incision avec une goutte de colle chirurgicale tissulaire par 0,2 cm de tissu.
    4. S’infiltrer dans les 1-2 % de lidocaïne dans l’incision et qui sous-tendent les tissus.
    5. Hydrater la souris avec 500 µL de solution de Ringer lactate par voie sous-cutanée.
    6. Placez la souris dans une cage propre et simple logés de préchauffé (37 ° C).
    7. Mettre un petit plat avec des boulettes de nourriture humide dans la cage pour un accès facile à la nourriture dans les heures suivantes.
    8. Enregistrer le poids après une chirurgie de l’animal.
    9. Donner le kétoprofène animal (5 mg/kg) par voie sous-cutanée après la chirurgie, ainsi que sur les 2 prochains jours.
    10. Surveiller la récupération de l’animal étroitement pendant au moins 1 semaine. Évaluer des signes de détresse, comme horripilation, manque de toilettage, locomotion réduite, plaie de grattage et inflammation du site chirurgical.

2. tDCS Setup et Stimulation

  1. tDCS Setup (voir Figure 2)
    Remarque. Assurez-vous que le stimulateur tDCS est entièrement chargé.
    1. Fixez les câbles de l’anode et la cathode sur le stimulateur STD et rendez-les disponible près du site de stimulation. Fixer l’électrode encliquetables au titulaire stéréotaxique.
    2. Définissez la plate-forme thermique à 37 ° C.
    3. Allumez le débitmètre oxygène sur le système d’anesthésie par inhalation à 1 L/min.
    4. Placez votre souris dans la chambre de l’induction de l’anesthésie.
    5. Allumez le vaporisateur isoflurane à 3 %. Laisser l’animal à subir l’isoflurane effets pendant 4 min.
    6. Alors que l’animal est dans la chambre de l’induction, utiliser une seringue stérile pour remplir l’électrode de corps avec la solution saline à 0,9 %.
    7. Retirer l’animal de la chambre de l’induction et placer sa poitrine sur l’électrode de corps.
    8. Doucement glisser le masque d’anesthésie sur nez de la souris et le fixer en place. Réduire la production d’isoflurane à 1,5 %.
    9. Remplir l’implant et l’électrode encliquetables avec du sérum physiologique et attachez-les avec soin.
    10. Ajuster le temps de stimulation et d’intensité du courant.
    11. Vérifier la qualité du contact sur le stimulateur STD. Contact optimal va de 7 à 10 sur une échelle de 1 à 10.
  2. Stimulation
    1. Commencer la stimulation.
    2. Observer la montée en puissance actuelle pendant 30 s à la valeur sélectionnée et se maintenir stable pour le moment établi, puis, à la fin de la session ramping vers le bas encore une fois.
    3. Activez le bouton sham pour souris témoins.
    4. Observer la montée en puissance actuelle pendant 30 s à la valeur sélectionnée, puis vers le bas pour 1 pour le reste de la période de stimulation avec une rampe finale à la valeur sélectionnée à la fin avec une rampe consécutive.
    5. Une fois terminée la séance de stimulation, transvaser avec soin l’animal à une cage préchauffé (37 ° C) pendant 10 min.
      Roman Animaux commence à s’éveiller après 3 min.
    6. Désactivez le système d’anesthésie par inhalation.

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Résultats

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Le protocole chirurgical présente stabilité à long terme de l’implant pendant au moins un mois, aucun signal inflammatoire sur le site stimulé, ni tout autre effet indésirable. Tous les animaux ont survécu aux sessions de procédure et tDCS chirurgicales (n = 8). Dans cette expérience, tDCS implants ont été placés sur le cortex M1 et M2 (+1,0 mm antéro-postérieur et latéral de 0.0 mm à bregma). Une semaine plus tard, STD (n = 3-4) et sham (n = 3) souris ont été stimulés pendant cinq jours ...

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Discussion

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Ces dernières années, les techniques de neurostimulation ont été entrant pratique clinique comme une procédure prometteur pour traiter les troubles neuropsychiatriques23. Pour réduire la contrainte imposée par le manque de connaissance des mécanismes de la neurostimulation, nous avons présenté ici un modèle de souris tDCS transportant une électrode qui peut cibler des régions du cerveau. L’électrode étant chroniquement implantable, ce modèle animal permet l’étude des effets biologiques durables év...

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Remerciements

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Nous remercions M. Rodrigo de Souza pour assistance au maintien de colonies de souris. L.A.V.M est un postdoc CAPES. Ce travail a été soutenu par la subvention PRONEX (FAPEMIG : APQ-00476-14).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BD Seringue ultra-fine 50UBD10033430026Pour injection intrapéritonale.
Rasoir (Philips Multigroom)Philips (Brésil)QG3340/16Pour la coupe du site chirurgical.
<>
Model 940 avec console d’affichage numériqueKOPF940Pour la restriction et le positionnement chirurgicaux des animaux.
Modèle 922 Barres d’oreille à 60 degrés sans ruptureKOPF922Pour la restriction et le positionnement chirurgicaux des animaux.
Support de canuleKOPF1766-APPour le positionnement de l’implant.
Microscope binoculaire à zoom stéréo de précision (III) sur béquilleWPIPZMIII-BS Pour lalocalisation du bregma et le positionnement de l’implant.
Modèle de système de contrôle de la température  ;KOPFTCAT-2LVPour le contrôle thermique des animaux.
Source de lumière froide  ;WPIWA-12633Pour la luminosité focale
Système d’anesthésie animale de laboratoire de table avec récupérationVetEquip901820Pour l’administration d’isoflurane et la sécurité.
Filtre à adsorption au charbon actif VaporGuardVetEquip931401Mesures de sécurité du système de livraison.  ;
Modèle 923-B Support de tête d’anesthésie à gaz de sourisKOPF923-BPour la restriction animale et l’administration d’O2 et d’isoflurane.
Régulateur d’oxygène, E-cylinder  ;VetEquip901305pour la régulation et la livraison de l’O2.
Tuyau d’oxygène &ndash ; vert  ;VetEquip931503pour l’administration d’O2 et d’isoflurane.
Stérilisateur infrarouge 800 º ; CMarconiMA1201Pour la stérilisation des instruments.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-11Pour l’incision.
Crochets chirurgicauxINJEX1636Fabriqué en interne - Utilisé pour dégager le site chirurgical de la peau et de la fourrure.
Pince à épiler standard ou pince-Pour la préhension de la peau.
Consommables chirurgicaux
Vetbond3MSC-361931Pour la fermeture de l’incision.
KIT Ciment et Catalyseur (Duralay)Reliance2OZPour la fixation de l’implant.
Cotons-tiges stériles (autoclavés)JnJ75UPour l’antisepsie du site chirurgical.  ;
Plaque à 24 puits (plaque de culture tissulaire)SARSTEDT831,836Pour la préparation du ciment.
Application BrosseparkellS286Pour le mélange et l’application de ciment.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2 %)Ceva Pharmaceutical (Brésil)P10160Pour l’induction de l’anesthésie.
Kétamine (DOPALEN 10 %)Ceva Pharmaceutical (Brésil)P30101Pour l’induction de l’anesthésie.
Isoflurane (100 %)Cristá ; lia (Brésil)100MLPour l’entretien de l’anesthésie.
Lidocaïne (XYLESTESINE 5 %)CristalPharma-Pourles soins post-chirurgicaux.
Kétoprofène (PROFENID 100 mg)Sanofi Aventis20MLPour les soins post-chirurgicaux.
Ringer’s Lactate SolutionSANOBIOL LAB7898153652145Pour les soins post-chirurgicaux.
TobraDex (Dexaméthasone 1 mg/g)Alcon631Pour la lubrification et la protection de l’œil.
Stimulation
Stimulateur Transcrânien AnimalSoterix Medical2100Pour la génération actuelle.
Porte-électrode à broche (base cylindrique)Soterix Medical2100Support d’électrode (implant).
Électrode à broche (Ag/AgCl)Soterix Medical2100Pour la distribution de courant (électrode).  ;
Capuchon d’électrode à brocheSoterix Medical2100Pour la protection des implants.
Électrode corporelle (Ag/AgCl Coated)Soterix Medical2100Pour l’administration de courant (électrode).  ;
Solution saline (0,9 %)FarmaX7896902206441Milieu conducteur pour l’administration du courant.
Pince à épiler standard ou pince-Pour la configuration tDCS.
Real Time Polymerase Chain Reaction
Système en temps réel BioRad CFX96pour qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)BioRad1725271Pour qPCR
Hard Shell PCR Plaques PCT COM 50 p/ CFX96BioRadHSP9601Pour qPCR
Microseal « B » seal pct c / 100BioRadMSB1001pour qPCR
Instrument stéréotaxique pour petits animaux

Références

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Mots-clés

Mod le murin tDCSimplantation d lectrodesexpression g nique corticalestimulation anodique et cathodiqueappareil st r otaxiqueanesth sie l isofluranem lange k tamine xylazineapplication de ciment chirurgicalanalyse comportementale et mol culaire

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