L’induction et l’évaluation des croisements de consanguinité à l’aide de la fourmi, Vollenhovia Emeryi

Résumé

Dans le présent protocole, les méthodes pour effectuer des croisements de consanguinité et à l’évaluation de la réussite de ces croisements, sont décrites pour la fourmi Vollenhovia emeryi. Ces protocoles sont importants pour les expériences visant à comprendre les bases génétiques des systèmes de détermination du sexe dans les hyménoptères.

Résumé

Les composantes génétiques et moléculaires de la cascade de détermination sexuelle ont été largement étudiées dans l’abeille, Apis mellifera, un organisme modèle hyménoptères. Cependant, on connaît les mécanismes de détermination du sexe trouvés chez les autres taxons hyménoptères non-modèle, comme les fourmis. En raison de la nature complexe des cycles de vie qui ont évolué en espèces hyménoptères, il est difficile de maintenir et d’effectuer des croisements expérimentaux entre ces organismes dans le laboratoire. Nous décrivons ici les méthodes pour effectuer des croisements de consanguinité et d’évaluer le succès de ces croisements chez fourmi Vollenhovia emeryi. Induire la consanguinité dans le laboratoire à l’aide de V. emeryi, est relativement simple en raison de la biologie particulière de l’espèce. En particulier, cette espèce produit androgénétique mâles et femelles reproducteurs pièce polymorphisme de l’aile, qui simplifie l’identification des phénotypes dans les croisements génétiques. En outre, l’évaluation de la réussite de la consanguinité est simple, comme mâles peuvent être produites en permanence par consanguinité Croix, tandis que les mâles normaux apparaissent pendant une saison de reproduction bien définie uniquement dans le domaine. Notre protocole permettent avec V. emeryi comme modèle pour étudier les bases génétiques et moléculaires du système de détermination du sexe chez les espèces de fourmis.

Introduction

Taxons hyménoptère eusocial, tels que les fourmis et les abeilles, ont développé un système de détermination sexuelle haplodiploïdes dans lequel les individus qui sont hétérozygotes à la détermination de sexe complémentaire d’un ou plusieurs loci (CSD) devenue des femelles, tandis que ceux qui sont homo - ou hémizygotes devenir des hommes (Figure 1A)¹.

Les composantes génétiques et moléculaires impliquées dans la cascade de détermination du sexe ont été bien étudiés chez l’abeille, Apis mellifera, un modèle hyménoptères organisme^2,3,4. Génomique comparative des études récentes suggèrent que les fourmis et les abeilles partagent plusieurs homologues putatifs dans la voie de détermination du sexe, tel que le gène de détermination de sexe initiale, CDD⁵. Cependant, preuve de conservation fonctionnelle de ces homologues fait encore défaut à fourmis.

Pour résoudre ce problème, les lignes de consanguinité devront être établies car ils sont essentiels pour la cartographie génétique et les études moléculaires. Toutefois, il est difficile de maintenir et d’effectuer des croisements expérimentaux entre ces organismes en laboratoire en raison de la nature complexe des cycles de vie qui ont évolué.

Ici, nous utilisons Vollenhovia emeryi comme modèle pour étudier les fondements génétiques et moléculaires de la système de détermination de sexe dans fourmis^6,7. Les lignes de la consanguinité de cette espèce ont été développées précédemment pour la cartographie génétique du locus de caractères quantitatifs (QTL) pour les caractères liés à la détermination du sexe pour la première fois dans les fourmis⁶. En outre, la cascade de détermination sexuelle moléculaire a été étudié⁷. Cette espèce a évolué d’un système de reproduction inhabituel qui emploie la gynogenèse et androgenèse (Figure 1B)^8,9. La plupart des nouvelles reines et les mâles sont par clonage produits des génomes maternels et paternels, respectivement. En outre, les travailleurs et des reines sont produites sexuellement⁸. Ce système de reproduction est particulièrement bien adapté aux études génétiques parce que les croisements de consanguinité produites à l’aide de sexuellement produit des reines et les mâles sont génétiquement équivalentes à un rétrocroisement classique. Reines sexuellement produites diffèrent morphologiquement de queens produites à partir de génomes maternelle¹⁰ (Figure 1B), mener et évaluer des croisements de consanguinité sont grandement simplifiée en utilisant cette méthode.

Dans cet article, les méthodes pour l’établissement de colonies de laboratoire pour l’essai de passage, demande de consanguinité traverse à l’aide de paires de fratrie et l’évaluation de la réussite de ces croisements à l’aide de génotypage des membres de la colonie et la dissection de la progéniture mâle les organes génitaux sont décrites dans V. emeryi.

Quel que soit le système de reproduction employé, application de croisements de consanguinité est souvent la première étape essentielle dans toute enquête sur les systèmes de détermination du sexe dans les hyménoptères. Par exemple dans Cardiocondyla obscurior, l’absence presque totale de mâles diploïdes après 10 générations de fratries d’accouplement en laboratoire montre absence de CSD locus¹¹. Il est possible de prédire le nombre de loci CSD de la proportion de mâles produites en consanguinité Croix^6,12,13.

Protocole

1. collecte et l’entretien de V. Emeryi Colonies en laboratoire sur le terrain

NOTE : Nids de V. emeryi sont trouvent dans la pourriture des journaux et tombés en décomposition nozzles secondaire forêts dans tout le Japon. Cette espèce présente deux types de colonies, savoir, (1) colonies produisant seulement des reines à ailes longues et (2) les colonies produisant principalement des reines à ailes courtes en plus petit nombre de reines de longues ailes^8,14. Dans ce protocole, nous avons recueilli le dernier type de colonies dans la préfecture d’Ishikawa, Japon.

1. Recueillir V. emeryi colonies au début de l’été.
   Remarque : Pour obtenir un nombre suffisant d’individus sexués pendant la saison de reproduction, colonies contenant plus de 300 personnes sont préférés.
2. Transférer les spécimens de fourmi des branches recueillies à un nid de plâtre artificiel avec un couvercle en verre à l’aide d’un aspirateur (Figure 2, gauche).
3. Maintenir les colonies dans des nids artificiels à 25 ° C sous un cycle lumière/obscurité de 16:8 h. Fournir l’eau du robinet avec une bouteille de lavage pour mouiller le plâtre.
   1. Ajouter environ 100 mg de poudre sèche de cricket enveloppé dans du papier d’aluminium et une pointe de rempli d’eau de sucre brun (pointe de 20 µL) tous les deux jours jusqu'à ce qu’apparaissent de nouveaux reproducteurs (F₁ ailé-reines et les mâles de₁ F).

2. laboratoire Croix

NOTE : Nouveaux reproducteurs commencent à émerger de la fin de l’été à l’automne (Figure 3). Reines de longues ailes sont produits sexuellement, et à ailes courtes reines sont produites par clonage et possèdent le génome maternel (Figure 1). Utilisez à ailes longues reines et les mâles pour les croisements de consanguinité.

1. Pour arrêter les individus de se déplacer, mettez colonies dans une pièce d’environnement constant à 4 ° C pendant 15 min.
2. Enlever les milieu-jambes de 30 ouvriers avec une pincette sous un microscope stéréoscopique et transférez-les dans nouveau nid de plâtre plus petit (Figure 2, droite) pour les croisements de consanguinité.
   Remarque : Les jambes sont retirées pour distinguer les travailleurs présents auprès des travailleurs qui seront produites par les croisements ultérieurs de consanguinité.
3. Ajouter 3-4 larves ou pupes dans un nid de plâtre contenant des travailleurs.
   NOTE : Les travailleurs présentent une activité exploratoire dans la colonie de reines-moins de₀ F. Les larves ou nymphes peuvent attirer efficacement ces travailleurs et les nouveaux reproducteurs dans le centre de la colonie au cours de l’essai de passage. Ainsi, maintenir des conditions de la colonie expérimentale près de la colonie normale.
4. Transférer une reine de longues ailes et un mâle dans un nid de plâtre préparé à l’étape 2.3 pour consanguinité croisements.
5. Garder des colonies à 25 ° C sous un cycle 16:8 h de lumière/obscurité avec la nourriture et l’eau, tel que décrit au point 1.3 jusqu'à ce que la Reine perd ses ailes et pondent leurs œufs.
   Remarque : Cela prend une semaine à un mois.
6. Vérifier le quotidien colonie expérimentale sous un microscope stéréoscopique. Après que exécution de consanguinité traverse entre les descendants de₁ F, oeufs peuvent être observés au microscope stéréoscopique.
7. Après le F₁ Reine commence à pondre des œufs, supprimer les mâles₁ F et des larves ou des nymphes, ajoutés à l’étape 2.3 du nid pour éviter le mélange de la génération de₁ F (mâles et femelles, utilisées pour des croisements de consanguinité) et la génération de₂ F (progéniture produit à partir de croisements de consanguinité).
   Remarque : S’il y a peu de mâles dans la colonie, il est possible d’induire des croisements de consanguinité à l’aide d’un mâle et 1 à 3 reines dans la même colonie expérimentale.
8. Garder les colonies sous le même conditionsas décrite au point 1.3, jusqu'à ce que la progéniture de₂ F émerge.
   NOTE : Reine de transfert F₁ et F₂ descendance dans nouveau plus grand nid de plâtre (Figure 2, gauche) pour le maintien à long terme de la colonie.

3. l’évaluation du succès de la consanguinité

1. Extraction de l’ADN et le génotypage de la génération parentale (F₀)
   1. Supprimer une jambe d’une reine de₀ F à l’aide de pinces et transférer la jambe dans un microtube de 1,5 mL contenant 100 µL de l’agent de chélation.
   2. Sous un microscope stéréoscopique, disséquer un abdomen femelle dans le plat en verre rempli de 300 µL d’eau ultrapure à l’aide de pinces et d’isoler la spermathèque contenant le sperme des mâles accouplées.
   3. Décollez le tissu de la spermathèque et isoler les spermatozoïdes des tissus de la femelle à l’aide de broches de l’insectes.
      NOTE : Pour faciliter l’extraction de sperme de la spermathèque, stocker des spécimens femelles en 100 % EtOH pendant plus d’une journée avant la dissection.
   4. À l’aide d’une micropipette, transférer le sperme dans un microtube de 1,5 mL contenant 100 µL de l’agent de chélation.
   5. Incuber les échantillons de reine₀ F et le sperme préparé à l’étape 3.1.1 et 3.1.3, respectivement, à 95 ° C pendant 20 min. Flash Centrifuger le microtube et conserver à 4 ° C.
   6. Génotype de tous les échantillons à l’aide de la méthode décrite ailleurs⁴.
2. Extraction de l’ADN de la paire de fourmis utilisées pour des croisements de consanguinité (F₁)
   1. Après que confirmant la production de œufs par le sib accouplés Reine₁ F, extraire l’ADN de la Reine à l’aide de ses ailes de hangar ou un pied milieu et génotype en utilisant la même méthode décrite à l’article 3.1 ci-dessus.
   2. Extraire l’ADN de F₁ mâle en utilisant une jambe et le génotype en utilisant la même méthode décrite à l’article 3.1 ci-dessus.
      Remarque : Les échantillons peuvent être conservés en 100 % EtOH avant l’extraction de l’ADN et l’ADN en agent de chélation peuvent être conservée pendant deux mois à 4 ° C.
3. Évaluation de la fertilité masculine chez les mâles produit à partir de croisements de consanguinité
   NOTE : Les mâles diploïdes produites à partir de croisements de consanguinité sont souvent stériles.
   1. Disséquer les organes reproducteurs internes dans un plat en verre avec 400 µL de solution de PBS avec une pincette.
   2. Retirer les PBS et ajouter 4 % de paraformaldéhyde (IFP) à l’aide d’une micropipette.
   3. Fixer le tissu en incubant en PFA pendant 30 min à température ambiante (15-25 ° C).
   4. Laver le tissu 5 fois avec 400 µL de PBS à l’aide d’une micropipette.
   5. Diluer le 4', 6-diamidino-2-phénylindole solution de (DAPI) à 1 µg/mL dans du PBS.
   6. Retirer les PBS et ajouter environ 300 µL de cette solution diluée de coloration DAPI au tissu.
   7. Incuber 15 min sous condition sombre à température ambiante (15-25 ° C).
   8. Laver le tissu 5 fois avec 400 µL de PBS et transfert de tissu sur le centre du verre de diapositive à l’aide de pinces.
   9. Monter le tissu sur montage moyenne contenant conjugué tétraméthylrhodamine TRITC phalloïdine.
   10. Observer des échantillons par laser confocal utilisant 20 X ou 63 X lentilles de l’objectif de microscope à balayage.
   11. Utiliser un laser à excitation de 405 nm et un détecteur hybride à 410-530 nm pour la détection de DAPI.
   12. Utiliser un laser à excitation 561 nm et un détecteur hybride à 565-650 nm pour la détection de TRITC.
   13. Utilisez une vitesse de balayage de 400 Hz (400 lignes/s) avec une résolution de 1024 × 1024 pixels.
   14. Capturer des images à l’aide d’une plateforme logicielle.

Résultats

Résultats de l’analyse de microsatellites en utilisant F₀ et F₁ générations ont montré que des croisements de consanguinité ont été exécutées avec succès (Figure 4)⁶. Ainsi de la consanguinité des croisements, reines fécondées ont été obtenues dans le mois d’établir les colonies de croisement expérimentale. Un quart (27,1 ± SD de 8,91 %) de tous les descendants (F₂) de la Croix de la consanguinité était...

Discussion

Cet article explique les protocoles qui peuvent être utilisés pour induire des croisements de consanguinité et d’évaluer la présence de la consanguinité dans la fourmi V. emeryi. Dans les expériences, génotypage des individus utilisés pour les croisements est nécessaire pour s’assurer que les croisements de consanguinité ont réussi. Cependant, l’efficacité de ces tests de passage à niveau est clairement apparente comme mâles diploïdes peuvent être produites tout au long de l’année, tandis que les mâles haploïdes...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poudre de plâtre	N/A	N/A N/A N’importe	quelle marque peut être utilisée
Charbon de bois, Activé, Poudre Wako		033-02117,037-02115
Verre à lames	N/A	N/A N/A N’importe	quelle marque peut être utilisée
Régime de grillon sec	N/A	N/A N/A	Toute marque peut être utilisée
Brown shuger  ;	N/A	N/A N’importe	quelle marque peut être utilisée
Styrène Boîtier de forme carrée	AS ONE N’importe	quelle taille La	taille varie en fonction du nombre de fourmis
Incbator			N’importe quelle marque peut être utilisée
Bain en bloc d’aluminium Unité thermique sèche DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube, Transparent, Fond rond	WATSON	131-715CS
Éthanol (99.5)	Wako	054-07225
Microscope stéréoscopique	N/A	N/A	Toutes les marques peuvent être utilisées
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 forme sodium	SIGMA	11139-85-8
Tampon de phosphate salin (PBS) Comprimés, pH 7,4	TaKaRa	T9181
Paraformaldéhyde	Wako	162-16065
-Cellstain- Solution DAPI	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Analyseur génétique	Applied Biosystems		Contactez directement le constructeur pour plus d’informations.
Microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP8	Leica		Contactez directement le constructeur pour plus d’informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Contactez directement le constructeur pour plus d’informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 EAU	Leica		Contactez directement le constructeur pour plus d’informations.
Leica HyDTM	Leica		Contactez directement le constructeur pour plus d’informations.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Contactez directement le constructeur pour plus d’informations.