Études structurale des macromolécules en Solution à l’aide de petite diffusion des rayons x Angle

Summary

Nous présentons ici comment petit Angle x-ray Scattering (SAXS) peut être utilisé pour obtenir des informations sur les enveloppes basse résolution qui représentent les structures macromoléculaires. Lorsqu’il est utilisé en conjonction avec haute résolution techniques structurelles telles que la résonance magnétique nucléaire et de la cristallographie aux rayons x, SAXS peuvent donner un aperçu détaillé de protéines multidomaine et complexes macromoléculaires en solution.

Abstract

Interactions de protéine-protéine impliquant des protéines à plusieurs domaines globulaires présentent des défis techniques pour déterminer comment ce complexes se forment et comment les domaines sont orientés/positionné. Ici, un protocole avec le potentiel pour élucider les interactions médiate des domaines spécifiques dans plusieurs composants système par l’intermédiaire de ab initio de modélisation est décrite. Une méthode de calcul des structures en solution des macromolécules et leurs assemblages est fourni qui comprend l’intégration des données de diffusion de rayons x de petits angles (SAXS), chromatographie et structures de résolution atomique ensemble dans une approche hybride. Un exemple concret est celui du complexe de pleine longueur nidogene-1, qui assemble des protéines de la matrice extracellulaire et forme une nanostructure étendu, courbé. Un de ses domaines globulaires s’attache à la laminine γ-1, qui structure la membrane basale. Cela fournit une base pour la détermination de structures précises de complexes protéiques multidomaine flexibles et est activé par des sources de rayonnement synchrotron couplées à des systèmes d’automatisation robotique et taille exclusion chromatographie. Cette combinaison permet une analyse rapide dans laquelle plusieurs États oligomères sont séparés juste avant la collecte de données SAXS. L’analyse donne des informations sur le rayon de giration, dimension de particule, forme moléculaire et appariement inter-domaines. Le protocole permettant de générer des modèles 3D complexes en adaptant les structures à haute résolution des protéines composant reçoit également.

Introduction

Les cellules contiennent des réseaux complexes de protéines qui agissent comme des machines moléculaires pour remplir des fonctions cellulaires telles que les cascades de signalisation et de maintenir l’intégrité structurale. Les façons dont ces différentes composantes se déplacent et interagissent dans un espace tridimensionnel donne naissance aux fonctions spécifiques des macromolécules. L’importance de la structure des protéines, la dynamique et les interactions dans la détermination de fonction a fourni la nécessité pour les techniques en évolution constante et complexes pour mesurer ces propriétés. Parmi ceux-ci, la résonance magnétique nucléaire (RMN), x-ray Crystallography (XRC) et plus récemment, Cryo-Electron Microscopy (CEM) fournir informations structurales à haute résolution. Cependant, XRC et CEM produisent des structures de l’un des nombreux États biomoléculaire et manquent d’informations sur la dynamique de la structure de la protéine, détermination de la structure 3D par RMN est généralement limitée aux petites protéines globulaires. Une façon de surmonter ces limites est d’utiliser le petit Angle x-ray Scattering (SAXS) pour générer des enveloppes moléculaires des systèmes grandes, multidomain ou complexés et combiner les structures macromoléculaires rigides haute résolution afin d’élucider le global architecture et fonctionnalités dynamiques.

SAXS produit des enveloppes basse résolution des complexes macromoléculaires avec une résolution d’environ 10-20 Å ¹, ce qui donne un aperçu non seulement dans la structure, mais aussi les caractéristiques dynamiques qui affiche le complexe. SAXS utilise des rayons x afin de découvrir la structure moléculaire, mais il est à la différence de XRC en ce que l’orientation aléatoire isotrope des particules en solution ne conduit pas à diffraction, mais plutôt à la diffusion, qui ne peut pas produire la résolution atomique. Au lieu de cela, un électron « enveloppe » de la macromolécule est généré qui représente une moyenne des conformations qui affiche la macromolécule. Cette information peut servir à une fixation directe des structures de résolution atomique précédemment résolu d’inférer des régions de flexibilité dans une seule protéine ou une sous-unité organisation ou dynamique dans un plus grand complexe multi-protéine. SAXS données sont collectées au synchrotron à l’aide des rayons x monochromatiques ou provenant de sources internes, qui représentent une source de rayons x plus faible nécessitant des heures plutôt qu’en secondes de temps de pose d’échantillon (Figure 1). Données SAXS souvent prélevées plusieurs échantillons avec un unique dispositif expérimental et tampon, nécessitant une longue période de recueillir une série de données utiles sur un système. Échantillons devraient, par conséquent, être stable et non concentration pendant au moins quelques heures basé sur des méthodes de contrôle de la qualité vérifiable comme diffusion dynamique de la lumière (DLS) et/ou l’analyse de l’ultracentrifugation analytique (AUC) pour obtenir la qualité de données SAXS^{2 , 3}. ici, nous fournissons une description pratique de SAXS, les principes de son utilisation, avantages, limites et préparation des échantillons focus sur collecte de données et analyse, avec toucher brièvement sur ab initio de modélisation à l’aide de la matrice extracellulaire protéines nidogene-1 et la laminine γ-1 à titre d’exemple expérimental.

Principes, avantages et limites des SAXS :

Le directeur selon derrière SAXS est relativement simple : une solution de la préparation de monodisperses de prélèvement d’intérêt est placée dans un capillaire et est exposée à un faisceau de rayons x monochromatique de haute énergie. Les photons provoquent des électrons de l’atome d’abord oscillant, résultant en une onde sphérique émise de la même énergie et longueur d’onde. Étant donné que chaque électron oscillera, un fond constant sera atteint, et la densité d’électrons résultant de la macromolécule s’oppose à l’arrière-plan. L’intensité de diffusion qui en résultent est recueillie en fonction de l’angle de diffusion, 2Θ (Figure 1).

Tandis que d’autres techniques comme XRC, RMN et CEM fournissent des informations structurelles au niveau atomique, il y a plusieurs avantages à SAXS que les autres techniques ne peuvent pas fournir. SAXS peuvent être effectuées dans n’importe quel tampon et ne nécessite aucune préparation spéciale. Ceci est particulièrement important pour étudier le comportement et la structure des macromolécules sous diverses conditions, telles que la présence ou l’absence de mono - ou cations divalents ou changements de pH^4,5. SAXS a la capacité de fournir des informations sur les régions flexibles d’une macromolécule⁶, quelque chose les autres techniques énumérées peuvent lutter avec. Par conséquent, SAXS peut être utilisé comme une solide technique gratuite avec les parties stables d’une macromolécule être étudiée avec XRC, GRN ou CEM et la macromolécule entière ou complexe analysés en basse résolution avec SAXS et combinées à l’aide de ces différents outils d’analyse comme FoXSDock⁷ ou⁸de la CRYSOL. SAXS étant une technique de la solution, il est souvent utilisé pour confirmer si des structures statiques telles que celles obtenues par XRC concordent à la solution⁶. SAXS a également l’avantage d’être une technique qui requiert une quantité relativement faible de l’investissement de l’échantillon (typiquement 50-100 µL) et une quantité relativement faible de temps de l’expérience (30 min - 1 h).

La plus grande limitation de SAXS est la vulnérabilité à l’agrégation de l’échantillon et/ou de la dégradation, ce qui peut conduire à des prédictions incorrectes structurelles. Un groupement, même aussi peu que 5 %, peut disperser la lumière dans des quantités très élevées, conduisant à une surestimation de la dimension maximale de particules (D_max) et le rayon de giration (R_g). En revanche, la dégradation de l’échantillon peut conduire à une sous-estimation des propriétés moléculaires. Cette vulnérabilité découle de SAXS étant une technique de calcul de la moyenne, ce qui signifie que l’homogénéité de l’échantillon est essentielle à la réalisation des résultats fiables et reproductibles. Tout échantillon qui doit être analysé par SAXS subisse, par conséquent, plusieurs méthodes de purification et des contrôles d’homogénéité, comme dénaturation et native d’électrophorèse, chromatographie d’exclusion, diffusion, de la lumière dynamique et analytique ultracentrifugation. Souvent, ces faisceaux SAXS fonctionnera échantillons par chromatographie liquide à haute performance comme un contrôle de qualité final étape avant SAXS (S-SAXS)^3,9. SAXS données doivent être recueillies à des concentrations multiples et les R_g de chaque ensemble de données doivent être comparées, assurant une similitude étroite pour éviter les interactions interparticulaires et agrégation, qui se traduit par une surestimation de la particule Dimensions, conduisant à l’analyse des données inexactes et de modélisation. Puisque la diffusion dépend de la concentration et la taille, macromolécules plus petits peuvent nécessiter une optimisation plus spécifique de la gamme de concentration. Cela est dû au Théorème de réciprocité, où grandes tailles se dispersent vers les petits angles et petites tailles vers grands angles. Cela se manifeste dans la collecte de données, où j’ai_O est proportionnelle à R⁶, où R est le rayon de la particule. Une limitation définitive de SAXS est le risque de dommages de rayonnement à l’échantillon pendant l’exposition, ce qui peut conduire à une distorsion des données. Il est conseillé de comparer la qualité des échantillons avant et après exposition échantillon SAXS pour s’assurer que cela ne se produit pas.

Protocol

1. SAXS préparation des échantillons et Acquisition de données

1. Préparation de l’échantillon :
   1. SAXS expériences nécessitent des échantillons homogènes, stables et non concentration protéique ; observer la stabilité et l’État oligomère par chromatographie d’exclusion (S), DLS et/ou des AUC avant la collecte de données.
   2. Soumettre des échantillons (nidogene-1 et la laminine γ-1 dans le cas présent) à l’analyse DLS et tricine SDS-PAGE pour visualiser des exemples de pureté¹⁰.
      NOTE : Les échantillons peuvent couvrir une gamme de concentrations (1-4 mg/mL) en fonction de leur taille, leur comportement de la solution comme auto-association et agrégation ainsi que de la stabilité ; ici, cinq concentrations de nidogene-1, (139 kDa), trois de laminine γ-1 (109 kDa) et quatre du complexe équimolaire purifié S ont été préparés comme décrit précédemment¹⁰.
2. Collecte de données :
   1. Collecter les données SAXS en utilisant un système interne ou un synchrotron, conformément aux directives du fabricant ou d’une installation.
      NOTE : Les données utilisées dans ce travail ont été recueillies à l’aide d’un système interne (voir Table des matières) qui contient un appareil à sténopé-3 équipé + 002 microfocus tube scellé (rayonnement de Cu Kα à 1,54 Å) et confocale Max-Flux (CMF) optique fonctionnant à 40 w. Le système est également équipé d’un détecteur 2D 200 nm multifils de collecte de données. Cependant, avec la disponibilité des synchrotrons modernes en France, Allemagne, UK, USA et autres pays, qui donnent accès à un montage S-SAXS qui facilite la séparation d’une préparation monodisperses d’agrégation/détérioration possible, nous avons maintenant régulièrement recueillir des données dans les installations de rayonnement synchrotron. Un article paru récemment sur un ADN G-quadruplexe¹¹ est un exemple d’une stratégie de collecte de données S-SAXS. Dans ce cas, SAXS sont collectées dans la gamme de 0,08 ≤ q ≤ 0,26 Å pendant 3 heures pour nidogene-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 et 4,0 mg/mL) ; la laminine γ-1 (1,5, 2,0 et 2,5 mg/mL) et son complexe (0.8, 1.0, 1,25 et 1,5 mg/mL).
   2. Réduire les données de mémoire tampon et des échantillons à l’aide de logiciels de traitement spécifiques au système. Soustraire la contribution de la mémoire tampon de données de protéine à l’aide d’un programme comme PRIMUS/qt¹² (Figure 2 a).

2. analyse des données

Remarque : Actuellement, il existe quelques paquets de logiciels qui sont utiles pour l’analyse des données SAXS : ScÅtter⁴³ (téléchargement disponible sur www.bioisis.net), bioXtas RAW⁴⁴et le ATSAS suite¹³. Cette section fournit un aperçu des étapes générales à prendre lors de l’analyse SAXS brut de données à l’aide de la ATSAS programme suite et des mesures spécifiques sont tirées de la ATSAS 2.8.1 Télécharger. Autres programmes peuvent être utilisés et sont brièvement discutés plus tard.

1. Soustraction de tampon
   Remarque : Ces étapes sont pertinents pour les échantillons SAXS statiques uniquement.
   1. Sélectionnez l’option de menu « Ouvrir » dans PRIMUS/qt et sélectionnez les fichiers de données d’intérêt. Sachez que les fichiers de données doivent être au format ASCII, dans lequel la première colonne est l’axe s-vecteur et la deuxième colonne est l’intensité. Répétez cette étape pour les données collectées pour le tampon lui-même en introduisant ces données dans le même menu.
   2. Sélectionnez « Soustraction » dans la fenêtre de traitement de données, qui va générer une courbe de diffusion soustraite représentant seulement de diffusion de la macromolécule d’intérêt. Répétez cette étape pour chaque concentration.
2. Analyse de Guinier
   1. Pour effectuer une analyse de Guinier, charger une courbe de dispersion de tampon soustraite dans PRIMUS/qt comme décrit précédemment à l’étape 2.1.1.
   2. Cliquez sur « Rayon de giration » qui procèdera à l’ouverture de l’Assistant de Guinier Primus ; un tracé de ln(I) vs q² s’affiche.
   3. Pour obtenir un préliminaire R_g utiliser la fonction « AUTORG », qui est un module externe intégré à PRIMUS/pintes trouver le bouton « Autorg » et cliquez dessus.
   4. Entrée de plusieurs fichiers à la fois en sélectionnant toutes les, puis en les insérant dans le menu sur le côté droit, très similaire à 2.1.1.
   5. Utiliser l’intrigue de Guinier créée précédemment afin d’évaluer la qualité des données ; la ligne verte sous l’intrigue de Guinier représente l’intrigue de résidus représentant une linéarité de la fit. Sachez que la non-linéarité dans l’analyse de Guinier pourrait être un signe d’agrégation de l’échantillon et une analyse plus approfondie ne devrait pas être effectuée en l’espèce.
      Remarque : Un ajustement linéaire de Guinier donne un R_g avec une petite erreur (< 5 %) et suggère un échantillon de haute qualité.
3. Kratky analyse
   1. Charger les données à visualiser de manière similaire comme décrit ci-dessus.
   2. Cliquez sur la case « sélectionner » en regard du nom de fichier de données. Ceci pour tracer les données dans une fenêtre séparée.
   3. Cliquez sur le bouton de « Complot » suivi par la sélection de « Complot Kartky » dans le menu déroulant.
   4. Ceci pour tracer les données «q² x L(q) vs q». Sachez que les protéines globulaires présentent un pic gaussien, tandis que les protéines non repliées affiche un plateau au lieu d’un pic et ressemblent à une intrigue hyperbolique¹⁷.
4. Fusion de données
   1. Tampon de charge soustraite des données pour chaque concentration PRIMUS/PTE une fois de plus, comme au point 2.1.1.
   2. Pour fusionner les données, il suffit de cliquer sur le bouton « Fusionner » dans la fenêtre de traitement.
   3. Inspectez chaque courbe et l’I sur la graduation, qui correspond à la dilution effectuée sur l’échantillon original.
      Remarque : Les échantillons à concentration élevée affichent moins de bruit dans la région de la queue des courbes.
5. Distribution de p (r)
   1. Pour générer l’intrigue de p (r), chargez les courbes de données fusionnées dans PRIMUS/qt comme décrit précédemment.
   2. Cliquez sur le bouton « Distance Distribution » pour ouvrir une nouvelle fenêtre présentant les données fusionnées de l’intensité des épars lumière vs q pair-distance distribution fonction tracé sur le côté droit.
      NOTE : Les informations sur la partie droite présente la qualité globale des calculs de fonction de distribution de distance de la paire.
   3. Ajuster la plage de données des données fusionnées afin d’éviter tout bruit important à la fin des données brutes.
   4. Omettre des points de données près de l’arrêt de faisceau dans la région de basse-q.
   5. Pour déterminer le début D_max, avec une gamme de ~ 5 fois la R_g tirés de l’analyse de Guinier. Réduire progressivement cette valeur jusqu'à ce que l’intrigue de p (r) ne tombe pas brusquement à zéro sur l’axe y et n’est pas un long-tail avant proche de zéro.
   6. Vérifier que l' expérimental R_g/j’ai₀ (dérivé de Guinier rapprochement) et P(r) R_g/j’ai₀nombres sont similaires.
      Remarque : Dans certains cas, plus la manipulation sur la plage de données points de données et ALPHA (un paramètre de régularisation qui indique au programme le ratio de combien d’attention à la douceur de la distribution par rapport à l’ajustement des données expérimentales) est également requis²¹ pour obtenir une parcelle de P(r) de bonne qualité.

3. une perleb initio modélisation et une moyenne de

1. Une fois les données collectées à des concentrations plusieurs sont fusionnées, ou les données recueillies à l’aide de S-SAXS sont réduite au minimum, et l’intrigue Kratky, la P(r) terrain et l’analyse de Guinier ont été vérifiées, calculer des structures des macromolécules et leurs complexes. Ce pipeline peut être utilisé pour étudier les structures de la solution et les interactions des acides nucléiques, protéines et acides nucléiques-protéines ou protéines complexes^{10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,},³⁴. L’un des programmes plus populaires est DAMMIN, mis au point par Svergun³⁵ et une partie des ATSAS paquet¹³, qui emploie des protocoles recuits simulés avec des informations d’entrée préliminaires sur R,_g et D_max . Les approches de modélisation ab initio et les principes sont décrits en détail ailleurs^18,36.

Results

L’approche de l’analyse de données décrite ci-dessus a été utilisé pour calculer le R,_g et D_max pour nidogene-1, laminine γ-1 et leur complexe avec la fonction P(r). Nous avons obtenu les valeurs R,_g 7.20 (±0, 10) nm, 8.10 nm (±0.20) et 10,9 nm (±0. 4) pour nidogene-1, laminine γ-1 et leur complexe respectivement (Figure 2 a-B). En outre, les valeurs D_max de 24 nm, 26 nm et 35 nm pour nidogene-1, laminine γ-1 et leur complexe respectivement (Figure 2)¹⁰ ont été obtenus. Le programme DAMMIF a été utilisé pour obtenir des structures basse résolution du nidogene-1 et laminine γ-1, ce qui suggère que les deux protéines adoptent une forme élargie en solution. Les valeurs de X et NSD pour nidogene-1 (~ 1 et 0,8) et de la laminine γ-1 (~0.9 et 0,8 respectivement) ont été également dans la plage acceptable. L’alignement des structures à haute résolution, deux domaines du nidogene-1 et deux de laminine γ-1, sur leurs structures de basse résolution obtenue à l’aide de SAXS ont permis l’identification de leurs régions de N - et C-terminal¹⁰.

Nidogene-1 a été identifié comme un partenaire qui interagissent de laminine γ-1^39,40 , et le site d’interaction a été cartographié à l’aide de la diffraction des rayons x au C-terminal domaines⁴¹. Toutefois, les structures à haute résolution n'assurent que des domaines interdépendants et pas le nidogene-1 pleine longueur ou le bras de γ-1 ensemble de laminine. Par conséquent, nous avons purifié un complexe contenant nidogene-1 (intégral) et la laminine γ-1 bras pour identifier les régions qui interagissent ainsi étudier l’orientation relative des domaines N-terminale des deux protéines. Les données SAXS du complexe ont donné un R_g de 10,9 (± 0,4) nm et un D_max de 35 nm. Nous avons utilisé MONSA pour obtenir la structure basse résolution de l’ensemble du complexe, qui a suggéré qu’en effet, seule la région C-terminale des deux protéines participer dans la médiation des interactions, tandis que le reste des domaines sont éloignés entre eux ( Figure 3, vidéo 1).

Figure 1. Schémas de configuration SAXS. Une préparation monodisperses de biomolécules ou leurs complexes est préparée, suivie d’une exposition aux rayons x de haute énergie. Selon la source (p. ex., interne vs synchrotron), l’énergie des rayons x et l’échantillon à distance de la source peut varier. Modèle de diffusion des rayons x (qui dépend de la taille et la forme des biomolécules) est enregistré et radialement moyenne pour obtenir une parcelle 1 dimension (1D) qui contient des informations sur l’intensité de la lumière diffusée par rapport à l’angle de diffusion. Comme les molécules de tampon aussi éparpiller lumière, les contributions de ces molécules sont soustraites pour obtenir un modèle de diffusion de la biomolécules d’intérêt. Le synchrotron, avant la collecte de données SAXS, une étape de purification supplémentaire à l’aide de la chromatographie d’exclusion/haute performance en ligne s’effectue généralement aussi (vue de dessus). Cette étape est essentielle pour supprimer n’importe quel produit agrégée et/ou dégradée ainsi quant à supprimer des biomolécules indépendant du complexe. L’intrigue de diffusion 1D est converti à l’intrigue de distribution de paire d’électron-distance (parcelle deP(r)), qui fournit le rayon de giration et la dimension maximale des particules de biomolécules. Ce complot est utilisé comme fichier d’entrée pour les ab initio modélisation des paquets (c'est-à-dire, DAMMIN/DAMMIF) pour obtenir des structures basse résolution de biomolécules, ou d’autres paquets (c.-à-d., SASREF/CORAL) si la structure à haute résolution des parties de les biomolécules ou des biomolécules individuelles du complexe sont connus.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. (A) un terrain d’une intensité d’épars léger par rapport à l’angle de diffusion (q = 4πsinθ/λ, nm^-1) ce qui suggère la qualité des biomolécules (région du basses) et la forme (haute région) des biomolécules. (B) la répartition des paires d’électrons-distances P(r) déterminée à partir des données de diffusion suggèrent une forme allongée de biomolécules incriminés (laminine γ-1, nidogene-1 et son complexe). (C) Kratky intrigue suggérant que nidogene-1 et laminine γ-1 protéines ne sont pas dépliés. (D) terrain de Guinier nidogene-1, laminine γ-1 et leur complexe, ce qui indique la région linéaire pour la détermination du rayon de giration en utilisant les données à angle faible diffusion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Structure basse résolution du complexe de nidogene-1 et laminine γ-1 obtenu par l’analyse des ensembles de données fusionnées en utilisant le programme MONSA. Le jeu de couleurs est identique à la Figure 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1. La structure basse résolution du nidogene-1 et la laminine complexe γ-1. Ce film a été préparé utilisant PYMOL pour visualiser diverses caractéristiques structurales de l’immeuble. La structure cristalline du complexe laminin-nidogene (PDB ID : 1NPE) est représenté comme dessins animés de ruban, mettant en évidence l’interaction des sites pour ce complexe. Le jeu de couleurs est identique à la Figure 2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

Les étapes cruciales d’analyse de données SAXS décrites dans la section protocole de cette soustraction de tampon papier include, Guinier analyse, analyse Kratky, fusion de données et distribution p (r). La modélisation de perle ab initio est trop vaste pour être traité ici de manière détaillée et est par conséquent ne concernait que brièvement.

À synchrotrons (p. ex. DESY en Allemagne, diamant au Royaume-Uni et Fee en France), il est possible de collecter des données SAXS pour une fraction infime (~ quelques µL) de chaque échantillon sous la forme de fractions sont été éluée de la colonne de s qui est connecté en ligne (voir Figure 1 de ). Les données SAXS élastiquement éparses sont radialement en moyenne en utilisant les paquets fournis par le fabricant de l’instrument ou le synchrotron avant soustraction de tampon puisse avoir lieu. Les données résultantes de 1D représentent la quantité de lumière diffusée (dans j’ai(q)) sur Y-axe et un angle de diffusion (q= 4πsinθ/λ où λ est la longueur d’onde incident X-rays) et est décrite à la Figure 1. Le programme PRIMUS/qt¹² sert à soustraire directement n’importe quel fond en raison de la mémoire tampon et est décrit à l’article 1.1. Autres programmes tels que ; ScÅtter⁴³ (téléchargement disponible sur www.bioisis.net) avec un tutoriel disponible sur https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAet bioXtas RAW⁴⁴ (https:// disponible à bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) peut être utilisé comme une alternative au package ATSAS.

L’analyse de Guinier fournit des informations sur l’agrégation de l’échantillon et homogénéité ainsi que le rayon de giration (R_g) prévoyant de la macromolécule d’intérêt basée sur les données SAXS de la région de faible s ¹⁴. Une parcelle est construite avec PRIMUS/qt pour données SAXS obtenues de chaque concentration, suivie de la courbe avec la portée maximale de jusqu'à 1,30 pour q x R_g. Une préparation de l’échantillon monodisperses devrait fournir un tracé linéaire de Guinier dans cette région (Figure 2D), alors que les résultats d’agrégation dans une Guinier non linéaire tracer^15,16. Si l’analyse de Guinier est linéaire, le degré de « unfoldedness » d’une macromolécule d’intérêt peut être observé avec l’intrigue de Kratky, ce qui est utile pour savoir s’il faut effectuer la modélisation des corps rigides ou de construire des ensembles de modèles basse résolution. Une protéine globulaire apparaîtra dans un Kratky tracer d’avoir une courbe en forme de cloche, alors que l’étendue des molécules ou des peptides dépliés apparaîtra à plateau ou même augmenter dans la plus grande gamme de q et n’ont pas la forme de cloche (Figure 2).

Obtenir le R_g Guinier analyse considère uniquement les points de données de la région de faible q de l’intrigue de nuages de points XY 1D (Figure 2D), cependant, il est possible d’utiliser presque le dataset entier pour effectuer une transformation de Fourier indirecte pour convertir les informations de l’espace réciproque de ln (I (q)) vs (q) dans une fonction de distribution de distance de l’espace réel (P(r)) qui fournit des informations sur D_max et R_g (Figure 2 b) La forme de la courbe P(r) représente la conformation de la solution brute de la macromolécule d’intérêt^18,19. la conversion des données de l’espace réciproque aux données de l’espace réel est une étape cruciale, mais une description détaillée n’est pas dans le cadre du présent document. Par conséquent, se référer à un article par Svergun²⁰ pour comprendre chaque paramètre.

Une fois soustrait de la mémoire tampon de données à des concentrations individuelles sont traitées par Guinier analyse avec une valeur cohérente pour R,_g, suivie en enquêtant sur leur modèle pliant en utilisant l’analyse Kratky, ces données peuvent être fusionnées. Les données fusionnées pour nidogene-1, laminine γ-1 et leurs complexes ont été traitées comme indiqué ci-dessus et le p (r) résultant des parcelles sont présentées dans la Figure 2 b. Idéalement, on devrait également calculer la fonction de distribution de distance de la paire p (r) pour chaque concentration afin de déterminer si les données SAXS recueillies pour chaque concentration offrent similaire R_g D valeurs et _max . Si les R_g et D_max restent similaires sur une large gamme de concentrations, l’utilisateur doit procéder. Il est à noter que selon le signal, des données peuvent être tronquées avant la fusion de données. C’est souvent le cas si les concentrations et/ou le poids moléculaire des macromolécules incriminé est faible.

Analyse de la forme basse résolution à l’aide de DAMMIN peut être réalisée dans différents modes (par exemple rapide, lent, modes Expert, etc.). Le mode rapide est un premier pas idéal pour évaluer si l’intrigue de p (r) fournit des modèles de bonne qualité. En règle générale, au moins 10 modèles doivent être obtenues pour chaque parcelle de p (r) vérifier si des résultats reproductibles, en ce qui concerne la structure basse résolution, sont obtenues, avec une bonté faible du paramètre fit appelé χ (une valeur de 0,5-1,0 est considérée bonne basé sur nos travaux d’envergure ), une valeur qui décrit un accord entre les données SAXS expérimentalement collectées et données modélisée. À des fins de publication, nous avons généralement utilise le mode Slow ou Expert et calculer au moins 15 modèles. En plus de DAMMIN, une version plus rapide de l’il, DAMMIF³⁷, ainsi que GASBOR³⁸ sont également des solutions de rechange. En outre, afin d’étudier les protéines ou complexes acides nucléiques-protéines, il est possible d’utiliser le MONSA programme³⁵, qui facilite le montage simultané des données SAXS individuelles pour les macromolécules ainsi que leur complexe. Pour plus de détails sur les calculs du modèle haute résolution ainsi que pour les études d’interactions ARN-protéine, se référer à un article récent de Patel et al.³.

SAXS est théoriquement simple mais sans aucun doute une méthode très complémentaire à d’autres outils de la biologie structurale et les résultats en basse résolution données structurales qui peuvent être utilisées seul ou en conjonction avec des techniques à haute résolution pour élucider les informations sur la structure macromoléculaire et dynamique. Tant qu’une préparation monodisperses de macromolécules et de leurs complexes peut être obtenue, SAXS peuvent être utilisés pour étudier la structure en solution et les interactions de n’importe quel type de macromolécule biologique. Dans le cas du complexe discuté ici, il est remarquable que moins de 10 % de la surface accessible dans l’ensemble de l’azote-1 et de la laminine γ-1 est enterré dans ce complexe, tandis que le reste des domaines des deux protéines sont librement accessibles pour interagir avec les autres protéines de la matrice extracellulaire de conserver sa rigidité structurelle (Figure 3). Obtenir ces informations pour un complexe avec ~ 240kDa serait très difficile à l’aide d’autres techniques de biologie structurale comme la cristallographie aux rayons x, RMN et microscopie de Cryo-EM.

Découvrir la structure des protéines par cristallographie aux rayons x ou NMR est un processus intrinsèquement long. Ce goulot d’étranglement dans la détermination de la structure est un domaine où les SAXS montre sa force comme une technique structurelle ; acquisition de données pour une seule expérience SAXS peut prendre moins d’une heure et avec l’aide du logiciel d’analyse simplifiée, analyse peut se faire rapidement et efficacement. SAXS a le potentiel d’accroître considérablement le débit des études structurales comme technique autonome car il offre un modèle basse résolution de la structure macromoléculaire avant que des données à haute résolution sont disponibles. Un obstacle à d’autres techniques structurelles est la condition pour un échantillon extrêmement pur et concentré d’acquisition de données, ce qui nécessite un haut niveau d’expression de la protéine et de la stabilité sur une longue période de temps. Tandis que SAXS échantillons aussi besoin d’être pur et concentré, le volume des échantillons est à peu près 100 µL faisant SAXS une méthode relativement peu coûteuse d’analyse par rapport aux autres techniques structurelles. En outre, SAXS, couplée à la chromatographie d’exclusion est multiplient qui prévoit une étape supplémentaire de contrôle qualité. Récemment il y a eu de fortes avancées dans la combinaison des données RMN et SAXS à l’aide de la méthode d’optimisation Ensemble (MOE)^45,46 pour élucider les systèmes flexibles. Dans un article récent de Mertens et Svergun⁴⁷, les auteurs décrivent plusieurs exemples récents de EOM SAXS en combinaison avec la RMN, ainsi que de nombreux autres exemples de données SAXS utilisées en conjonction avec la RMN. Avances sont continuellement déployés dans le domaine de SAXS, et nouvelles techniques sont développées pour SAXS à être utilisé en conjonction avec, pas juste gratuit à, d’autres techniques structurelles. Par conséquent, nous pensons que la demande de SAXS ne fera qu’augmenter au fil du temps, surtout en conjonction avec la RMN pour caractériser les systèmes dynamiques où les fonctions sont définies par la flexibilité.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK 293 EBNA Cell Line	Disponibilité en	laboratoire-Lignée	cellulaire utilisée pour surexprimer la ou les protéinesNi
Sepharose Résine de purification de protéines haute performance marquée à l’histidine	GE Healthcare	17524801	Résine de purification de protéines d’affinité
Superdex 200 Increase 10/300	GE Healthcare	28990944	SEC Column
Ä ; KTA Pure FPLC	GE		Healthcare-FPLC
System Nanodrop	Nanodrop-Spectrophotometer
Réactifs de base (NaCl, Tris-HCl, etc.)
S-MAX3000			Rigaku-SAXS Système de caméra à sténopé
Zetasizer Nano-S	Malvern Instruments	Ltd-Instrument	de diffusion dynamique de la lumière
0.1µ ; m Filtre	Millipore	JVWP04700	Utilisé pour concentrer l’échantillon avant DLS
Kit de clivage de la thrombine	abcam	ab207000	Clivage de la thrombine pour enlever son marqueur Strep-Tactin
Sepharose Column	IBA	2-1201-010	Purification d’affinité streptococcique
D-desthiobiotin	Sigma-Aldrich	533-48-2	Élution de la protéine de marqueur streptocoque
< forte> Software
SAXGUI	Rigaku-Collecte	de	données pour SAXS et réduction de données
ATSAS Suit	Franke et al., 2017-SAXS		Analyse de données Suite logicielle
PRIMUS	Konarev et al., 2003-Buffer		Subtraction
GNOM	Svergun, 1992-Rg		, Dmax et p(r)
DAMMIF	Franke et Svergun, 2009	-	Ab initio calcul du modèle
DAMAVER	Volkov et Svergun, 2003-Calculs		de conformation de la solution moyenne
MONSA	Svergun, 1999-Ajustement		simultané du modèle pour le complexe
GASBOR	Svergun et al., 2001	-	Calculs alternatifs du modèle Ab initio
DTS Software V6.20	Malvern Instruments	Ltd-DLS	a fourni le logiciel d’instrument
PyMOL	Schrödinger, LLC.	-	Le système de graphiques moléculaires PyMOL V2.0
La banque de données sur les protéines	Berman et al., 2000-ID		PDB : 1NPE