Analyse numérique de l'immunostaining de ZW10 Interagir les protéines dans les tissus pulmonaires humains

Résumé

La protéine interagissante ZW10 (ZWINT) participe au point de contrôle mitotique de fuseau et à la pathogénie du carcinome. Ici, nous introduisons une méthodologie de l'immunostaining de ZWINT dans les tissus humains de cancer du poumon, suivie de la numérisation numérique des diapositives entières et de l'analyse d'image. Cette méthodologie peut fournir des images numériques de haute qualité et des résultats fiables.

Résumé

Le but de cette étude est d'introduire une méthodologie de l'immunostaining des tissus pulmonaires humains, suivie d'une analyse numérique et d'une analyse d'images. La numérisation numérique est un moyen rapide de numériser une pile de diapositives et de produire des images numériques de haute qualité. Il peut produire des résultats concordants avec la microscopie lumineuse conventionnelle (CLM) par des pathologistes. En outre, la disponibilité d'images numériques permet que la même diapositive peut être observée simultanément par plusieurs personnes. En outre, les images numériques des diapositives peuvent être stockées dans une base de données, ce qui signifie que la détérioration à long terme des diapositives en verre est évitée. Les limites de cette technique sont les suivantes. Tout d'abord, il a besoin de tissus préparés de haute qualité et l'immunohistochimie originale (IHC) glisse sans aucun dommage ou résidu de scellant excédentaire. Deuxièmement, les secteurs de tumeur ou nontumor devraient être spécifiés par les pathologistes expérimentés avant l'analyse utilisant le logiciel, afin d'éviter n'importe quelle confusion au sujet de la tumeur ou des secteurs nontumorpendants pendant la notation. Troisièmement, l'opérateur doit contrôler la reproduction des couleurs tout au long du processus de numérisation dans l'imagerie de diapositives entières.

Introduction

ZW10 protéine d'interaction (ZWINT) est un composant nécessaire du complexe kinetochore qui est impliqué dans le point de contrôle de fuseau mitotique^1,2,3. Il a été rapporté que l'épuisement de ZWINT conduit à la ségrégation prématurée aberrante de chromosome^1,2,3. Des études récentes ont suggéré que ZWINT est impliqué dans la pathogénie des tumeurs multiples en favorisant la prolifération des cellules tumorales^4,5. Nous avons précédemment rapporté la surexpression de ZWINT dans le cancer du poumon⁵. Il a été largement admis que l'analyse des diapositives par les pathologistes utilisant CLM est longue et non quantitative^6,7,8_. En outre, la détérioration des glissières en verre stockées pourrait rendre impossible de rétracter les diapositives précédemment créées. La nouvelle méthode d'imagerie numérique à glissière (WSI) par ordinateur peut surmonter ces limites^6,7,8.

À cette fin, nous décrivons une méthodologie de l'immunostaining de ZWINT dans les tissus humains de cancer du poumon, couplée à la numérisation numérique de glissement entier et à l'analyse d'image basée sur le logiciel. Le principal avantage de cette méthodologie est la production de résultats concordants avec CLM. Cette technologie peut être largement utilisée dans les domaines de la notation pathologique de la coloration de l'hématoxylin-éosine (H et E) et IHC, de la fluorescence in situ hybridation (FISH), des microréseaux tissulaires (TMA) et de la découverte et du développement de médicaments.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'hôpital Zhongnan de l'Université de Wuhan et l'hôpital Renmin de l'Université de Wuhan.

1. Préparation des diapositives IHC

1. Fixez l'échantillon de tissu pulmonaire en immergeant le fragment de tissu pulmonaire humain (environ 3 x 3 cm) dans 4 % de paraformaldéhyde dans de la saline tamponnée de phosphate (PBS) pendant 24 h à température ambiante (RT).
2. Déshydrater le tissu en 80 %, 95 % et 100 % d'éthanol pendant 15 min, 20 min et 20 min, respectivement, à température ambiante. Enfin, immerger le tissu dans 100% xylène 3x pendant 20 min chacun à température ambiante.
3. Pour l'incorporation, immerger le tissu dans la paraffine (63 oC) pendant 30 min. Changer la paraffine et replonger le tissu pendant 45 min. Enfin, changer la paraffine à nouveau et immerger le tissu en elle pendant 1 h supplémentaire.
4. Utilisez un microtome rotatif pour couper le tissu en sections de 5 m d'épaisseur et placez-les sur des lames de 20 g/mL recouvertes de polylysine.
5. Pour le déwaxing, placer les lames dans un four à 65 oC pendant 2 h, puis plonger les sections dans du diméthylbenzène pendant 15 min, puis tremper dans 100% xylène pendant 15 min.
6. Hydratez les lames avec les sections de tissu 2x pour 5 min dans 100% d'éthanol, suivies d'un traitement avec l'éthanol dilué en série de 5 min dans 95% d'éthanol, 5 min dans 80% d'éthanol, 5 min dans l'éthanol de 70% et 5 min dans 50% d'éthanol.
7. Effectuer la réparation de l'antigène.
   1. Diluer le liquide de réparation d'acide citrique (20x) à 1x avec H₂O à double distillation (ddH₂O).
   2. Placez les glissières avec les sections de tissu et le liquide de réparation d'acide citrique 1x (300 ml) dans une boîte de réparation d'antigène et, puis, chauffez-les dans le four à micro-ondes à puissance élevée pendant 2 min, suivi par le chauffage à basse puissance pour maintenir l'ébullition pendant 6 min.
   3. Laisser refroidir les sections naturellement à température ambiante.
   4. Remplacer le liquide de réparation d'acide citrique par 0,01 M PBS, laver les sections 3x, chaque fois pendant 5 min, dans le shaker rotatif à température ambiante.
8. Éliminez la peroxidase endogène.
   1. Diluer 30% de H₂O₂ à 3% avec le ddH₂O, l'ajouter aux lames (assurez-vous qu'il couvre tous les tissus), et incuber les diapositives dans une boîte humide à température ambiante pendant 30 min.
      Note: La boîte humide est une boîte en plastique de 10 x 15 cm et peut contenir de l'eau.
   2. Laver les diapositives 3x, chaque fois pendant 5 min, avec 0,01 M PBS dans le shaker rotatif à température ambiante.
9. Bloquez l'antigène non spécifique.
   1. Diluer le sérum de chèvre normal concentré à 10% sérum de chèvre avec PBS avec 0.1% Tween 20 (PBST).
   2. Ajouter 10 % de sérum de chèvre sur les lames et les incuber dans la boîte humide à 37 oC pendant 30 min.
      Remarque : Le sérum de chèvre doit couvrir tous les tissus des diapositives.
10. Tachez les tissus.
    1. Incuber les toboggans avec des anticorps anti-ZWINT anti-humains de lapin (1:50) à 4 oC pendant la nuit.
    2. Laver les toboggans 3x, à chaque fois pendant 5 min, avec 0,01 M PBST (1 ml de 0,1% de tween 20 dans 1000 mL PBS) dans le shaker rotatif à température ambiante.
    3. Incuber les diapositives avec des anticorps secondaires (système de détection anti-lapin, 1:200) pendant 30 min à 37 oC.
    4. Laver les diapositives 3x, chaque fois pendant 5 min, avec 0,01 M PBST dans le shaker rotatif.
11. Pour visualiser l'immunostaining, ajouter les diapositives à 300 l de 3,3-diaminobenzidine fraîche et, ensuite, laver les diapositives avec de l'eau du robinet à température ambiante.
    Remarque : Le degré de teinture est surveillé au microscope (grossissement 10X - 40X).
12. Contre-tache du tissu. Tainer les diapositives avec une solution de coloration à l'hématoxyline pendant 2 min à température ambiante, puis laver les lames avec de l'eau du robinet pendant 15 min.
    Note: Le noyau apparaît bleu sous le microscope (magnification 10X - 40X). Si le degré de coloration bleue est plus puissant, la différenciation de l'alcool chlorhydrique pour 3 - 5 s peut être utilisée, suivie par le rinçant le tissu à l'eau du robinet pendant 15 min pour faciliter la coloration proéminente du tissu.
13. Déshydrater les lames pendant 5 min dans 50% d'éthanol, 5 min dans 70% d'éthanol, 2x dans 80% d'éthanol pour 5 min, 5 min dans 95% d'éthanol, et enfin, 2x pour 5 min chacun dans 100% d'éthanol à température ambiante.
14. Par transparence, immerger les sections de tissu dans un réservoir contenant 100% de xylène pendant 15 min et transférer les sections dans un autre réservoir contenant 100% de xylène pendant 15 min à température ambiante.
15. Pour l'étanchéité, prendre 50 à 100 l de gomme neutre et ajouter 5 % de xylène au mélange (éviter de mélanger dans des bulles). Ajouter 15 ll du mélange mentionné ci-dessus aux sections des tissus pulmonaires. Scellez le film avec du verre de couverture et appuyez doucement sur les bulles.

2. Numérisation automatique de glissières entières des diapositives IHC

1. Laisser sécher les lames scellées pendant 12 h à température ambiante pour les dessécher.
2. Sélectionnez l'option de champ Bright manuellement et entrez l'interface de numérisation manuelle.
3. Réviser le nom des diapositives et sélectionner un chemin de stockage pour les images.
4. Définir la zone de numérisation et choisir l'option Scan échantillons en utilisantdes seuils fixés par l'utilisateur . Le seuil est d'environ 50 avec une valeur d'expansion de la zone de numérisation de 200 m.
5. Définir la valeur de mise au point de numérisation, sélectionner la mise au point automatiquement — elle varie de 1050 à 2650 — et enfin, sélectionnez mode à une seulecouche.
6. Chargez les glissières IHC sur le poste de travail et démarrez la numérisation automatique.
   Remarque : Assurez-vous que les glissières ne sont pas endommagées. Garder les glissières propres et translucides et éviter la poussière, les confettis et l'excès de résidus d'étanchéité sur les lames. La glissière en verre et la glissière de couverture doivent être dépourvues de marques. Ne pas nettoyer les diapositives avec du xylène. La taille des diapositives est donnée dans le tableau 1.
7. Scannez automatiquement toute la section tissulaire sur une diapositive avec un grossissement 20X, 40X ou 100X.
8. Recueillir et stocker les images à la fin de la numérisation de diapositives entières.

3. Analyse des diapositives par logiciel d'imagerie

1. Démarrer le logiciel d'analyse d'image histopathologique et sélectionnez ordinateur local.
2. Ouvrez le fichier qui stocke les données de numérisation.
3. Sélectionnez le niveau de zoom approprié de la plage 2X à 40X.
4. Ajuster la couleur pour définir le contraste optimal via Toggle couleur ajuster.
5. Encerclez manuellement et nommez les parties d'intérêt sur chaque image.
   Remarque : Par exemple, vous pouvez encercler une zone et la nommer zone tumorale.
6. Sélectionnez Plugins et QC. À ce moment, le constructeur de scénarios apparaît.
7. Sélectionnez Quant de densité et ajustez la barre de détection.
   Remarque : Ce processus doit être effectué avec soin. La barre de tolérance bleue est utilisée pour ajuster la couleur du noyau cellulaire. La barre de tolérance Brown est utilisée pour ajuster la saturation de la couleur de remplissage dans l'image. Les résultats des images après ajustements doivent être compatibles avec les contreparties d'origine.
8. Ajustez les niveaux de score pour rendre l'intensité de coloration des zones encerclées semblable à celle des images originales.
   Note: Brun foncé indique fort positif, jaune brunâtre est modérément positif, jaune clair est faiblement positif, et blanc est négatif.
9. Stockez et nommez le modèle comme fichier. Appliquer le modèle sur d'autres diapositives et sélectionnez L'annotation sélectionnée".
10. Laissez le logiciel calculer automatiquement le score H pour les zones encerclées de l'image.

4. Quantification des scores à l'aide du système de notation H^9,10

1. Calculer le pourcentage d'immunostaining et l'intensité de coloration (0: négatif, 1 ': faible, 2 ': modéré, 3 ': fort).
2. Utilisez un système de notation (H-score) pour calculer la notation pathologique de la tumeur et des zones non tumorales adjacentes.
   Note : H-score (% des cellules avec une faible intensité x 1) (% des cellules à intensité modérée x 2) (% des cellules à forte intensité x 3). Par conséquent, le score H maximum est de 300 si 100% des cellules sont quantifiées avec une forte intensité.

Résultats

Nous avons mesuré les niveaux d'expression de ZWINT dans 28 paires de spécimens de cancer du poumon de non-petite cellule (NSCLC) (tumeur et tissus nontumor adjacents), y compris 14 carcinomes squamous de cellules (SCC) et 14 adénocarcinomes (ADCs), par IHC. La numérisation numérique complète des diapositives a fourni des images numériques de haute qualité (Figure 1A). Les résultats ont montré que le score H du cancer du poumon était significativemen...

Discussion

La numérisation de diapositives entières devient un sujet brûlant pour sa numérisation robuste et la production d'images de haute qualité à des fins cliniques et de recherche^11,12,13. Les images peuvent être produites par des microscopes à balayage en quelques minutes^11,12,13. En appliquant cette méthodologie, nous avons obtenu des imag...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pannoramic MIDI	3D HISTECH	Cat : PMIDI-040709	Un scanner de lames numérique automatisé avec un ensemble de fonctionnalités remarquables :capacité de 12 lames, balayage par fluorescence, et bien d’autres.
QuantCenter	3D HISTECH	Téléchargé depuis le site officiel de la société	Le cadre pour les applications d’analyse d’images de 3DHISTCH.
LEICA RM2235	Leica Microsystems	Cat : 14050038604	La précision accrue des nouveaux accessoires ajoutera de la commodité à l’approche du bloc au couteau ainsi que l’orientation de l’échantillon.
Lapin anti-humain Anticorps anti-ZWINT	Abcam	Cat : ab197794	Analyse immunohistochimique de ZWINT dans le tissu pulmonaire humain.
Anticorps secondaire anti-lapin	Wuhan Goodbio Technology	Cat :GB23303-1	Anticorps secondaire pour la coloration IHC.
Solution saline tamponnée au phosphate	Wuhan Goodbio Technology	Cat :G0002	Une solution contenant un tampon de phosphate.
OLYMPUS CX23	OLYMPUS	Cat :6M87620	Microscope pour la détection de H& Glissières E ou IHC.
Diméthylbenzène	Shanghai Lingfeng Réactif chimique	Cat :1330-20-7	Un fluide incolore et inflammable utilisé comme solvant et agent clarifiant dans la préparation de coupes de tissus pour l’étude microscopique.
Solution de coloration à l’hématoxyline	Wuhan Servicebio technology	Cat :G1039	Il est couramment utilisé pour les études histologiques, colore souvent les noyaux des cellules en bleu.
Tween 20	Baitg	Cat :2005-64-5	Il s’agit d’un tensioactif non ionique de type polysorbate formé par l’éthoxylation du sorbitan avant l’ajout d’acide laurique. Il est utilisé comme dissuasif et émulsifiant dans les applications pharmacologiques.
Liquide de réparation de l’acide citrique	Wuhan Servicebio technology	Cat :G1202	est utilisé pour réparer l’antigène après fixation pendant la procédure IHC.
LEICA ASP200s	Leica	Cat : 14048043626	Il a été conçu pour l’histopathologie de routine et de recherche jusqu’à 200 cassettes.
LEICA Arcadia H	Leica	Cat : 14039354103	Il s’agit d’une station d’enrobage de paraffine chauffée qui permet une utilisation simple et un contrôle précis, ce qui se traduit par une qualité améliorée, un flux de travail fluide et une fiabilité.
LEICA Arcadia C	Leica	Cat : 14039354102	Il s’agit d’une plaque froide contenant plus de 60/65 cassettes sur sa grande surface de travail. Il a été conçu avec un module de contrôle adaptatif à l’environnement pour s’assurer que la température de fonctionnement est toujours stabilisée à -6 °C.
Logiciel CaseViewer	3DHISTECH