Capture et Identification des protéines de liaison à l’ARN à l’aide de Click chimie assistée par ARN-interactome Capture stratégie (CARIC)

Résumé

Un protocole détaillé pour l’application de la clic chimie assistée par RNA-interactome capture (CARIC) stratégie pour identifier les protéines liant les deux codage et non codantes RNAs est présenté.

Résumé

Une identification complète des protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives) est essentielle pour comprendre le réseau de régulation post-transcriptionnelle dans les cellules. Une stratégie largement utilisée pour la capture des RBP exploite la polyadénylation [poly (a)] de l’ARN cible, qui se produit principalement sur des ARNm eucaryotes matures, laissant la plupart des protéines liant de non-poly(A) ARN non identifiés. Nous décrivons ici les procédures détaillées d’une méthode récemment appelé clic chimie assistée par RNA-interactome capture (CARIC), qui permet la capture de transcriptome à l’échelle des pratiques commerciales restrictives des poly (a) et non-poly(A) en combinant le marquage métabolique de RNAs in vivo UV réticulation et marquage de bioorthogonal.

Introduction

Le génome humain est transcrite en différents types d’ARN codantes et non codantes (ncRNA), y compris les ARNm, rRNA, ARNt, petits ARN nucléaires (snRNA), petits ARN nucléolaires (ARNpno) et longtemps non-codage RNAs (lncRNAs)¹. La plupart de ces ARN possède des vêtements des pratiques commerciales restrictives et fonction ribonucléoprotéique particules (RNP)². Par conséquent, une identification complète des pratiques commerciales restrictives est une condition sine qua non pour comprendre le réseau de régulation entre les ARN et les pratiques commerciales restrictives, qui est impliqué dans diverses maladies humaines

Protocole

ATTENTION : Quand il y a lieu, les réactifs utilisés doivent être achetés sous forme de RNase-libre, ou dissous dans exempte de RNase, solvants (pour la plupart des cas, au diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-eau traitée). Lors de la manipulation des échantillons d’ARN et de réactifs de RNase-libre, toujours porter des gants et des masques et changez-les fréquemment pour éviter toute contamination de la RNase.

1. préparation du lysat de métaboliquement marqués et UV cellules réticulées

1. Incorporation métabolique de l’UE et 4SU
   1. Cellules HeLa culture dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) ad....

Résultats

Les résultats représentatifs des étapes de contrôle qualité sont présentés. Les résultats incluent des chiffres de l’analyse par fluorescence en gel décrit à l’étape 2.3.2 (Figure 1), l’analyse par transfert western décrit à l’étape 4.1.3 (Figure 2 a) et l’analyse de coloration à l’argent décrite à l’étape 4.2.2 (Figure 2 b). Les mesures de contrôle de la qualité sont essentiels pour l’optimisation d.......

Discussion

La préservation de l’intégrité de RNA juste est l’une des clés du succès CARIC expériences. Dégradation de l’ARN peut être significativement réduite avec les ligands appropriés de Cu (i) et opération minutieuse, bien qu’on observe une dégradation partielle. Les ratios de substitution d’UE et 4SU en échantillons expérimentaux sont 1,18 % et 0,46 %, respectivement (données non présentées). Pour ARN intact d’une longueur de 2 000 nt, environ 90 % des ARN contiennent au moins une UE et un 4SU. Pour ARN partiellement dégradés.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
HeLa	ATCC
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11995065
FBS (Sérum de veau fœtal)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Pénicilline & Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122
UE (5-éthynyluridine)	Wuhu Huaren Co.	CAS :69075-42-9
4SU (4-thiouridine)	Sigma Aldrich	T4509
10× ; PBS (Saline Tamponnée au Phosphate)	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Réticulant UV	UVP	CL-1000	Equipé d’une lampe UV 365-nm
DEPC (Pyrocarbonate de Diéthyle)	Sigma Aldrich	D5758	Pour traiter l’eau. Hautement toxique !
Tris· ; HCl, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific	15567027
LiCl	Sigma Aldrich	62476
Nonidet P-40	Biodee	74385
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA	Thermo Fisher Scientific	88265	Un comprimé pour 50 mL de tampon de lyse.
LDS (Dodécylsulfate de lithium)Tube d’ultrafiltration	Sigma Aldrich	L9781
15 mL (coupure 10 kDa)Tube d’ultrafiltration	Millipore	UFC901024
0,5 mL (coupure 10 kDa)	Billes magnétiques Millipore	UFC501096
Streptavidine	Thermo Fisher Scientific	88816
DMSO (sulfoxyde de diméthyle)	Sigma Aldrich	41639
chimie Click	Azide-biotine	AZ104
Sulfate de cuivre(II)	Sigma Aldrich	C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]	Sigma Aldrich	762342
Ascorbate de sodium	Sigma Aldrich	11140
Outils de chimie Azide-Cy5	Click	AZ118
Tampon d’échantillonnage LDS (4× ;)	Thermo Fisher Scientific	NP0008
10 % bis-Tris gel	Thermo Fisher Scientific	NP0301BOX
EDTA	Thermo Fisher Scientific	AM9260G
RNase A	Sigma Aldrich	R6513
SDS (Dodécylsulfate de sodium)	Thermo Fisher Scientific	15525017
NaCl	Sigma Aldrich	S3014
Brij-97 [Polyoxyéthylène (20) oleyléther ]	J& K	315442
Triéthanolamine	Sigma Aldrich	V900257
Streptavidine agarose	Thermo Fisher Scientific	20353
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sel de sodium)	Sigma Aldrich	61743
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Désoxycholate de sodium	Sigma Aldrich	30970
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