Répression de la croissance de cellules de myélome Multiple In Vivo par Nanotube de carbone monoparoi (NCM)-livré MALAT1 oligonucléotides antisens

Résumé

Ce manuscrit décrit la synthèse d’un nanotube de carbone monoparoi (NCM)-conjugué MALAT1 gapmer antisens ADN d’oligonucléotide (SWCNT-anti-MALAT1), qui montre la remise fiable du NCM et le puissant effet thérapeutique de anti-MALAT1 in vitro et in vivo. Méthodes utilisées pour la synthèse, de modification, de conjugaison, et injection de SWCNT-anti-MALAT1 sont décrites.

Résumé

Le nanotube de carbone monoparoi (NCM) est un nouveau type de nanoparticules, qui a été utilisé pour livrer plusieurs sortes de drogues dans les cellules, tels que des protéines, des oligonucléotides et médicaments à petites molécules synthétiques. Le NCM a dimensions personnalisables, une vaste zone superficielle et peut se lier avec souplesse avec des médicaments par le biais de différentes modifications sur sa surface ; par conséquent, c’est un système idéal pour transporter les médicaments dans les cellules. ARN long non codantes (lncRNAs) est un amas d’ARN non codant plu de 200 nt, qui ne peut pas être traduit en protéine, mais joue un rôle important dans les processus biologiques et physiopathologiques. Associées aux métastases pulmonaires adénocarcinome transcription 1 (MALAT1) est une lncRNA hautement conservée. Il a été démontré que des niveaux plus élevés de MALAT1 concernent le mauvais pronostic de divers cancers, notamment le myélome multiple (MM). Nous avons révélé que MALAT1 régule l’ADN réparation et la mort cellulaire en MM ; ainsi, MALAT1 peut être considéré comme une cible thérapeutique pour MM. Cependant, l’efficience de l’oligo antisens pour inhiber/knockdown MALAT1 in vivo est toujours un problème. Dans cette étude, nous modifier le NCM avec PEG-2000 et conjugué un oligo anti-MALAT1 à elle, tester la livraison de ce composé in vitro, injecter par voie intraveineuse dans un modèle de souris MM disséminé et observer une inhibition significative de la progression de MM, ce qui indique cette SWCNT est une navette de livraison idéal pour anti-MALAT1 gapmer ADN.

Introduction

Le NCM est un nanomatériau roman qui peut fournir différents types de médicaments, comme les acides nucléiques, protéines et petites molécules stablement et efficacement avec la tolérabilité idéale et toxicité minimale¹ de la vitro et in vivo². Un SWCNT fonctionnalisé a grande solubilité de biocompatibilité et de l’eau, peut être utilisé comme un service de navette pour les molécules plus petites et peut transporter pour pénétrer la membrane de la cellule^3,4,5.

lncRNAs sont un amas d’ARN (> 200 nt) qu....

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été pré-approuvé par le Cleveland Clinic IACUC (Comité de l’emploi et animalier institutionnel).

1. synthèse du simple couche fonctionnalisés

1. Mélanger 1 mg de simple couche, 5 mg de DSPE-PEG2000-Amine et 5 mL d’eau exempte de nucléase stérilisée dans un flacon en verre de scintillation (20 mL). Secouez bien pour dissoudre tous les réactifs complètement.
2. Laisser agir le flacon dans un sonicateur de bain d’eau à un niveau de puissance de 40 W pendant 1 h à température ambiante (RT, 20 min x 3, changez l’eau toutes les 20 min pour éviter les surchauffes). Ensuite, il centrif....

Résultats

Pour démontrer l’effet d’inhibition de l’anti-MALAT1 gapmer ADN en MM, nous renversé l’expression de MALAT1 et utilisé dans les cellules H929 et MM.1S. Quarante-huit heures plus tard, les cellules ont été prélevés pour l’analyse de l’efficacité de la précipitation et le statut de l’apoptose dans les cellules transfectées avec gapmer anti-MALAT1 ou contrôle ADN. résultats qRT-PCR ont montré que les anti-MALAT1 gapmer ADN renversé efficacement l’expression de MALAT1 dans les cellules H929 e.......

Discussion

Preuve a démontré que les lncRNAs participent à la régulation de nombreuses procédures physiologiques et physiopathologiques dans les cancers, y compris MM^7,8,9; Ils ont le potentiel d’être la cible pour le traitement du cancer, qui peut être réalisé par oligonucléotides antisens^20,21,22. La U.S. Food and la Drug Administration (FDA) a .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SWCNTs	Millipore-Sigma	704113
DSPE-PEG2000-Amine	Avanti Polar Lipids	880128
sonicateur	VWR	97043-992
Filtre centrifuge 4 mL	Millipore-Sigma	Z740208-8EA
	Thermo Fisher Scientific	accuSkan GO Spectrophotomètre	à microplaques UV/Viscoefficient d’extinction de 0,0465 L/mg/cm à 808 nm
Sulfo-LC-SPDP	ProteoChem	c1118
Solution DTT	Millipore-Sigma	43815
NAP-5 colonne	GE Healthcare	17-0853-01
Système d’imagerie in vivo	PerkinElmer
NOD. Souris CB17-Prkdcscid/J	Charles River lab	250
Cytomètre en flux	Becton Dickinso
Lipofectamine	Invitrogen	11668019	Lipofectamine2000
Sérum fœtal bovin (FBS)	Invitrogen	10437-028
RMPI-1640 moyen	Invitrogen	11875-093
MALAT1-QF :	synthétisé par IDT Compagnie		5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'
MALAT1-QR :	synthétisé par IDT Company		5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'
GAPDH-QF :	synthétisé par la société		5'- CAAGAGCACAAGAGGAGAGAG - 3'
GAPDH-QR :	synthétisé par IDT Company		5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'
PCR quantitative à l’aide de SYBR Green PCR master mix	Thermo Fisher Scientific	A25780
Kit de synthèse d’ADNc de premier rang RevertAid	Thermo Fisher Scientific	K1621
anti-MALAT1	synthétisé par IDT Company		5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*A*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'
Kit d’analyse de viabilité cellulaire	Promega Corporation	G7570	CellTiter-GloLuminescent Kit d’analyse de viabilité cellulaire
accuSkan GO Spectrophotomètre à microplaques UV/Vis Thermo	Fisher Scientific
Filtre centrifuge	Millipore-Sigma	UFC910008
logiciel SPSS	IBM	version 24.0
D-Luciferin	Millipore-Sigma	L9504

bain Spectromètre UV/VIS IDT