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Article de méthode

Répression de la croissance de cellules de myélome Multiple In Vivo par Nanotube de carbone monoparoi (NCM)-livré MALAT1 oligonucléotides antisens

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DOI :

10.3791/58598

⸱

13 décembre 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit la synthèse d’un nanotube de carbone monoparoi (NCM)-conjugué MALAT1 gapmer antisens ADN d’oligonucléotide (SWCNT-anti-MALAT1), qui montre la remise fiable du NCM et le puissant effet thérapeutique de anti-MALAT1 in vitro et in vivo. Méthodes utilisées pour la synthèse, de modification, de conjugaison, et injection de SWCNT-anti-MALAT1 sont décrites.

Résumé

Le nanotube de carbone monoparoi (NCM) est un nouveau type de nanoparticules, qui a été utilisé pour livrer plusieurs sortes de drogues dans les cellules, tels que des protéines, des oligonucléotides et médicaments à petites molécules synthétiques. Le NCM a dimensions personnalisables, une vaste zone superficielle et peut se lier avec souplesse avec des médicaments par le biais de différentes modifications sur sa surface ; par conséquent, c’est un système idéal pour transporter les médicaments dans les cellules. ARN long non codantes (lncRNAs) est un amas d’ARN non codant plu de 200 nt, qui ne peut pas être traduit en protéine, mais joue un rôle important dans les processus biologiques et physiopathologiques. Associées aux métastases pulmonaires adénocarcinome transcription 1 (MALAT1) est une lncRNA hautement conservée. Il a été démontré que des niveaux plus élevés de MALAT1 concernent le mauvais pronostic de divers cancers, notamment le myélome multiple (MM). Nous avons révélé que MALAT1 régule l’ADN réparation et la mort cellulaire en MM ; ainsi, MALAT1 peut être considéré comme une cible thérapeutique pour MM. Cependant, l’efficience de l’oligo antisens pour inhiber/knockdown MALAT1 in vivo est toujours un problème. Dans cette étude, nous modifier le NCM avec PEG-2000 et conjugué un oligo anti-MALAT1 à elle, tester la livraison de ce composé in vitro, injecter par voie intraveineuse dans un modèle de souris MM disséminé et observer une inhibition significative de la progression de MM, ce qui indique cette SWCNT est une navette de livraison idéal pour anti-MALAT1 gapmer ADN.

Introduction

Le NCM est un nanomatériau roman qui peut fournir différents types de médicaments, comme les acides nucléiques, protéines et petites molécules stablement et efficacement avec la tolérabilité idéale et toxicité minimale1 de la vitro et in vivo2. Un SWCNT fonctionnalisé a grande solubilité de biocompatibilité et de l’eau, peut être utilisé comme un service de navette pour les molécules plus petites et peut transporter pour pénétrer la membrane de la cellule3,4,5.

lncRNAs sont un amas d’ARN (> 200 nt) qui sont transcrits à partir du génome à l’ARNm, mais ne peut pas être traduit en protéines. Augmentant la preuve a démontré que les lncRNAs participent à la régulation de l' expression de gène6 et sont impliqués dans l’apparition et la progression de la plupart des types de cancer, y compris MM7,8,9. MALAT1 est une transcription non codante nucléaire enrichi 2 (NEAT2) et un lncRNA hautement conservée10. MALAT1 est initialement reconnu métastatique pulmonaire non à petites cellules (NSCLC) le cancer11, mais a été surexprimé dans nombreuses tumeurs5,12,13; Il est l’un de le lncRNAs plus fortement exprimée et est corrélé à un mauvais pronostic en MM8,14. Le niveau d’expression de MALAT1 est significativement plus élevé chez les cours fatal extramédullaire MM par rapport à ceux diagnostiqués uniquement sous la forme MM15.

Dans une étude précédente, nous avons confirmé qu’anti-MALAT1 oligos conduire fermement pour dommages à l’ADN et l’apoptose dans MM16 en utilisant des oligonucléotides antisens d’ADN gapmer ciblage MALAT1 (anti-MALAT1) dans les cellules MM. L’ADN de gapmer est composé d’ADN antisens et relié par 2'-OMe-ARN, qui pourrait inciter un clivage MALAT1 par la RNase H activité liée une fois17. L’efficacité de livraison in vivo des oligonucléotides antisens limite toujours son utilisation clinique.

Pour tester la livraison effet de SWCNT pour anti-MALAT1 gapmer oligos, l’anti-MALAT1 gapmer ADN est conjugué à la DSPE-PEG2000-amine fonctionnalisés NCM. Le NCM-anti-MALAT1 est ensuite injectée par voie intraveineuse dans un modèle de souris disséminée MM ; On observe une inhibition frappante après quatre traitements.

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Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été pré-approuvé par le Cleveland Clinic IACUC (Comité de l’emploi et animalier institutionnel).

1. synthèse du simple couche fonctionnalisés

  1. Mélanger 1 mg de simple couche, 5 mg de DSPE-PEG2000-Amine et 5 mL d’eau exempte de nucléase stérilisée dans un flacon en verre de scintillation (20 mL). Secouez bien pour dissoudre tous les réactifs complètement.
  2. Laisser agir le flacon dans un sonicateur de bain d’eau à un niveau de puissance de 40 W pendant 1 h à température ambiante (RT, 20 min x 3, changez l’eau toutes les 20 min pour éviter les surchauffes). Ensuite, il centrifuger à 24 000 x g pendant 6 h et recueillir le surnageant. Cette solution SWCNT fonctionnelle peut être conservée à 4 ° C pendant 2 mois.
  3. Ajouter 1 mL de solution de NCM à l’étape 1.2 sur un appareil filtre centrifuge du MWCO 100 kDa, suivie de 4 mL d’eau stérilisée exempte de nucléase. Centrifuger pendant 10 min à 4 000 x g à RT pour supprimer supplémentaire DSPE-PEG2000-amine. Répétez l’ajout de 4 mL d’eau et la centrifugation 5 x. Plus de 0,5 mL de solution SWCNT reste seront laissé dans le filtre après chaque centrifugation.
  4. Mesurer la concentration de la solution SWCNT reste dans le filtre à l’aide d’un spectromètre UV/VIS à 808 nm après le lavage final. La concentration finale est généralement environ 50 mg/L (calculé selon la méthode développée par Kam et al.18).
    Remarque : Assurez-vous que la simple couche DSPE-PEG-fonctionnalisés est solubles dans l’eau après l’étape 1.4 et est stables dans les différentes solutions biologiques sans agrégation visible après quelques semaines.

2. conjugaison de l’Anti-MALAT1 Gapmer ADN flanqué de 2'-O mis à jour le RNAs à SWCNT fonctionnalisé

  1. Ajouter 0,5 mg de Sulfo-LC-DPS dans 450 µL du DSPE-PEG2000-amine fonctionnalisés NCM. Ajouter 50 µL de PBS de x 10 et puis incuber pendant 2 h à température ambiante.
  2. Pour supprimer des Sulfo-LC-DPS supplémentaire, ajouter la réaction de l’étape 2.1 sur un appareil filtre centrifuge du MWCO 100 kDa, suivie de 4 mL d’eau exempte de nucléase. Centrifuger pendant 10 min à 4 000 x g à RT. Repeat l’ajout de 4 mL d’eau et la centrifugation x 5.
  3. Ajouter 200 nM thiols modifiés anti-MALAT1-Cy3 gapmer ADN dans 1,5 mL de solution commerciale de DTT et incuber pendant 90 min à RT. purifier le produit avec une colonne de NAP-5, suivant le protocole du fabricant. Éluer les anti-MALAT1-Cy3 avec 500 µL de stérilisé sans nucléase 1 x PBS.
    Remarque : Le NCM fonctionnalisé peut être stocké avec TNT supplémentaire, qui pourrait se clivent disulfures formés lors du stockage de la thiolés anti-MALAT1 gapmer ADN. La TNT ajoutée peut être retirée par l’aNAP-5 colonne avant la conjugaison avec le NCM.
  4. Recueillir la solution DSPE-PEG2000-amine SWCNT sulfo-LC-DPS-traités a laissé dans le filtre et le diluer avec 500 µL de solution d’anti-MALAT1-Cy3. Ensuite, il incuber à 4 ° C pendant 24 h. Le conjugué SWCNT-anti-MALAT1 peut être stockés à 4 ° C pendant 3 semaines. Suivant la même procédure, le NCM conjugué avec oligo antisens scramble peut être synthétisé et utilisé comme SWCNT-contrôle.

3. queue Injection dans la veine de SWCNT-Anti-MALAT1

  1. Générer un modèle de souris disséminée de MM.
    1. Pour obtenir les meilleurs résultats de la comparaison, au hasard organiser 14 clin de œil. Souris CB17-Prkdcscid/J (8 semaines) en groupes de l’essai ou de contrôle (sept dans chaque groupe) avec le même ratio homme/femme.
    2. Nettoyer le banc de l’opération et stériliser à l’alcool à 70 %.
    3. Utilisez une lampe chauffante pour réchauffer la souris pour aider la queue veineuse pour apparaître. Immobiliser la souris correctement avec une drisse d’injection de queue.
    4. Injecter des cellules de 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry dans 50 µL de PBS dans la veine de la queue sans anesthésie. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool pour 30 s. marque la souris injectée et remettez-le dans une cage propre.
  2. Commencer le traitement sur le 7e jour après l’injection de cellules MM.1S.
    1. Injecter 50 µL de PBS contenant SWCNT-anti-MALAT1 dans la veine de la queue de la souris. Utilisation PBS contenant SWCNT-contrôle comme un contrôle.
    2. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool pour 30 s.
    3. Observez le saignement local sur la queue et le comportement général de la souris pendant 1 min et puis la remettre à une cage propre. Observez tout injecté de souris à nouveau avant de retourner la cage sur le rack, pour s’assurer que les injections sont bien tolérées.
  3. Renouveler l’injection tous les 7 jours jusqu'à la fin de l’expérience.
    1. Mettre fin à l’expérience lorsque la souris les soins de santé se dégrade : quand ne pas manger ou boire, l’apparition des pattes pâles, tout saignement sous-cutanés, un essoufflement, diminution de l’activité, une paralysie des membres inférieurs, et/ou une masse palpable dans le abdomen est observée.

4. evaluation de la Progression de la maladie

  1. Évaluer l’état général des souris tous les jours après l’injection de cellules MM.1S-Luc-mCherry. Accorder une attention particulière si les souris se paralyse des membres inférieurs.
  2. Évaluer la croissance de la tumeur à l’aide d’un appareil d’imagerie in vivo 1 x par semaine, avant l’injection SWCNT-anti-MALAT1.
    1. Préparer les frais 15 mg/mL D-luciférine avec du PBS 1 x.
    2. Anesthésier les souris avec un vaporisateur isoflurane (3 à 5 % pour l’induction et 1 à 3 % pour l’entretien, selon l’état des souris).
    3. Injecter par voie intrapéritonéale de 150 mg/kg D-luciférine dans chaque souris, 5 min avant l’imagerie ; Ensuite, l’image les souris dans une position couchée avec un spectre de système d’imagerie.
    4. Recueillir des images séquentielles des souris toutes les 2 min, jusqu'à ce que la saturation de la luminescence est atteint. Régler l’intervalle de temps selon l’absorption D-luciférine/signal.
  3. CO2 permet de sacrifier les souris après avoir atteint la fin de l’expérience.
  4. Puisqu’il s’agit d’un modèle de diffusion de MM, traiter les souris comme suit.
    1. Peser la souris avant la dissection.
    2. Recueillir le sang périphérique du fond du cœur pour un dosage de la numération formule sanguine (CBC) interprété par une machine de compteur de cellules sanguines. Les comtes de globules rouges et les globules blancs, ainsi que le taux de lymphocytes, est les principaux index.
    3. Isoler la rate et pesez-le. Calculer le ratio de rate/poids ; envisager de > 0,5 % comme l’élargissement de la rate.
    4. Recueillir les tissus de la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, rein et les tissus présentant des métastases visible.
    5. Recueillir la colonne vertébrale si la souris a développé une paralysie des membres inférieurs.
    6. Extraire l’ARN et des protéines des échantillons de moelle osseuse.
    7. Fixer tous les tissus restants dans du formol.
    8. D’un détartrage, immergez les échantillons osseux dans la solution d’EDTA 0.25 M (pH 8,0) pendant 5 jours après 24h de fixation.
    9. Plongez tous les échantillons dans 75 % d’alcool pour le stockage à long terme.
  5. Comparer l’intensité du signal de la luciférase dans les points dans le temps même dans les deux groupes. Des deux groupes, enregistre les dates de sacrifice de chaque souris et on calcule les courbes de survie des deux groupes avec le logiciel.
    Remarque : Toutes les procédures sont résumées dans la Figure 1.

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Résultats

Pour démontrer l’effet d’inhibition de l’anti-MALAT1 gapmer ADN en MM, nous renversé l’expression de MALAT1 et utilisé dans les cellules H929 et MM.1S. Quarante-huit heures plus tard, les cellules ont été prélevés pour l’analyse de l’efficacité de la précipitation et le statut de l’apoptose dans les cellules transfectées avec gapmer anti-MALAT1 ou contrôle ADN. résultats qRT-PCR ont montré que les anti-MALAT1 gapmer ADN renversé efficacement l’expression de MALAT1 dans les cellules H929 e...

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Discussion

Preuve a démontré que les lncRNAs participent à la régulation de nombreuses procédures physiologiques et physiopathologiques dans les cancers, y compris MM7,8,9; Ils ont le potentiel d’être la cible pour le traitement du cancer, qui peut être réalisé par oligonucléotides antisens20,21,22. La U.S. Food and la Drug Administration (FDA) a ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient l’Institut de recherche Lerner de protéomique, génomique et carottes d’imagerie pour leur aide et soutien. Financement : Ce travail a été soutenu financièrement par subvention de NIH/NCI R00 CA172292 (pour J.J.Z.) et fonds d’amorçage (à J.J.Z.) et la clinique et translationnelle Science Collaborative (CNTC) de la Case Western Reserve University Core utilisation pilote Grant (à J.J.Z.). Ce travail a utilisé le microscope confocal Leica SP8 qui a été acheté grâce à un financement des instituts nationaux de santé SIG grant 1S10OD019972-01.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
SWCNTsMillipore-Sigma704113
DSPE-PEG2000-AmineAvanti Polar Lipids880128
sonicateurVWR97043-992
Filtre centrifuge 4 mLMillipore-SigmaZ740208-8EA
Thermo Fisher ScientificaccuSkan GO Spectrophotomètreà microplaques UV/Viscoefficient d’extinction de 0,0465 L/mg/cm à 808 nm
Sulfo-LC-SPDPProteoChemc1118
Solution DTTMillipore-Sigma43815
NAP-5 colonneGE Healthcare17-0853-01
Système d’imagerie in vivoPerkinElmer
NOD. Souris CB17-Prkdcscid/JCharles River lab250
Cytomètre en fluxBecton Dickinso
LipofectamineInvitrogen11668019Lipofectamine2000
Sérum fœtal bovin (FBS)Invitrogen10437-028
RMPI-1640 moyenInvitrogen11875-093
MALAT1-QF :synthétisé par IDT Compagnie5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'
MALAT1-QR :synthétisé par IDT Company5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'
GAPDH-QF :synthétisé par la société5'- CAAGAGCACAAGAGGAGAGAG - 3'
GAPDH-QR :synthétisé par IDT Company5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'
PCR quantitative à l’aide de SYBR Green PCR master mixThermo Fisher ScientificA25780
Kit de synthèse d’ADNc de premier rang RevertAidThermo Fisher ScientificK1621
anti-MALAT1synthétisé par IDT Company5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T
*G*G*C*A*A*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'
Kit d’analyse de viabilité cellulairePromega CorporationG7570CellTiter-GloLuminescent Kit d’analyse de viabilité cellulaire
accuSkan GO Spectrophotomètre à microplaques UV/Vis ThermoFisher Scientific
Filtre centrifugeMillipore-SigmaUFC910008
logiciel SPSSIBMversion 24.0
D-LuciferinMillipore-SigmaL9504
bain Spectromètre UV/VIS IDT

Références

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