Nous décrivons ici la technique des ultrasons de haute fréquence pour l’analyse in vivo du foetus chez les souris. Cette méthode permet le suivi des fœtus et l’analyse des paramètres placentaires ainsi que le débit sanguin maternel et fœtal pendant toute la grossesse.
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Article de méthode
Échographie de haute fréquence pour l’analyse du développement foetale et placentaire In Vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’échographie est une méthode largement utilisée pour détecter des anomalies de l’orgue et des tumeurs dans les tissus humains et animaux. La méthode est non invasif, indolore et inoffensif, et l’application est facile, rapide et peut être faite n’importe où, même avec les appareils mobiles. Pendant la grossesse, l’échographie sert habituellement à suivre de près le développement du foetus. La technique est importante pour évaluer la restriction de croissance intra-utérine (RCIU), une complication de la grossesse à court et à long terme des conséquences santé pour la mère et le fœtus. Comprendre le processus de RCIU est indispensable pour élaborer des stratégies thérapeutiques efficaces.
Le système à ultrasons utilisé dans ce manuscrit est un appareil d’échographie produit pour l’analyse des petits animaux et peut être utilisé dans divers domaines de recherche, y compris la recherche de la grossesse. Nous décrivons ici l’utilisation du système pour l’analyse in vivo des fœtus de natural killer (NK) cellule/mastocytes (MC)-les mères déficientes qui donnent naissance à des petits restreint la croissance. Le protocole comprend la préparation du système, manipulation des souris avant et Pendant les mesures et l’utilisation du B-mode, couleur mode doppler et mode doppler-l’onde du pouls. Taille foetus, taille placentaire et approvisionnement en sang au foetus ont été analysés. Nous avons trouvé réduit l’implantation tailles et petits placentas souris NK/MC-déficientes du milieu de la gestation à partir. En outre, MC/NK-insuffisance a été associée à l’absence et inversé le flux diastolique bout dans foetus Arteria umbilicalis(UmA) et un index de résistance élevée. Les méthodes décrites dans le protocole facilement utilisable pour les thèmes de recherche liés et non liés.
Introduction
Les ultrasons sont des ondes sonores avec des fréquences au-dessus de la gamme audible de l’oreille humaine, supérieure à 20 kHz,1. Animaux comme les chauves-souris, au pays de Galles, dauphins2,3,4de la souris, rats5et lémuriens souris6 tous utiliser d’ultrasons pour l’orientation et de la communication. Homme Profitez des ultrasons pour plusieurs applications techniques et médicales. Un appareil d’échographie est capable de créer l’onde sonore et distribuer et représenter le signal. Si l’échographie rencontre un obstacle, le son est réfléchie, absorbée ou peut passer par là. L’application des ultrasons comme une méthode d’imagerie, appelée échographie, est utilisée pour l’analyse des tissus organiques chez l’homme ou de la médecine vétérinaire comme le cœur (échocardiographie)7,8,9de poumon, thyroïde10 , reins11et12,de tractus urinaire et reproductif13; détection des calculs biliaires14 et tumeurs15; et l’évaluation de la perfusion des organes ou des vaisseaux sanguins16,17. L’échographie est une méthode standard dans les soins prénatals pendant la grossesse, et déficience foetale ou déficiences peuvent être reconnus dès le début. Plus précisément, la croissance d’un foetus est étroitement surveillée à intervalles réguliers pour reconnaître un RCIU possible. Enfin, la circulation sanguine foetale peut être surveillée, car cela peut souligner la croissance restrictions18,19,20,21.
Un avantage majeur de l’échographie par rapport aux autres méthodes comme la radiographie est l’innocuité de son des tissus à analyser. Cette méthode simple et rapide est non invasif, indolore et peut être utilisé plusieurs fois. La dépense initiale d’un appareil d’échographie est cher ; Cependant, les matières consommables nécessaires sont bon marchés. Le système à ultrasons utilisé dans ce manuscrit est adapté à un éventail de modèles animaux (c.-à-d., souris et poissons) tandis que pour les humains, un appareil d’échographie exige une fréquence de 3 à 15 mHz, une fréquence de 15 à 70 mHz est requise pour les souris.
Le présent manuscrit décrit un protocole pour l’utilisation de B-mode, mode doppler couleur et mode doppler-l’onde du pouls. La description comprend la préparation de la souris ainsi que performance, acquisition de données et stockage. Cette méthode a été souches de souris avec succès appliqué à différents jours de gestation à tous et peut être utilisée pour étudier le développement foetal et placentaire ainsi que les paramètres sanguins maternels et foetaux. Ici, toutes les applications sont expliquées basé sur nos études employant des souris enceintes MC/NK-déficientes et contrôle.
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le « Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt : 42502-2-1296UniMD. »
1. marche à suivre
- Compagnon de 6 à 8 semaines femelle MC-deficient C57BL/6J-Cpa3Cre /+ (Cpa3Cre /+) souris et MC-suffisamment C57BL/6J-Cpa3+/+ (contrôle de la colonie ; Cpa3+/+) avec des mâles BALB/c.
- Fixez le jour de la gestation (gd) 0 après confirmation de la fiche vaginale et traiter les femelles immédiatement après confirmation de la fiche.
Remarque : Une fiche est le sperme du mâle dans l’orifice vaginal de la femelle.- Injecter 250 µL de PBS par voie intrapéritonéale en contrôle Cpa3+/+ femelles.
- Injecter 250 µL d’anti-CD122 (0,25 mg) par voie intrapéritonéale en MC-deficient Cpa3Cre /+ femelles.
Remarque : Une injection de 0,25 mg d’anti-CD122 épuise NKs périphériques et administration en MC-deficient Cpa3Cre /+ femelles comme décrit plus haut22.
- Attendre gd5.
Remarque : À gd5, il y a la possibilité plus tôt pour l’analyse de l’implantation.- Poursuivez les étapes 2 à 5 pour l’analyse de l’échographie.
- Effectuer l’imagerie par ultrasons à gd5, 8, 10, 12 et 14.
2. préparation de l’échographe
- Allumez le système (Figure 1 a; alimentation principale sur le dos et l’ordinateur en veille sur le site de gauche), la plate-forme chauffée (Figure 1 b; à la manette) et le plus chaud de gel (Figure 1).
Remarque : Gel ultrasonique doit réchauffer pendant environ 0,5 h. - S’assurer que l’unité de l’isoflurane est suffisamment remplissage (Figure 1).
- Dans une étude existante dans le navigateur, ouvrez une Nouvelle étude ou la Nouvelle série . Remplissez toutes les informations nécessaires (propriétaire, étude, nom de série, les données animales) dans la fenêtre Infos étudier . Cliquez sur Ok.
- Après avoir cliqué sur Ok, vérifiez que la fenêtre d’imagerie mode B s’affiche et l’imagerie en mode B commence automatiquement.
3. manipulation de la souris
- Anesthetization de la souris
- Placez votre souris dans la zone de précipitation (Figure 1E), fermez la boîte, ouvrir le tube d’isoflurane à la zone de précipitation et allumez l’isoflurane (concentration 3,5 %).
- Quand la souris est anesthésié, plus bas (à 1,5 % de concentration) et rediriger le flux isoflurane en ouvrant le tube en direction de la plate-forme de chauffage et fermer le flux vers la zone de précipitation.
Remarque : Pour atteindre l’anesthésie suffisante, attendre un supplément de 10 s après la souris n’est plus émouvante. - Transférer la souris rapidement dans la zone de masquage à la plate-forme de chauffage (Figure 1F) en position dorsale et placer doucement son nez dans le tube de nez anesthésie situé sur le dessus de la plate-forme.
- Fixation, épilation et la préparation de la souris pour mesurer
- Placez une protection oculaire crème dans chaque oeil de la souris pour éviter les yeux secs.
- Déposer une goutte de gel de l’électrode sur chacun des quatre domaines de cuivre sur la plate-forme chauffée (Figure 1F).
- Appuyez sur les pattes avec ruban chirurgical sur les zones de gel-enduit des électrodes de la plate-forme de chauffage.
- Vérifier les ECG [valeur optimale = 450-550 battements/minute (BPM)] physiologie respiratoire à tout moment.
Remarque : En utilisant une sonde rectale, mesurer la température de corps est possible, mais pas nécessaire. - Place dépilatoire crème au niveau de l’abdomen de la souris, frotter la crème avec un coton-tige et attendre environ 1 min. Retirer la crème avec une compresse imbibée d’eau. Répétez cette étape si pas tous les poils ont disparu.
- Appliquez le gel échographie pré chauffé sur la peau épilée.
4. les mesures et Acquisition d’Images et de vidéos
- Tenir la sonde (Figure 1) dans la main ou serrer dans le dispositif de fixation (Figure 1 H; tenir le dispositif est recommandé).
- Identifier la vessie avec le transducteur et l’utiliser comme point de référence. Déplacez le transducteur vers les sites de gauche et droite de l’abdomen pour les implantations de trace.
- Mode B pour la visualisation des structures anatomiques en image 2D de niveaux de gris
- Déplacez le transducteur ou chauffage table de plate-forme où la souris est obsédée jusqu'à ce que la première implantation est visible sur l’écran à sa plus grande taille.
- Sélectionnez Image étiquette et entrez un nom ou un Frame Store (stockage sans nom) pour stocker des images individuelles, ou Magasin de Cine pour stocker un fenêtrage pour les mesures de toute implantation.
- Placez le capteur ou la table pour apporter le placenta d’une position où le débit sanguin dans l’UmA est visible. Stocker une seule image ou fenêtrage (voir étape 4.3.1.1) pour les mesures placentaires.
NOTE : Mesures placentaires sont possibles du gd10 partir. - Continuer avec toutes les implantations en utilisant la même méthode.
- Déplacez le transducteur ou chauffage table de plate-forme où la souris est obsédée jusqu'à ce que la première implantation est visible sur l’écran à sa plus grande taille.
- En mode doppler couleur pour visualiser et déterminer le sens d’écoulement de sang
- Appuyez sur la touche de couleur .
- Déplacer la zone de couleur (dans ce domaine, le signal est visible) jusqu'à la position souhaitée en utilisant le trackball. Si nécessaire, modifier la taille de la boîte en appuyant sur la mise à jour et déplacer la boule de commande (à la droite/vers le haut = grand ; à la gauche côté/vers le bas = plus petit). Lorsque la zone a la bonne taille, appuyez sur Select.
- Stocker des images individuelles ou ciné-loops comme indiqué au point 4.3.1.1.
- Le mode doppler-onde de pouls (PW) pour quantifier le flux sanguin dans les vaisseaux de l' Arteria uterina (artère utérine, UA) et UmA
- Localiser la zone d’intérêt dans l’acquisition de doppler couleur.
Remarque : L’UA se trouve caudal à la vessie et l’UmA est situé entre le fœtus et le placenta. - Appuyer sur PW, une ligne en pointillés s’affiche. Placez cette ligne dans le vaisseau sanguin d’intérêt et ajuster l’angle de la ligne à l’aide du bouton « Angle Doppler » conformément à la circulation du sang. Appuyez sur mise à jour.
Remarque : L’angle entre la direction de la circulation sanguine et le transducteur doit être cohérente dans tous les animaux, en particulier lors de l’utilisation des angles de plus de 60° (ici, 70° pour SAMU et 45° pour UmAs ont été utilisés). - Stocker un fenêtrage des lignes doppler qui apparaissent dans la fenêtre d’acquisition doppler PW.
- Localiser la zone d’intérêt dans l’acquisition de doppler couleur.
5. en examinant et finition d’Acquisition de données et l’enregistrement d’une série
- Pour consulter les données, appuyez sur Study Management. Faites défiler jusqu'à l’image miniature d’intérêt, puis double-cliquez sur mise à jour.
- Appuyez d’abord sur Study Management puis Fermer dans la fenêtre du navigateur à la fin d’acquisition de données et d’enregistrer une série enregistrée.
Remarque : Après la fermeture d’une série, il n’est pas possible de stocker des images ou ciné-loops dans cette série plus.
6. souris traitement suite à l’Acquisition de données
- Retirer le gel de l’animal anesthésié à l’aide de compresses sèches.
- Retirez le ruban chirurgical soigneusement les pattes.
- Fermer le tube d’isoflurane (concentration 0 %).
- Procéder à l’analyse suivante d’échographie à gd5, 8, 10 et 12.
- Placez l’animal seul dans une cage pendant au moins 5 min donc il a le temps de se réveiller et orienter.
- Replacez la souris dans la cage originale.
Remarque : Ne pas éteindre l’isoflurane avant d’enlever le gel et le ruban chirurgical, comme les souris se réveillent très rapidement (environ 20 s) après avoir éteint l’isoflurane.
- Procéder à l’analyse suivante d’échographie à gd14.
- Sacrifier la femelle avant il se réveille par dislocation cervicale. Ouvrir l’animal, enlever l’utérus, séparer le fœtus et le placenta et mesurer le poids foetales et placentaires.
7. copier et importer les données
- Marquer une ou plusieurs séries en cliquant sur Exporter vers et choisir l’espace de stockage pour copier les données sur un disque dur.
- Ouvrez le logiciel sur un ordinateur et cliquez sur Copier à partir et sélectionnez l’étude/la série du disque dur pour importer une série d’études/dans le logiciel.
- Analyser les données avec le logiciel.
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Résultats
Les composants individuels du système ultrasons utilisé dans ce manuscrit sont indiquées à la Figure 1. La figure 2 illustre représentant images échographiques acquise en mode B à gd5, 8, 10 et 12 (B) et à la mesure de superficie correspondante implantation résultats (A), démontrant une superficie importante implantation réduite de traitées anti-CD122 Cpa3Cre / + souris de gd10 partir....
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Discussion
En utilisant notre système d’échographie, nous avons démontré de gd10 restriction de croissance foetale chez les mères MC/NK-déficient sur. En outre, à gd10 et 12, nous avons observé des dimensions réduites placentaires et à gd14 l’absence ou l’inversion du flux diastolique de bout dans l’UmAs de certains fœtus de souris uMC/uNK-déficientes. Ce signe de la mauvaise vascularisation était associé à un index de résistance significative des artères indiquant RCIU. Les résultats confirment le rôle important des uMCs et admini...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Un grand Merci à la société de l’Instrument d’imagerie (surtout à Magdalena Steiner, Katrin Suppelt et Sandra Meyer) pour leur soutien agréable et rapide et pour répondre à toutes nos questions concernant le système d’imagerie et son usage rapidement et complètement. Nous sommes reconnaissants à Prof. Hans-Reimer Rodewald et Dr Thorsten Feyerabend (DKFZ Heidelberg, Allemagne) pour la fourniture de la colonie de Cpa3. En outre, nous remercions Stefanie Langwisch, qui dirigeait le service des colonies de souris et qui produit les images dans la Figure 1.
Le travail et le système d’imagerie ont été financés par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) à A.C.Z. (ZE526/6-1 et AZ526/6-2) qui ont des projets intégrés dans le DFG priorité programme 1394 « mastocytes in health and disease. »
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb) | BioLegend | 123204 | Klon TM-&beta ; 1; 500 et micro ; g |
| Système Vevo 2100 | ; FujiFilm VisualSonics Inc. | Sonde ; MS550D-0421 | |
| Logiciel Vevo LAB | ; FujiFilm VisualSonics Inc. | ||
| Isoflurane | Baxter | PZN : 6497131 | |
| Gel d’électrodes | Parker | 12_8 | |
| Ruban chirurgical | 3M Transpore | 1527-1 | |
| Crème pour les yeux | Bayer | PZN : 1578675 | |
| Applicateurs à embout en coton | Raucotupf | 11969 | 100 pièces |
| Crème dépilatoire | Reckitt Benckiser | ||
| 2077626 compresses | Nobamed Paul Danz AG | 856110 | 10 x 10 cm |
| Gel à ultrasons | Gello GmbH | 246000 |
Références
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Réimpressions et autorisations
