Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Les réactions sont d’un grand intérêt pour diverses applications en biochimie, biotechnologie, biologie synthétique et l’expression des gènes sans cellule. Acellulaire expression de protéines a contribué à la préparation des échantillons de protéines pures, qui faisaient l’objet de nombreuses études en biologie structurale. Par exemple, des systèmes acellulaires ont été utilisés avec succès pour l’expression des protéines complexes¹ ou membrane protéines², qui sont difficiles à produire en utilisant expression basés sur les cellules. Notamment, acellulaire réactions ont également été utilisées pour élucider la structure du code génétique, commençant par les expériences révolutionnaires par Nirenberg et Matthaei en 1961³l’expression des gènes.

Récemment, il y a eu un regain d’intérêt pour les méthodes acellulaire en biotechnologie et biologie synthétique^4,5,6. Des systèmes acellulaires peuvent être augmentés avec les composés non biologiques, et des composants de diverses origines biologiques peuvent être combinés plus facilement⁷. Même si des systèmes acellulaires ont l’inconvénient évident qu’ils ne sont pas « cultiver et diviser », il est concevable de préparer ouverts acellulaire bioréacteurs avec fonctions métaboliques de base et leur faire synthétiser des métabolites lorsqu’il est fourni avec l’énergie et de carbone simple entrées⁸. Dans le domaine émergent de la biologie synthétique, systèmes acellulaires promettent d’être un « châssis » plus prévisible pour la mise en œuvre des fonctions biologiques synthétiques.

Actuellement, les réactions d’expression de gène acellulaires sont effectuées soit à l’aide des extraits cellulaires (à partir de différentes sources telles que les bactéries, les levures, les insectes), ou qui ont été optimisés pour différentes applications (p. ex., des systèmes de transcription/traduction procaryotes et eucaryotes expression génique, production de protéines membranaires, etc.). Un protocole populaire pour la préparation d’extrait de cellule bactérienne (communément appelé TXTL) a été fourni récemment par V. Noireaux et collaborateurs⁹. Ses propriétés biophysiques ont été soigneusement caractérisés¹⁰, et le système TXTL a été déjà utilisé avec succès pour effectuer une série de tâches biochimiques complexes : par exemple, l’Assemblée des bactériophages fonctionnelle via acellulaire expression du génome phagique¹¹, la synthèse des protéines bactériennes filaments¹²ou la mise en œuvre du gène acellulaire circuits^13,14.

Un autre système populaire en biologie synthétique acellulaire est le pur, qui est reconstituée à partir des composantes purifiées^15,16. Par rapport au système TXTL, il ne contient pas de nucléases ou mécanisme de dégradation des protéines. Alors que la dégradation de l’ADN linéaire, molécules d’ARN ou de protéines est moins un problème dans le système pur, voies de décomposition sont réellement importants pour la mise en œuvre des fonctions dynamiques. Afin de réduire l’effet de la dégradation de l’exonucléase de modèles linéaires de gène dans le système TXTL (par RecBCD), la protéine de GamS-protection de fin doit être ajouté. Le TXTL tant le système pur sont disponibles dans le commerce.

Un sujet étroitement lié aux préoccupations acellulaire biologie l’étude de l’effet de cloisonnement sur les réactions biochimiques et outre la création de structures artificielles de cellules ou protocells^{17,18,19 ,},²⁰. Recherche sur les cellules artificielles implique généralement l’encapsulation d’un système de réaction biochimique à l’intérieur des compartiments vésiculaires de phospholipides ou autres amphiphiles. Tandis que ces systèmes aident à explorer les aspects fondamentaux de la compartimentation, ou l’émergence de la cellularité et structures auto-réplication, ils font face à des problèmes typiques des systèmes fermés : en l’absence d’un métabolisme efficace et approprié mécanismes de transport de membrane, il est difficile de garder des réactions compartimentées en cours d’exécution pendant de longues périodes de temps - molécules de carburant ont été utilisés et les déchets s’accumulent.

Une alternative intéressante à la compartimentation à l’intérieur de ces compartiments cellulaires-imitant est l’organisation spatiale du matériel génétique à l’aide de méthodes photolithographiques. Immobilisation des « gènes sur une puce » a été lancée par le groupe Bar-Ziv à l’Institut Weizmann, il y a plus de dix ans²¹. Parmi les grandes questions qui devaient être résolues ont été l’adsorption non spécifique de l’ADN et l’éventuelle dénaturation des protéines à la surface de la puce. Bar-Ziv et coll. a développé une résistance photolithographie dédiée appelée « Daisy », qui était composé d’un silane terminal réactif pour l’immobilisation des molécules sur les surfaces de dioxyde de silicium, résister à un intercalaire longue de polyéthylèneglycol (PEG) qui a assuré biocompatibilité et une tête de PHOTOCLIVABLES, qui a été transformé en une amine réactive lors de l’irradiation avec la lumière ultraviolette (UV). Il a été démontré que Daisy peut être utilisé pour immobiliser les molécules d’ADN gène-longueur (avec des longueurs de plusieurs kilo paires de bases (KPB)) sur une surface de puce. D’un point de vue de polymère physique, les systèmes représentant brosses polymère greffés sur un substrat solide. En raison de la nature de polyélectrolyte de l’ADN, la conformation de ces brosses est fortement affectée par osmotique et autres effets spécifiques à ion^22,23.

Surtout, il a été démontré que substrat immobilisée gènes sont encore fonctionnels et peuvent être transcrit et traduit en ARN et des protéines. Brosses de gène sont accessibles pour les ARN polymérases de solution²⁴, et le mélange complexe macromoléculaire de la transcription/traduction n’est pas dénaturé à la surface. Un des avantages de l’immobilisation des composantes génétiques sur un substrat est qu’ils peuvent être utilisés dans un système de réacteur ouvert microfluidique qui est fourni en continu avec des molécules précurseurs de petite et de quels produits de déchets peut être enlevé^{25 , 26}.

Nous avons récemment mis au point une variante de cette méthode, appelée Bephore (par faisceau d’électrons Biocompatible et résine photosensible)²⁷, qui reposait exclusivement sur les composants disponibles dans le commerce et utilisé des réactions spécifiques séquence ADN brin invasion pour la réalisation d’une procédure de simple-to-implement Lithographie plusieurs étapes pour la création de cellules artificielles à base de puce. Un aperçu schématique de la procédure est illustré à la Figure 1. Il est issu des molécules d’épingle à cheveux ADN contenant un groupe PHOTOCLIVABLES, qui sont immobilisées sur une couche de PEG biocompatible. Photoclivage de l’épingle expose une séquence simple brin pied, à travers lequel l’ADN molécules d’intérêt (qui contient la séquence DIS « DEPLACEMENT ») peuvent être jointe par l’invasion brin induite par le pied.

Alors que Bephore est potentiellement plus simple à mettre en œuvre, Daisy permet la réalisation de très dense et très propre « brosses à gène », qui a des avantages dans certaines applications. En principe, cependant, lithographie de Daisy et Bephore pourrait être facilement combiné. Une méthode connexe Lithographie utilisant déplacement brin ADN pour structurer les ADN brosses sur l’or a été précédemment développé par Huang et al., mais n’était pas utilisé dans le cadre d’expression de gène acellulaire^28,29.

Dans le protocole suivant, nous fournir qu'une description détaillée de la production d’ADN brushes pour l’expression des gènes sans cellule à l’aide de la méthode Bephore. Les auteurs décrivent comment les puces sont fabriqués et démontrent l’utilisation de plusieurs étape photo-Lithographie pour l’immobilisation structurée spatialement de gènes sur une puce. Nous discutons également la fabrication des chambres de réaction et l’application de microfluidique pour l’exécution des réactions d’expression génique sur puce.

Remarque : Un calendrier pour les étapes décrites dans les différentes sections est donné dans les informations complémentaires (article 1).

1. Fabrication de la puce

Remarque : comme substrats, utilisation plaquettes de silicium (100 mm de diamètre, 0,525 mm d’épaisseur) avec une couche épaisse de 50 nm de dioxyde de silicium ou de lames de verre (24 mm x 24 mm, n° 1,5 ; 22 mm x 50 mm, n ° 4). Selon l’application, autres tailles et épaisseurs peuvent s’avérer préférable.

1. Nettoyage des substrats via une CR nettoyer la procédure (de l’eau, ammoniaque NH₃(aq) 30 % et peroxyde d’hydrogène H₂O₂ 30 %, à un ratio de 5:1:1)
   1. Mélanger la solution d’eau et d’ammoniaque dans un verre de becher et porter le mélange à 70 ° C sur une plaque de cuisson en remuant.
   2. Ajouter de l’eau oxygénée et le substrat. Pour des débits plus élevés, placez plusieurs substrats (en particulier les lames de verre petit) dans un support de polytétrafluoroéthylène (PTFE).
   3. Après 30 min, sortez le substrat, rincez abondamment avec de l’eau d’un flacon laveur et séchez-le avec un pistolet d’azote. Procéder immédiatement à la PEGylation du substrat.
      ATTENTION : Porter la peau et des lunettes de protection et travailler sous une hotte. Ne pas fermer la poubelle hermétiquement afin de permettre le dégagement de gaz du mélange.
2. PEGylation du substrat
   NOTE : Répétés de gel et de dégel du stock biotine-PEG-Silane réduisent la réactivité de la silane due à la condensation de l’humidité de l’air. Préparez donc, 5 mL-tubes avec des quantités appropriées de biotine-PEG-Silane (par exemple 10-20 mg) et remplissez-les avec argon sec avant de les congeler jusqu'à utilisation.
   1. Dissoudre la biotine-PEG-Silane dans le toluène sec au Vortex (5 mg/mL).
   2. Placez le substrat dans un plat de Pétri de verre (diamètre 120 cm, 2 cm de hauteur) sous une hotte.
   3. Déposer la solution (≈200 µL d’une lamelle de verre simple, quelques mL pour une plaquette de silicium grand) sur le substrat, couvrant toute la surface, mais éviter la solution qui coule sur le bord du substrat.
   4. Fermez la boîte de Pétri. Pour réduire le séchage du substrat, ajouter une couverture supplémentaire avec un essuie-tout humide.
   5. Après 30 min, ajouter environ 40 ml d’isopropanol, puis sortez le substrat, à nouveau rincer abondamment avec de l’alcool isopropylique et séchez-le avec un fusil de l’azote (pour les lames de verre, n’oubliez pas le côté pégylé). Conserver le substrat dans l’obscurité jusqu'à l’utilisation.
      ATTENTION : Porter la peau et des lunettes de protection et travailler sous une hotte.

2. préparation des gènes pour l’immobilisation

NOTE : Séquences d’amorce, modifications de l’ADN et un protocole PCR exemplaire sont donnés dans les informations complémentaires (Articles 2-4).

1. Mis à jour l’amorces permet d’amplifier le gène d’intérêt par polymerase chain reaction (PCR). Une amorce porte un fluorophore pour la visualisation en microscopie de fluorescence, et l’autre amorce est séparée de la séquence des DIS par une entretoise de glycol de triéthylène afin de maintenir la séquence DIS monocaténaire tout au long de la PCR.
2. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de purification de colonne de spin et de mesurer sa concentration à l’aide d’un photomètre d’absorption. La concentration ne doit pas être inférieure à 100 nM.
3. Ajuster la concentration de NaCl à 1 M à l’aide d’une solution concentrée de NaCl 5 M. La forte concentration de sel facilite l’ADN brosse Assemblée processus²².

3. photolithographie

Remarque : Le PHOTOCLIVABLES ADN (PC) doivent être manipulés uniquement dans un environnement jaune-pâle. Feuille jaune pour salles blanches peut être utilisé pour filtrer la lumière des lampes traditionnelles de lumière blanches.

1. Préparation du substrat
   1. Préparer le mélange en Bephore (1µm streptavidine, 1,5 µM PC ADN, 7,5 µM PH ADN dans du PBS 1 x (tampon phosphate salin)) et la passivation mix (10 µM non DIS ADN, BSA (albumine sérique bovine), de 1 mg/mL dans du PBS 1 x). Les deux peuvent être stockés dans l’obscurité dans le réfrigérateur pendant plusieurs semaines.
   2. Couper le substrat en petits morceaux (quelques cm²) soit à l’aide d’un coupe-verre, soit en brisant une plaquette de silicium le long d’une ligne de cristal en appuyant sur une arête avec un scalpel. Comme un repère d’alignement simple, créez une égratignure courte du centre vers le bord du substrat à l’aide du coupe-verre. Les petites particules coup au large de la puce avec un pistolet d’azote.
   3. Mélangez deux gouttes de colle silicone bi-composant, remuant par exemple avec un embout de la pipette et appliquez la colle sur la surface de la puce, laissant en blanc la zone autour de l’extrémité du scratch (Figure 2 a). La colle fournit une barrière hydrophobe qui facilite les étapes de lavage et réduit la quantité d’ADN requis pour des incubations. Dans une étape ultérieure, la colle peut être facilement épluchée au loin.
   4. Incuber 10 µL (ou autant que nécessaire pour couvrir la puce) du mélange à la température ambiante (RT) sur la puce Bephore. Pendant l’incubation, place la puce dans une boîte, par exemple une boîte de pointe de pipette partiellement rempli d’eau pour diminuer l’évaporation.
   5. Après 1 h, lavez la puce plusieurs fois (5 x 50 µL) en pipettant également avec du PBS 1 x pour enlever non consolidé Bephore-mix.
   6. Enlevez autant tampon que possible sans la dessécher la puce et incuber 10 µL du mélange passivation sur la puce à température ambiante.
   7. Après 2 h, laver la puce plusieurs fois (10 x 50 µL) en pipettant également avec du PBS 1 x de radier les agents de passivation non lié.
2. Lithographie par projection
   Remarque : Pour la lithographie, un microscope vertical avec un 60 x objectif à immersion d’eau peut être utilisé. Temps d’illumination dépendant de l’objectif, la source lumineuse, le masque, le substrat (diapositive de puce ou verre de silicium) et l’ADN désirée grammage. Avec un objectif de 60 x, temps d’exposition typique variaient de moins une minute pour une lithographie en deux étapes avec chevauchement des régions (15 s pour les puces de silicium, 45 s pour les lames de verre) à 2-3 min pour une exposition totale. Ne pas utiliser une lamelle couvre-objet (sauf en quartz) sur le dessus du substrat, car elle bloque les rayons UV.
   1. Couper un photomasque imprimé (voir dossier complémentaire avec des masques de lithographie exemplaire et une section supplémentaire 5) à la bonne taille pour s’adapter à un support de masque adapté, qui peut être inséré à la position de la butée de champ (Figure 2 b). Pour lithographie en plusieurs étape précise, aligner le masque avec les marques d’alignement sur le support.
   2. Déposer le substrat sur une lame de microscope et déplacez-le vers la platine du microscope. Pour la structuration des lames de verre Bephore, insérer feuille noir (p. ex. rechange clinquant de l’imprimé photomasks) entre lame de microscope et Bephore diapositive pour fournir un fond sombre pour la lithographie.
   3. Insérez un filtre rouge dans le chemin de l’illumination, se concentrer sur la surface du substrat et accédez à la région du substrat, qui sera exposé, par exemple la région à la pointe de la rayure.
   4. Insérez le support de masque, bloquer l’illumination et remplacez le filtre UV (Figure 2). À une faible intensité lumineuse, ouvrir la trappe et utilisez la caméra se pour concentrer rapidement le masque sur le substrat.
   5. Bloquer le trajet optique de la caméra et illuminer le substrat à une forte intensité lumineuse pour la durée d’exposition souhaitée.
   6. Prenez l’exemple du microscope et retirez délicatement autant tampon que possible le substrat sans la dessécher.
   7. Ajouter 10 à 20 µL de l’ADN avec dis-séquence. Placer le substrat dans une boîte humide pour l’empêcher de sécher. Incuber l’ADN sur le substrat pour 2 h (oligonucléotides à une concentration micromolaire) ou plusieurs heures/nuit (ADN kbp-long à environ 100 concentration nM) à température ambiante.
   8. Retirez l’ADN de la puce et lavez-le plusieurs fois avec du PBS 1 x. Afin de réduire les déchets de l’ADN (surtout pour les plus longs fragments), stocker l’ADN prélevés sur le substrat et le réutiliser.
3. Lithographie de plusieurs étape
   Remarque : Pour un alignement précis de deux ou plusieurs expositions dans une seule zone, garder l’échantillon sur la scène pour éviter un désalignement angulaire. Veillez à ce que la puce ne sèche pas vers le haut. Pour le positionnement de plusieurs pinceaux d’ADN dans les différentes régions sur un substrat, utilisez une platine motorisée à conduire à l’aire ou un substrat avec des repères appropriés.
   1. Après la première exposition (section 3.2), incuber ADN avec dis-séquence sur le substrat. Il est important que tous les sites de liaison résultant de la première exposition sont occupés. Par conséquent, incuber les oligonucléotides (10 µM) pour environ 3 h à température ambiante.
   2. Pour immobiliser les gènes dis-étiquetés, placez-les sur le substrat pendant plusieurs heures ou pendant la nuit à la droite, puis laver l’échantillon et ajouter le mélange de passivation pour un autre 2 h à RT. Procédez avec la prochaine exposition.
   3. Pour les risques supplémentaires, répétez les étapes précédentes (3.2.3 - 3.3.2).

4. dispositifs PDMS

Remarque : De préférence, travailler dans une salle blanche. La fabrication d’un dispositif PDMS suit un protocole standard telle que décrite par McDonald et al. ³⁰

1. Fabrication de moules maître par photolithographie
   1. Une plaquette de silicium (diamètre de 76,2 mm, 525 µm d’épaisseur) par sonication dans l’acétone pendant 5 min à puissance élevée et rincer avec de l’alcool isopropylique et d’eau désionisée. Ensuite, placer la plaquette sur une plaque de cuisson à 150 ° C pendant 15 min.
   2. Éventuellement, afin d’améliorer l’adhérence de résistent à la gaufrette, ajouter promoteur d’adhérence 2-3 mL et tournez à 3000 tr/min pendant 30 s. chaleur la gaufrette à 120 ° C pendant 2 min.
   3. Ajouter environ 2-3 mL résine photosensible (voir Table des matières). Tourner la plaquette pendant 15 s à 500 tr/min, puis à 3000 tr/min pendant 30 s. Il devrait en résulter en une couche épaisse de 20 µm de résine photosensible. Laissez la couche de résine photosensible détendre à température ambiante pendant 10 min.
   4. Pour la cuisson de pré-exposition, placer la galette sur une plaque chauffante à 50 ° C pendant 2 min, puis à 85 ° C pendant 5 min.
   5. Placer la plaquette sous le photomasque avec le plan d’action des compartiments. De préférence, utiliser un masque-dispositif d’alignement. Le photomasque devrait avoir une résolution de 64 000 dpi (voir dossier complémentaire avec les masques de la lithographie et autre section 5).
   6. Exposer la plaquette pendant 1 min avec lumière UV (j’ai-ligne 5-10 mW/cm²) par le biais de la photolithographie.
   7. Pour la cuisson de post-exposition, placer la plaquette à 50 ° C pendant 2 min, puis à 85 ° C pendant 5 min. Laissez la gaufrette refroidir et se détendre pendant 1 h à température ambiante.
   8. Placer la plaquette dans un plat avec le développeur pendant 3 min tout en agitant doucement le bécher. Rincer la plaquette d’alcool isopropylique et essuyez-le avec un pistolet d’azote. Placer les tranches sur une plaque chauffante à 130 ° C pendant 45 min.
2. Préparation de l’appareil PDMS
   1. Base de Mix PDMS et PDMS polymérisation agent dans un rapport de 10:1 et la verser sur la plaquette dans un récipient fermé jusqu'à ce qu’une couche d’environ 5 mm a formé au-dessus de la plaquette. Pour obtenir un dispositif PDMS de seulement 1 mm d’épaisseur, plutôt tourner le manteau la plaquette avec le PDMS à 100 tr/min pendant 2 min.
   2. Placer le récipient dans un dessicateur et appliquez un vide (environ 85 kPa) pendant environ 30 min. Ensuite, faire chauffer le PDMS à environ 70° C pendant 1 à 2 h dans un four.
   3. Séparer l’appareil PDMS de la plaquette. Couper le PDMS en dalles afin que chaque pièce contient un ensemble de compartiments. Dans le cas où le PDMS sera relié à une installation de microfluidique, percer des trous (1 mm de diamètre) comme une entrée et de sortie aux extrémités de la chaîne d’approvisionnement.
   4. Nettoyez le PDMS avec l’alcool isopropylique et d’eau déionisée et séchez-le avec un pistolet d’azote. Stocker les PDMS sans poussière.

5. compartimentée Gene Expression

Remarque : La procédure suivante décrit l’assemblage d’un porte-échantillon (Figure 3) pour l’observation de l’expression génique compartimentée sur un microscope inversé avec un incubateur de cage pour contrôler la température. Le titulaire a été construit à l’aide de matériaux facilement disponibles et outils (plastique épais polychlorure de vinyle (PVC) de 3,5 à 5 mm, vis et écrous, perceuse) et peut être personnalisé pour s’adapter à différents types de microscopes. Les étapes décrites en 5.1 et 5.2 doivent être effectuées de telle sorte que les deux parties du titulaire sont prêts en même temps.

1. Assemblage du support bas
   1. Préparer une puce Bephore avec le repère d’alignement (par exemple une égratignure) et le coller sur le support de la puce à l’aide de ruban adhésif double face (Figure 3 b). La puce doit être plus grande que le dispositif PDMS qui il couvrira.
   2. Immobiliser un ou plusieurs gènes sur la puce (voir les sections 2 et 3).
   3. Ajouter peu de graisse vide autour du trou central du détenteur du bas, puis branchez dans le support de la puce.
      Remarque : Le titulaire de la puce maintenant adhère au détenteur du fond au moyen de la graisse, tout en conservant la possibilité de re-positionnement de la puce dans le plan x-y.
2. Assemblage du support supérieur
   1. Préparer un mince morceau PDMS à compartiments avec la procédure de revêtement de spin à l’étape 4.2.1. Couper le PDMS aussi petit que possible, laissant un canal ouvert d’un côté pour permettre l’échange des molécules déchets et précurseur de la diffusion.
   2. Nettoyer une lamelle de verre (24 mm x 24 mm, n° 1,5) et l’arrière de la puce PDMS (côté sans compartiments) avec le plasma d’oxygène pour 42 s (fonctionnant à 200 W et 0,8 mbar avec l’échantillon dans une cage de Faraday).
   3. Placez le jeton de PDMS au centre de la lame de verre équipés de compartiments pointant vers le haut. Faire cuire le verre avec le PDMS pendant 1 h à 70 ° C.
   4. Ajouter peu de graisse vide autour du grand trou du détenteur du haut de la page.
   5. Avant de commencer l’expérience, nettoyer la lame de verre et le PDMS puce avec le plasma d’oxygène pour 42 s pour restituer le PDMS hydrophile.
   6. Placer la lame de verre avec le PDMS sur le support supérieur ( Figure 3) et appuyez doucement sur le verre sur la graisse (Figure 3).
3. Assemblage du support
   1. Préparer 100 µL d’un système d’expression acellulaire et gardez-le sur la glace.
   2. Avec précaution, retirer le tampon de la puce et le laver une fois à 10 µL de système d’expression acellulaire. Ensuite, ajouter 60 µL du système d’expression acellulaire sur la puce et enlever la colle bi-composant silicone sur les bords de la puce (supprimé dans la Figure 3 b).
   3. Ajouter 20 µL du système d’expression sur le PDMS. Après avoir placé la goutte sur le PDMS, vérifier rapidement dans le microscope stéréoscopique que les compartiments sont bien humides et sans bulles d’air. S’il y a des bulles d’air, essayez de les laver avec le reste du système acellulaire expression.
   4. Pour assembler les deux pièces du titulaire et pour aligner les chambers et ADN brosses, travailler sous un microscope stéréoscopique et immobiliser le support de fond avec un bras de la pince, alors les deux vis et écrous à oreilles sont facilement accessibles avec les deux mains (Figure 3D-F ).
   5. Insérez le support haut dans le support de fond et l’abaisser jusqu'à ce que les gouttelettes de système acellulaire expression fusionnent (Figure 3D). Vérifier au Microscope stéréoscopique si les compartiments et le repère d’alignement sont une région similaire dans le plan x-y-, sinon tirez vers le haut le support supérieur et repositionner le verre slide sur le haut de la page support.
   6. Du fond, bousiller les écrous à oreilles jusqu'à ce qu’ils touchent la face inférieure du titulaire. Bien serrer les écrous à oreilles, tout en alignant les compartiments et la puce dans le plan x-y via la poignée au bas de la titulaire de la puce (Figure 3E). Une fois en contact, serrer les écrous à oreilles seulement très légèrement (Figure 3F).
      Remarque : Cette étape exige une certaine expérience et dépend du montage expérimental. Au microscope, des modèles d’interférence provenant de liquides entre PDMS et verre peuvent indiquer que la force appliquée est trop petite, alors que d’une intensité de fluorescence inférieure (d’une brosse d’ADN ou de protéines exprimées) au centre d’un conseils de compartiment à une trop forte pression (voir aussi des informations complémentaires, section 6).
   7. Vaporisez l’éponge dans l’enceinte de l’évaporation d’eau et insérez le support dans la boîte. Remplissez une seringue de 5 mL avec de la colle silicone bi-composant et utilisez-le pour sceller la boîte (Figure 3).
   8. La boîte de transfert à un microscope à température contrôlée et le pinceau de l’ADN et la réaction en microscopie de fluorescence de l’image. Même en l’absence d’éclairage, la fluorescence de la brosse d’ADN s’estompe dans un système d’expression acellulaire. Néanmoins, la brosse conserve son activité, comme peut être affiché par l’expression des gènes répétés de la même brosse.
      Remarque : Lorsque vous utilisez une lame de verre de Bephore au lieu d’une puce de silicium, la position (haut/bas) de copeaux PDMS et Bephore peut être échangée, permettant d’utiliser des objectifs avec les petites distances de travail.

6. soutenue Expression dans des dispositifs microfluidiques

Remarque : Le dispositif expérimental est assemblé à partir les pièces indiquées sur la Figure 4 a. Détails sur l’ensemble de la scène à température contrôlée sont donnés dans les informations complémentaires (article 7).

1. Tubes et système d’expression acellulaire
   1. Préparer le système d’expression libre de cellules dans un tube à essais (environ 200 µL). Billes de polystyrène étiquetés avec les colorants fluorescents peuvent être ajoutés à plus tard moniteur le débit à travers une chaîne d’approvisionnement.
   2. Connecter le tuyau à un contrôleur de pression. Placer le tube dans un réservoir de glace qui garde au froid pendant 12 heures. Glace de rechange si nécessaire.
      Remarque : Comme alternative à un contrôleur de pression, un pousse-seringue fournit un débit constant du système d’expression acellulaire, même si les variations de résistance de débit, par exemple en raison de bulles d’air, qui pourrait aider à long terme des expériences.
   3. Raccorder le tube contenant le système d’expression acellulaire de PTFE tube (diamètre intérieur de 0,8 mm), qu’il atteint à la platine chauffante. Casser une aiguille de seringue (de 0,9 mm de diamètre) en morceaux de 1 à 2 cm avec les extrémités franches et insérer une pièce dans le tube PTFE. Il servira plus tard comme connecteur pour le PDMS. Essayez de réduire au minimum la longueur du tuyau entre le stade et le tube (Figure 4).
   4. Pour refroidir le tube PTFE, enroulez-la autour des plus grands tubes en caoutchouc qui est relié à un réservoir d’eau glacée et une pompe péristaltique. Avec du ruban adhésif avec du Scotch ruban (Figure 4).
2. Assemblage du support supérieur
   1. Nettoyer le côté plat de la puce PDMS avec plasma oxygène (42 s) et le placer sur une lame de microscope avec trous de montage d’entrée et sortie de la PDMS (Figure 4 b). Les trous dans le verre peuvent être percés au préalable avec un verre tête de forage. Assurez-vous que les micro-chambres ne sont pas face à la lame de verre.
   2. S’applique à ruban adhésif double-face sur le côté plat du détenteur du PDMS. Coller un bout de papier noir (par exemple d’un masque de lithographie) dans la région entre les deux trous du support afin d’éviter la fluorescence de fond du ruban adhésif.
   3. Tenir la lame de verre avec la puce PDMS au titulaire.
   4. Traiter le PDMS et le support PDMS avec le verre ci-joint glissent avec le plasma d’oxygène dans un plasma nettoyant (42 s).
   5. Appliquez de la graisse sous vide autour du grand trou dans le haut de la page support et fixer le porte PDMS (Figure 4 b). Le titulaire PDMS adhère maintenant au titulaire du haut de la page, tout en conservant la possibilité de re-positionnement dans les directions x-y.
   6. Raccordez le tuyau de PTFE avec le connecteur de l’aiguille de seringue à l’entrée de la puce PDMS. Pour faciliter l’accès à du PDMS dans le haut de la page support, la plaque supérieure en plastique peut être brièvement enlevée pour cela et pour l’étape suivante.
   7. Insérer un deuxième morceau de PTFE, tube (environ 5 cm) avec un connecteur d’aiguille de seringue à la sortie (Figure 4).
   8. Positionner le support PDMS dans le haut de la page support n’est libre de se déplacer dans toutes les directions. Place le support haut vaguement sur la platine chauffante comme dans la Figure 4E sans serrer les écrous à oreilles.
   9. Au microscope, à naviguer vers la position des compartiments PDMS et centrer dans le champ de vision de la caméra. Ne pas déplacer la scène de ce point.
   10. Retirez le support supérieur et le PDMS de la scène.
3. Platine chauffante et lame de verre Bephore
   1. Régler la température de la platine chauffante à 37 ° C
   2. Coller une lame de verre Bephore (no 4) avec les brosses de gène à l’étape de température contrôlée du microscope inversé de fluorescence à l’aide de ruban adhésif double-face, avec le repère d’alignement approximativement au centre du champ visuel du microscope. Ce positionnement de la marque d’alignement s’assure que les compartiments seront réduits à peu près à la même région.
   3. Prendre une image dans le canal de fluorescence correspondant de la brosse de gène et marquer sa position dans l’image de la caméra.
   4. Enlever le tampon de la brosse de gène, mais ne le laissez pas aller à sec. Ajouter 20 µL du système cellulaire - liberté d’expression à la brosse de gène et utilisez la pince à épiler pour enlever le cadre de la colle silicone.
4. Montage de l’installation de microfluidique
   1. Ajouter la pression dans le tube échantillon jusqu'à ce que le système d’expression acellulaire a rempli le tube PTFE et apparaît en bas de l’appareil PDMS. En outre, déposer 10µl de système d’expression acellulaire sur les micro-chambres sur le PDMS. Assurez-vous que les compartiments ne comportent pas de bulles d’air.
   2. Avec précaution, abaisser le support supérieur sur la lame de verre et aligner les micro-chambres avec le pinceau de gène. Avant marque PDMS et l’alignement atteignent le même plan focal, utilisez les petites vis à l’arrière de la porte PDMS pour aligner précisément la position x-y et l’orientation de l’appareil PDMS avec le pinceau de gène (Figure 4E).
   3. La position et appuyez sur le PDMS sur la lame de verre en serrant les écrous à oreilles le long des vis qui relient le haut de la page support à la platine du microscope (Figure 4E).
   4. Augmenter la pression dans le tube contenant le système d’expression acellulaire et surveiller le flux des perles fluorescentes à travers le canal d’alimentation (débit taux entre 0,5 à 5 µl par heure sont recommandés) (Figure 4F). Si nécessaire, augmenter la pression de la PDMS sur le verre en serrant les écrous à oreilles.

Lithographie en deux étapes : la Figure 5 montre le résultat d’un procédé lithographique en deux étapes sur une lame de verre qui se chevauchent de patrons de fluorescent étiquetés DIS brins.

Expression d’une protéine fluorescente de la brosse de gène : la Figure 6 illustre l’expression de la protéine fluorescente YPet d’ADN immobilisée. À plusieurs moments que nous avons évalué le taux d’expression de gène de blanchiment en partie la protéine fluorescente et en observant la récupération du signal de fluorescence, ignorant la récupération immédiate, qui ne résulte pas d’expression de la protéine. Après le premier blanchiment à deux heures d’expression, l’intensité de la fluorescence récupéré rapidement et est passé au-dessus de sa valeur avant le blanchiment. Après quatre et six heures, la fluorescence n’a pas récupéré à son intensité précédente, ce qui indique que sans l’apport de mélange d’expression douce, la réaction terminée après environ 3-4 h.

Couplage de microfluidique : expression des gènes peut être maintenue sur de longues périodes de temps en fournissant les compartiments d’expression avec les molécules précurseurs supplémentaires via la microfluidique. La figure 7 montre un tel système, permettant l’expression de YPet plus de 10 h.

Observation de la FRBR : Bephore peut également être appliquée pour étudier l’interaction des protéines fluorescent étiquetés avec une brosse d’ADN au niveau de la molécule. Surtout dans un environnement bruyant, lithographie permet de distinguer entre une interaction spécifique et non spécifique avec la brosse ou à la surface, respectivement. La figure 8 donne un tel exemple, avec fluorescent étiquetés ARN polymérase T7 contraignant ou préférentiellement sur le pinceau de l’ADN par rapport à la surface environnante.

Figure 1 : Photolithographie Bephore. A. un substrat avec une surface de dioxyde de silicium (SiO2) est recouverte d’une couche de biotinylé polyéthylène glycol (PEG-bt), qui est biocompatible et permet le branchement d’une épingle à cheveux d’ADN PHOTOCLIVABLES d' via interactions de streptavidine-biotine. Ici, PC contient la séquence domaines abcb * et une modification de la PHOTOCLIVABLES (purple star) et est hybridé au strand PH avec nom de domaine un *. B. l’éclairage Ultraviolet (UV) Clive PC, libérant un fragment d’ADN (cb *) dans la solution. C.-d. La région de simple brin qui en résulte sur le sida de PC (b) comme un pied pour le déplacement du PH par un fluorescent étiqueté (étoile verte) DIS brin. E. aussi long, bicaténaire ADN (« Template ») peut être fixé à la surface à motifs. Ce ADN est préparée par PCR avec un apprêt transportant une séquence DIS à son extrémité 5', où l’apprêt et DIS sont séparés par une entretoise de glycol de triéthylène à garder DIS monocaténaire pendant l’ACP (voir aussi des informations complémentaires, articles 2-4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2 : Préparation pour photolithographie de l’échantillon. A. placer une puce de Bephore avec un repère d’alignement sur une lame de microscope ou un autre titulaire de puce (p. ex. le titulaire dans la Figure 3 b). Appliquez de la colle bi-composant silicone comme une barrière hydrophobe sur les bords de la puce (pas 3.1.2-3). B. Placez le masque sur un support de masque. Ici, nous avons supprimé l’iris de l’arrêt du champ et modifié son titulaire donc le masque peut être tenu de petits aimants. Pour un alignement précis (angulaire) en plusieurs étape lithographie, veiller à ce que l’alignement des marques sur le titulaire et le match de masque (étape 3.2.1). C. pour naviguer sur la puce et d’aligner le masque avec les marques d’alignement sur la puce, glissez dans le filtre rouge. Pour l’exposition aux UV, insérez le filtre UV (pas 3.2.2-5). Figure reproduite de l’Information à l’appui de précédents travaux27. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Montage d’un titulaire pour l’observation de l’expression génique compartimentée. A. parties du titulaire (unité de règle : cm). B.-c. Partie supérieure et inférieure du titulaire sont assemblés séparément, avec l’exploitant de fond une puce de Bephore à motifs (article 5.1) et le haut de la page exploitant une puce PDMS à compartiments (section 5.2). D.-f. Puce et PDMS sont soigneusement mis en étroit contact, tout en observant et en alignant les compartiments et les pinceaux d’ADN dans un microscope stéréoscopique (mesures 5.3.1-6). G. avant de transférer le titulaire à un microscope inversé, température contrôlée, l’ensemble du système est encapsulé dans un boîtier anti-évaporation (pas 5.3.7-8). Figure reproduite de l’Information à l’appui de précédents travaux27. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Microfluidique titulaire d’installation et d’échantillon pour l’expression du gène compartimentée. A. parties du porte-échantillon, le dispositif PDMS, la platine du microscope à température contrôlée et la lame de verre Bephore (unité de règle : cm). B. une lame de microscope transportant le PDMS avec compartiments est collée à la titulaire PDMS et exposée à plasma d’oxygène avec le PDMS dans un plasma cleaner. Le PDMS est ensuite insérée dans le support supérieur (pas 6.2.2-5). C. le tube de système d’expression acellulaire est connecté à un contrôleur de pression et mis dans la glace. Le tube (ligne rouge pointillée dans l’encart) pour le système d’expression acellulaire est refroidi par le tuyau (ligne pointillée bleue) à travers lequel l’eau glacée est pompée par une pompe péristaltique (section 6.1) en caoutchouc. D. Le tube est relié à la position de l’entrée sur le périphérique PDMS. Un autre morceau de tube est branché sur la prise (pas 6.2.6-7). E. le titulaire de la haut de la page est placé sur la platine du microscope et soigneusement abaissé vers la diapositive Bephore. Le titulaire PDMS peut encore être déplacé dans le plan x-y-pour aligner les compartiments dans le PDMS avec le pinceau de gène sur la puce Bephore. Les écrous à oreilles servent à appuyer le PDMS sur la puce Bephore et fixez le support supérieur de la platine du microscope (mesures 6.4.1-3). F. système d’expression acellulaire est pompée à travers les canaux-micro dans le PDMS et l’expression des gènes de brosses d’ADN peut être surveillée en microscopie à épifluorescence (étape 6.4.4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Photolithographie en deux étapes. A-B. Fluorescent étiqueté oligonucléotides (vert : ATTO 532 ; rouge : Alexa Fluor 647) ont été successivement immobilisée sur une Bephore verre diapositive via masque projection lithographie avec temps d’exposition de 45 s. C. Superposition de subfigures A et B, ce qui démontre l’alignement précis de la seule exposition. Barreaux de l’échelle : 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Compartimenter l’expression des gènes. A. brosse A ADN sur une lame de verre Bephore (durée d’exposition UV : 2 min), codage de la protéine fluorescente YPet était aligné avec un compartiment sur une puce PDMS (voir la section 5 et la Figure 3). B. l’expression des gènes dans la chambre avec l’ADN a donné un signal de fluorescence forte avec un gradient de concentration des protéines formant le long d’un canal, qui reliait la chambre à la combinaison de l’expression à l’extérieur de l’appareil PDMS. La chambre de contrôle sans gènes immobilisés est resté relativement sombre. C. profil d’intensité de Fluorescence au fil du temps pour les deux chambres. Toutes les deux heures la protéine fluorescente a été partiellement blanchie (flèches noires) pour vérifier si l’expression était encore active. Après 4 h, la fluorescence n’a pas récupéré à son intensité précédente, indiquant qu’il avait mis fin à l’expression. Barreaux de l’échelle : 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Expression des gènes compartimentée soutenue. A. brosse A ADN sur une lame de verre Bephore (durée d’exposition UV : 2 min), codant pour la YPet a été alignée sur un compartiment sur une puce PDMS. Les compartiments sont reliés à un canal d’alimentation (flèche blanche) à travers lequel système d’expression acellulaire est pompée (voir chapitre 6 et Figure 4). B. le compartiment contenant le pinceau de gène montre un signal de fluorescence de l’expression YPet (en vert) par le système d’expression de gène acellulaire. Le compartiment voisin sans une brosse de gène reste relativement sombre. Composants frais du système acellulaire expression traversent la chaîne d’approvisionnement et diffusent dans les compartiments, tandis que les déchets produits sont emportés. C. profil d’intensité de Fluorescence au fil du temps pour les deux chambres. Les protéines fluorescentes ont été partiellement blanchis à différents points dans le temps (flèches noires) pour vérifier si l’expression était encore active. En raison de l’écoulement dans le canal d’alimentation, l’expression des gènes a été maintenue pendant au moins 10 h. (le pic dans la trace rouge marqué par la flèche rouge a été causé par une bulle d’air qui drainaient temporairement la solution des compartiments). Barreaux de l’échelle : 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Études de la molécule unique sur Bephore verre diapositives en microscopie de fluorescence de réflexion totale interne (TIRFM). A. objectif de type TIRFM permet l’imagerie seule molécule proche de l’interface eau-verre. Nous avons immobilisé gènes fluorescent étiquetés (vert, ATTO 532, durée d’exposition UV : 2 min) avec un T7 promoteur au long lithographically défini à rayures et observé le comportement de l’ARN polymérase T7 (orange, marqués à l’Alexa Fluor 647) interagit avec la surface. B. image de Fluorescence montrant deux bandes de gènes immobilisées. C. T7 ARN polymérases fixer plus précisément et non spécifique à la surface (image unique, temps d’exposition de 50 ms). D. Une image moyenne obtenue de toutes les images d’une vidéo de fluorescence (5 000 images telles qu’en subfigure C) expose l’interaction spécifique de l’ARN polymérase avec le pinceau de l’ADN. Barreaux de l’échelle : 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.