À l’aide de systèmes robotiques pour traiter et intégrer coliques Murine échantillons pour Analyses histologiques

Summary

Manque de normalisation pour le traitement des tissus murins réduit la qualité de l’analyse histopathologique murin par rapport aux spécimens humains. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’examen histopathologique des tissus coliques murines, enflammées et inflammθe, à démontrer la faisabilité des systèmes robotiques couramment utilisées pour le traitement et l’incorporation des échantillons humains.

Abstract

La compréhension des maladies humaines a été considérablement élargie grâce à l’étude de modèles animaux. Néanmoins, histopathologique des modèles expérimentaux doit être aussi rigoureuse que celle appliquée pour les échantillons humains. En effet, tirer des conclusions fiables et précises critique dépend de la qualité de tissu section préparation. Nous décrivons ici un protocole pour l’analyse histopathologique des tissus murins qui implémente plusieurs étapes automatisées au cours de la procédure, de la préparation initiale à l’enrobage de paraffine des échantillons murines. La réduction des variables méthodologiques grâce à la normalisation du protocole rigoureux des procédures automatisées contribue à une plus grande fiabilité globale d’analyse pathologique murine. Plus précisément, ce protocole décrit l’utilisation d’un traitement automatisé et intégration de systèmes robotiques, couramment utilisées pour le traitement des tissus et enrobage de paraffine d’échantillons humains, pour traiter des spécimens murins d’inflammation intestinale. Nous concluons que la fiabilité de l’examen histopathologique des tissus murins est sensiblement augmentée lors de l’introduction de techniques standardisés et automatisés.

Introduction

Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour disséquer les mécanismes pathogènes conduisant à des maladies humaines^1,2. Afin d’évaluer la gravité d’une maladie, les chercheurs doivent évaluer l’effet d’un traitement et étudier les variations architecturales cytologiques et histologiques ou le montant de l’inflammation,³. Pour effectuer sur ces modèles expérimentaux, des analyses détaillées histopathologiques sont nécessaires, souvent en comparant des échantillons murins et humains^4,5.

En outre, des échantillons humains sont généralement traités et marqués par des installations de base histopathologie et expérimentés pathologistes humaines à travers standardisé critères histopathologiques et méthodes. À l’inverse, tissus murins sont habituellement fixes, intégrées et analysés par des chercheurs ayant une expérience limitée des protocoles histopathologiques. La qualité et la fiabilité de l’examen histopathologique commence par la préparation des coupes de tissus de haute qualité. Plusieurs facteurs contribuent critique pour augmenter ou diminuer la qualité de l’analyse finale, y compris la fixation, macroscopique de sectionnement, de transformation, de paraffine incorporation et incorporation des échantillons^6,7.

Tous ces passages impliquant la manipulation de l’échantillon sont soumis à des erreurs manuelles, y compris l’intégration manuelle des échantillons et, dans une moindre mesure, manuel microtome de sectionnement et de coloration. À l’heure actuelle, l’ensemble du processus de préparation de tissus murins pour évaluation histologique repose sur des protocoles qui varient d’un laboratoire à et protocoles manuelles. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre des protocoles standardisés et automatisés pour réduire les erreurs et la variabilité dans l’examen histopathologique murine.

À notre connaissance, nous décrivons ici les premiers protocoles pour tissu entièrement automatisé de traitement et d’incorporation d’évaluation histologique des tissus murins ; Ces sont couramment utilisées dans les unités de pathologie pour les analyses d’échantillons humains. Un exemple concret de la faisabilité de la méthode, un modèle murin d’inflammation intestinale a été analysé, c'est-à-dire, le modèle de colite chronique causée par l’ingestion répétée de sulfate de sodium de dextran (DSS) dans l’eau potable^{8 ,9}. Ce paramètre expérimental étroitement ressemble à humaine inflammatoire de l’intestin (IBD) les maladies¹⁰ car les animaux traités DSS montrent des signes d’inflammation intestinale, par exemple, perte de poids, selles ou diarrhée et raccourcissement de la colon ainsi que la fibrose ^8,9,11. Tel qu’observé pour des patients humains IBD, traitement DSS génère une évolution de la maladie complexe. Dans ce contexte, évaluations histologiques complexes sont nécessaires pour comprendre la profonde altération de l’architecture du tissu. Ainsi, la mise en œuvre des protocoles décrits pour augmenter la qualité de préparation d’échantillon peut-être bénéficier des chercheurs en se fondant sur l’interprétation de histologique et immunohistochimique analyse des paramètres expérimentaux murins. Des modèles expérimentaux murins de maladies humaines impliquant des modifications de l’architecture tissulaire, la présence d’infiltration du tissu cellulaire ou d’inflammation dans différents tissus et organes (intestin, cerveau, foie, peau) pourrait utiliser la qualité accrue de la préparation d’échantillons pour examen histopathologique.

Protocol

Procédures d’animaux ont été approuvés par le ministère italien de la santé (auth. 127/15 27/13) et suivait les directives de protection des animaux de l’Institut européen d’oncologie IACUC (Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme)

1. chronique de colite Induction par Administration de DSS répétitives

1. Séparé âge et le sexe correspondant souris en 2 groupes (traitement DSS vs contrôle H₂O, au moins 5 autres souris par groupe expérimental).
2. Administrer 2,5 % DSS (40 kDa) dans l’eau potable pendant 7 jours pour le groupe de traitement et de l’eau pour le groupe témoin.
   Remarque : Ce modèle induit une inflammation intestinale chronique transmurale⁹.
3. Après 7 jours, arrêtez le traitement DSS et donner de l’eau pour les deux groupes pendant 14 jours. Répétez cette opération 3 fois.
   NOTE : Administration répétitive du mas induit des altérations de la muqueuse colique ressemblant étroitement à EIA humaine, c'est-à-dire, la fibrose⁹.
4. Sacrifier la souris selon les procédures autorisées par l’IACUC institutionnelle, c'est-à-dire, par l’inhalation de CO₂ .
5. Ouvrir le ventre de la souris et le péritoine avec un scalpel.
   Remarque : La stérilité est recommandée mais pas strictement obligatoire.
6. Séparer le côlon de l’intestin grêle avec pince et pince à épiler. Le côlon avec pinces et pinces de l’accise.
   Remarque : Mesure de la longueur du côlon (Figure 1 a) est une méthode pour déterminer si la colite a eu lieu chez les souris traitées DSS.
7. Rincer les deux-points dans une boîte de pétri avec 10 mL de froid 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) et appuyez doucement pour éliminer les matières fécales.

2. murin tissus Fixation

1. Plongez chaque spécimen murin de colon dans 10 mL de 10 % neutre tamponné au formol (NBF) à ta (température ambiante).
   Remarque : La stérilité est recommandée mais pas strictement obligatoire.
2. Difficulté le tissu pendant 18 à 24 h à température ambiante.

3. deux points de sectionnement et de préparation du tissu

1. Retirer le conteneur NBF tissus fixés avec petites pinces et mettez-les dans un plat de pétri. Mettre les deux points sur une plaque de travail sectionnement avec petites pinces.
2. Couper les deux-points dans les fragments (0,2 cm de longueurs de 0,3 cm) avec un scalpel stérile. Cette longueur de fragment est optimale pour ne pas dépasser l’épaisseur de la cassette.
3. Ramasser le segment 1 colon avec petites pinces (Figure 2 a). Insérez segment 1 colon dans un du plastique qui dépassent les conseils de la paraffine orientée intégration cassette avec petites pinces (Figure 2 b).
4. Répéter l’opération (3.2, 3.3) avec un segments 3 deux points supplémentaires par cassette. Évitez d’insérer les segments en extrémité saillante adjacents, pour minimiser le chevauchement des tissus
5. Bien fermer la cassette en poussant délicatement les quatre arêtes (Figure 2). Éviter de presser le tissu afin d’éviter des lésions tissulaires.
6. Insérez la grille dans une structure de support en plastique. La structure portante pour identifier l’échantillon de l’étiquette. Répétez pour chaque échantillon biologique.

4. traitement de tissu

1. Mettez le processeur automatisé en appuyant sur le bouton d’alimentation (Figure 3 a, 3 b).
2. Chauffer pendant 1 h afin de faire fondre la cire de paraffine. Attendez que l’appareil confirme que la paraffine est complètement fondue, en observant la présence de l’icône dédié (Figure 3).
3. Insérez chaque cassette orienté (contenant les échantillons de tissus) manuellement dans le panier métallique fourni par le processeur automatisé (Figure 3D). Placez les cassettes verticalement en les alignant à proximité d’un à l’autre afin d’optimiser l’occupation de panier.
4. Fermer le panier métallique (Figure 3E).
5. Ouvrez le couvercle de la riposte (Figure 3F). La riposte est l’endroit où est placé le panier dans la machine. Insérer le panier dans le boîtier dédié du processeur (Figure 3). Fermer le couvercle de la riposte (Figure 3 H).
6. Utilisez l’écran tactile sur l’ordinateur de l’instrument pour définir le protocole de travail (Figure 3I). Choisir la séquence de solutions, calendrier et température à mettre en œuvre selon le schéma fourni dans le tableau 1.
7. Affecter le protocole pour être exécuté sur la riposte contenant le panier en cliquant sur l’icône ordinateur dédié (Figure 3J). Commencer le protocole en cliquant sur le Bouton démarrer (Figure 3 L).
8. Attendez que l’appareil confirme la fin du protocole, en observant la présence de l’icône dédiée et en entendant la sonnerie d’alarme provenant de la machine.
9. Ouvrez le couvercle de la riposte. Retirez le panier du transformateur (Figure 3 M).

5. tissu incorporation

1. Allumez l’embedder automatique en appuyant sur le bouton d’alimentation (Figure 4 a).
2. Chauffer pendant 1 h afin de faire fondre la cire de paraffine. Attendez que l’appareil confirme que la paraffine est complètement fondue en observant la température du bain de paraffine, indiquée par le thermomètre interne de l’instrument.
3. Transférer manuellement toutes les cassettes transformés du panier processeur sur le rack embedder. Chaque grille peut contenir jusqu'à 32 cassettes. (Figure 4 b, 4C).
4. Ouvrir le couvercle principal embedder (Figure 4, 4D, 4E).
5. Utilisez l’écran tactile sur l’ordinateur de l’instrument pour signaler à la robotique système qu’un rack est inséré (Figure 4F).
6. Ouvrez le couvercle du boîtier d’admission (Figure 4). Placer la grille dans la boîte d’entrée. Chaque embedder peut contenir jusqu'à 4 grilles simultanément (Figure 4 H, 4I). Fermer le couvercle du boîtier d’admission (Figure 4J).
7. Utilisez l’écran tactile sur l’ordinateur de l’instrument pour commencer la procédure d’incorporation, d’après le tableau 2 (Figure 4 K).
   Remarque : Chaque carré de 32 cassettes prend 45 min pour être embarquée.
8. Attendez que l’appareil confirme la fin du protocole, en observant la présence de l’icône dédié (Figure 4 L).
9. Retirer la grille de sortie (Figure 4 M). Fermer le couvercle principal embedder.
10. Supprimer les blocs embarqués (contenant les grilles d’orientation) de la crémaillère. Transférer les blocs incorporés dans une boîte de rangement en carton.

6. micromètre de sectionnement

1. Tourner sur la plaque de refroidissement du microtome. Régler la température entre -8 et -10 ° C.
2. Allumez le bain-marie thermostatique du microtome, contenant 2 L d’eau distillée. Régler la température de l’eau du bain entre 42 et 45 ° C.
3. Place la paraffine les blocs sur le plateau de refroidissement incorporés. Attendre au moins 5 min pour permettre les blocs se refroidir.
4. Prenez un pâté de maisons de la plaque de refroidissement et placez-le dans le porte-bloc microtome.
5. Définissez le microtome coupé épaisseur à 10 µm. Trim le bloc en le coupant fois 6 à 10 µm d’épaisseur.
6. Changer le réglage de l’épaisseur du microtome de 10 µm à 3 µm. coupe un 3 µm section hématoxyline et éosine (H & E) coloration.
7. Recueillir la section 3 µm, avec une petite brosse. Placer la section de 3 µm dans le bain-marie, posant délicatement sur la surface de l’eau pour réduire les rides de tissu. Recueillir la section tissus du bain-marie thermostaté sur une lame de verre unique.
   1. Si nécessaire, couper des sections supplémentaires.
8. L’étiquette de la lame de verre en écrivant l’identification de l’échantillon.
9. Placez les diapositives dans un four à 37 ° C pendant au moins 10 min.
10. Mettre lames de verre dans les racks pour l’analyse immédiate ou dans les boîtes de rangement.

7. l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration

1. Allumez le passoire automatique en appuyant sur le bouton d’alimentation. Permettre l’initialisation du bras robotisé, en observant le changement de la barre de chargement sur l’écran de l’instrument.
2. Insérer les lames de verre dans le panier de stainer, insérant verticalement jusqu'à 30 diapositives.
3. Étiqueter le rack avec l’étiquette en plastique de radiofréquence approprié d’identification (RFID). Marquage RFID est un système d’identification du protocole de coloration correct chargé dans l’ordinateur de stainer.
4. Insérer le panier dans la passoire. Laissez l’ordinateur automatiquement charger et démarrer le protocole de coloration selon la reconnaissance de l’étiquette RFID.
   Remarque : Le protocole pour la coloration H & E est décrit dans tableau 3.

8. marquage immunohistochimique

1. Effectuer immunohistochimiques et Mallory trichrome coloration comme décrit précédemment⁷.

Results

Colite chronique expérimentale induite par l’administration répétée de DSS dans l’eau potable est un modèle murin d’inflammation intestinale ressemblant humaine EIA^8,9. La figure 1 décrit les effets du traitement de DSS, y compris le côlon raccourcissement (Figure 1 a), un paramètre utilisé pour marquer la présence de l’inflammation induite par le DSS et colique expressio...

Discussion

Nous utilisons différentes étapes automatisées lors de la préparation des tissus murins pour l’analyse histopathologique. Ce protocole vise à fournir des conseils techniques pour augmenter la reproductibilité et la standardisation de l’ensemble du processus, ce qui améliore la qualité globale de l’évaluation finale histopathologique. Nous avons implémenté des instruments automatisés et méthodes pour la préparation et l’incorporation de tissus, couramment utilisés dans des installations de centrales de pathologie pour l’é...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif Absolute Ethanol anhydre	Carlo Erba	414605
Réactif Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L
Réactif Sulfate d’aluminium et de potassium	SIGMA	A6435
Aniline Blue	SIGMA	415049	réactif
carbol Fuchsin	SIGMA	C4165	réactif
CD11b (clone M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	anticorps
CD20 IHC (clone SA275A11)	Biolegend	150403	anticorps
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	anticorps
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	anticorps
CD45.2 (clone 104)	BioLegend	109837	anticorps
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	anticorps
Citrate Buffer pH 6 10x	SIGMA	C9999	réactif
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	réactif
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	réactif
DSS	TdB Consultancy	DB001	réactif
EDTA	SIGMA	E9884	réactif
EnVision Flex Réactif bloquant la peroxydase	DAKO		compreso en GV80011-2
Substrat EnVision Flex	DAKO		compreso en GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso en GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso en GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	réactif
F4/80 (clone BM8)	Anticorps BioLegend	123108
Formalin	PanReac	2,529,311,215	réactif
acide acétique glacial	SIGMA	71251	réactif
Goat-anti-Rat-HRP	Agilent DAKO	P0448	anticorps
Haematoxylin	DIAPATH	C0303	réactif
LEICA Microtome rotatif (RM2255)	Leica	RM2255	équipement
Ly6g (clone 1A8)	BD Biosciences	551459	anticorps
Oxyde de mercure II	SIGMA		203793 réactif
Omnis Clearify Agent de clarification	DAKO	CACLEGAL	réactif
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	réactif
Orange G	SIGMA	O3756	réactif
Paraffine	Sakura	7052	réactif
Peloris	LEICA		équipement
Percoll	SIGMA	P4937	réactif
RPMI 1640 sans L-Glutamine	Microgem	L0501-500	réactif
STS020	Leica		équipement
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette
Tissue-Tek Embedder automatisé de paraffine	Équipement Sakura
Xylene	J.T.Baker	8080.1000	réactif