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Article de méthode

Fabrication d’échafaudages Decellularise dérivé de Cartilage Matrix

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DOI :

10.3791/58656

⸱

7 janvier 2019

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, 2Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

Dans cet article

Résumé

Decellularise dérivés de cartilage échafaudages peuvent être utilisés comme un échafaudage pour la réparation du cartilage guide et comme un moyen de régénérer le tissu ostéochondral. Cet article décrit le processus de décellularisation en détail et offre des suggestions pour utiliser ces échafaudages en milieu in vitro.

Résumé

Cartilagineuses défauts n’ont pas une capacité suffisante de réparation intrinsèque pour régénérer fonctionnellement son tissu osseux et du cartilage. Dans cette mesure, recherche de cartilage a mis l’accent sur l’élaboration d’échafaudages régénératrices. Cet article décrit le développement d’échafaudages entièrement dérivées de la matrice extracellulaire du cartilage naturel, provenant d’un donneur équin. Les applications potentielles des échafaudages incluent la production allogreffes pour la réparation du cartilage, agissant comme un échafaudage pour tissu ostéochondral ingénierie et en fournissant des modèles in vitro afin d’étudier la formation des tissus. Par decellularizing le tissu, les cellules du donneur sont supprimés, mais beaucoup d'entre les repères naturels bioactifs sont censés être conservés. L’avantage principal d’utiliser tel un échafaudage naturel par rapport à un échafaudage synthétiquement produit est qu’aucun autre fonctionnalisation des polymères n’est nécessaire à la régénération des tissus cartilagineuses du lecteur. Les échafaudages de matrice dérivée du cartilage peuvent être utilisés pour la régénération des tissus osseux et cartilagineux dans les milieux tant in vivo qu’in vitro.

Introduction

Défauts de cartilage articulaire au genou causée par des événements traumatisants peuvent conduire à l’inconfort et surtout peuvent avoir un impact important sur la vie de la population jeune et active1,2,3. En outre, les lésions du cartilage à un jeune âge peuvent entraîner une apparition plus rapide de l’arthrose plus tard dans la vie4. Actuellement, la seule thérapie de récupération généralisée d’arthrose du genou est la chirurgie de remplacement de l’articulation. Le cartilage est un hypocellular, aneural et tissu avasculaire, sa capacité de régénération est sévèrement limitée. Par conséquent, des approches de la médecine régénératrice sont recherchées pour aider et stimuler la capacité de régénération du tissu native. À cette fin, les échafaudages sont conçus et utilisés comme soit un porte-cellule ou un matériel inductif qui incite à la différenciation et la régénération des tissus par cellules natives5 du corps.

Échafaudages decellularise ont été largement étudiés au sein de la médecine régénérative,6. Il a eu un certain succès, par exemple, en aidant la régénération de la peau7structures abdominales8et tendons9. L’avantage de l’utilisation des échafaudages decellularise est leur origine naturelle et leur capacité à retenir des indices bioactifs qui attirent et induisent la différenciation cellulaire dans la lignée appropriée requise pour la réparation de tissus6,10. En outre, puisque la matrice extracellulaire (ECM) est un biomatériau naturel et décellularisation empêche une immuno-réaction potentielle en supprimant le contenu cellulaire ou génétique, questions au sujet de la biocompatibilité et la biodégradabilité sont surmontées.

Échafaudages de matrice dérivée du cartilage (MDP) ont montré chondrogéniques grand potentiel dans des expériences in vitro lorsque ensemencée avec des cellules stromales mésenchymateuses11. En outre, ces échafaudages ont montré le potentiel de tissu osseux forme par le biais de l’ossification endochondrale sur emplacements ectopiques dans paramètres in vivo12. Que MDP échafaudages guident la formation des deux os et du tissu cartilagineux, ces échafaudages peuvent tenir potentiels pour la réparation de défauts cartilagineuses en plus de la réparation du cartilage.

Cet article décrit un protocole adapté de Yang et coll. (2010)13 pour la fabrication d’échafaudages de MDP decellularise d’équins étouffer du cartilage. Ces échafaudages sont riches en collagène de type II et dépourvue de cellules et ne contiennent pas des glycosaminoglycanes (GAGs) après décellularisation. Des expériences in vitro et in vivo sur la réparation de défauts chondrales (osteo) peuvent être effectuées à l’aide de ces échafaudages.

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Protocole

Pour ce protocole, le cartilage de l’articulation fémoro provenait de chevaux morts d’autres causes que l’arthrose. Tissu a été obtenu avec la permission des propriétaires, conformément à la réglementation éthique institutionnelle.

Remarque : Ce protocole décrit la fabrication d’échafaudages de cartilage équin decellularise, qui peut être utilisé pour des applications telles que les plates-formes de culture de tissus in vitro ou in vivo l’implantation dans les stratégies de la médecine régénérative. Les étapes de traitement enzymatique doivent être effectuées dans l’ordre chronologique décrit.

1. récolte du Cartilage articulaire de donateurs Joints (cadavres)

  1. Avant de l’étape de récolte, préparer 1 L de cartilage, solution de lavage, consistant en stérile tampon phosphate salin (PBS), additionné de 100 U/mL pénicilline 100 µg/mL de streptomycine et 1 % (v/v) amphotéricine b.
  2. Porter des gants et une blouse de laboratoire pendant la récolte toute procédure, étant donné que le donateur peut transporter des agents pathogènes.
  3. Obtenir un joint (cadavre) intact pour l’isolement du cartilage.
    Remarque : À ce stade, la peau autour de l’articulation est encore intacte. Grasset équine de cartilage provenant de cheval a été utilisé dans le présent protocole, mais peuvent également servir d’autres articulations des autres espèces.
  4. Enlever la peau qui se trouve autour de la zone mixte d’intérêt à l’aide d’un scalpel et une pince chirurgicale. En outre, supprimer excessif de graisse et le tissu musculaire si nécessaire, sans endommager l’articulation sous-jacente. Éventuellement, transférer le cadavre préparé à une armoire de sécurité biologique.
  5. Pour effectuer une arthrotomie, c'est-à-dire, une séparation de l’articulation, tout d’abord définir l’emplacement où l’articulation s’articule en effectuant l’extension et la flexion de l’articulation.
  6. Retirer délicatement le plus de couches de graisse, muscles et tendons avec un bistouri et pinces chirurgicales pour ouvrir la zone mixte.
  7. Faites une incision pour atteindre la cavité articulaire.
    Remarque : La cavité articulaire est remplie de liquide synovial, qui peut s’écouler de la cavité lors d’une incision correcte.
  8. Continuer d’ouvrir complètement l’articulation en sectionnant les tendons qui maintiennent l’articulation ensemble.
  9. Inspecter le cartilage des dommages macroscopiques.
    Remarque : Si le cartilage articulaire n’a pas un aspect brillant et lisse ou si évident de cloquage, fissures ou défauts sont présents, jeter le cartilage.
  10. Utiliser un scalpel stérile pour retirer le cartilage de l’os sous-chondral. Couper tout le chemin jusqu'à l’os sous-chondral de supprimer également la zone profonde du cartilage (Figure 1). Pour éviter que le cartilage se dessèchent, régulièrement s’écouler du cartilage, solution de lavage sur le cartilage.
    Remarque : A cette époque, la taille des tranches du cartilage est sans importance.
  11. Recueillir les tranches de cartilage en tubes de 50 mL contenant du cartilage préalablement préparé lavage solution (Figure 2 a).
  12. Après avoir recueilli le cartilage de toutes les zones d’intérêt, clin d’oeil a congeler les tranches de cartilage dans l’azote liquide pendant 5 min.
  13. Transférer les tranches de cartilage en tubes de 50 mL et immédiatement lyophiliser les tranches de cartilage pendant 24 h dans un gel sèche. Définissez le gel sèche environ 0,090 mbars tandis que le condensateur de glace est de-51 ° C (Figure 2 b).
  14. Rangez les tranches de cartilage dans un endroit sec à température ambiante jusqu'à une utilisation ultérieure.
    Remarque : Jusqu’au point de formation de l’échafaudage, les solutions et le cartilage ne pas être préparés et traités d’une manière stérile.

2. création de Decellularise particules de Cartilage

  1. Immerger les tranches de cartilage lyophilisée dans l’azote liquide.
  2. Directement de broyer les échantillons soit manuellement, soit par une fraiseuse. Lors du meulage des tranches de cartilage à la main, utiliser un mortier et un pilon et broyer les tranches pendant environ 45 min, jusqu'à ce qu’ils sont pulvérisés (Figure 2 et 2D). Lors du meulage automatiquement, utilisez une fraiseuse à sa vitesse préréglée pendant quelques secondes jusqu'à une minute, jusqu'à ce que les tranches de cartilage snap-congelés sont pulvérisés.
    Remarque : Refroidir préalablement le mortier ou le compartiment d’affûtage de la fraiseuse en ajoutant l’azote liquide. Lorsque vous utilisez une machine à fraiser, assurez-vous que toutes les particules sont au sol, et qu’aucune particule ne reste au fond du compartiment du broyage.
  3. Tamisez les particules de cartilage se débarrasser des pièces plus grandes à l’aide d’un tamis avec un maillage de 0,71 mm.
  4. Stocker les particules dans un endroit sec à température ambiante.

3. enzymatique décellularisation avec la trypsine 0.25%-EDTA

  1. Préparer la solution de digestion, composée de 0,25 % de trypsine avec EDTA additionné de 100 U/mL pénicilline 100 μg/mL de streptomycine et 1 % (v/v) amphotéricine B. Store la solution à 4 ° C.
    Remarque : Trypin est une protéase qui dégrade les protéines dans le tissu cartilagineux. Cette étape enzymatique va ouvrir la structure du cartilage dense.
  2. Remplir les tubes de 50 mL avec les particules pulvérisées cartilage jusqu'à un volume d’environ 7,5 mL par tube.
  3. Incuber les particules de cartilage avec la solution de digestion préparée à 37 ° C pendant 24 h au total, lors de l’actualisation de la solution de digestion toutes les 4 h.
    1. Tout d’abord, ajouter 30 mL de la solution de digestion dans chaque tube de 50 mL contenant des particules de cartilage.
    2. Ensuite, remettre en suspension les particules en utilisant un vortex ou pipette afin que toutes les particules sont exposées à la solution enzymatique.
    3. Incuber les échantillons pendant 4 h à 37 ° C sur un rouleau.
    4. Pour actualiser la solution de digestion, centrifuger les tubes pendant 20 min à 3113 x g provoque la sédimentation des particules du cartilage. Jeter le surnageant.
      Remarque : Le surnageant s’éclaircira avec chaque période d’incubation de la trypsine.
    5. Répétez l’étape 3.3.1–3.3.4 jusqu'à ce que les particules ont été incubées avec la solution de digestion pendant 6 cycles de 4 h.
  4. Après le cycle final, retirez le surnageant après centrifugation et laver les particules dans 30 mL de solution de lavage, deux fois plus de cartilage. Centrifuger les particules pendant 20 min à 3113 x g entre chacun des lavages.

4. enzymatique décellularisation nucléase traitement

  1. Préparer un 10 mM Tris-HCl solution à un pH de 7.5 dans l’eau désionisée.
  2. Ajouter 50 désoxyribonucléase U/mL et 1 ribonucléase U/mL A vers le tampon Tris-HCl, pour obtenir la solution de nucléase.
    Remarque : Cette étape est effectuée pour dégrader plus précisément déoxyribonucléases et ribonucléases.
  3. Pour retirer le cartilage solution des particules du cartilage (étape 3.4) de lavage, centrifuger pendant 20 min à 3 113 x get éliminer le surnageant.
  4. Ajouter 30 mL de la solution de nucléase aux particules de cartilage et remuer les particules via la solution, en s’assurant que toutes les particules sont exposées à la solution de nucléase.
  5. Incuber les échantillons sur un rouleau de 4 h à 37 ° C.
  6. Enlever la solution de nucléase en CENTRIFUGEANT les particules de cartilage pendant 20 min à 3 113 x g et éliminer le surnageant.
  7. Laver les échantillons en ajoutant 30 mL 10 mm Tris-HCl solution sans la désoxyribonucléase et la ribonucléase A aux particules de cartilage. Remettre en suspension les particules et laisser les échantillons sur un rouleau de 20 h à température ambiante.

5. détergente décellularisation

  1. Faire la solution détergente en dissolvant 1 % (v/v) octoxynol-1 dans du PBS.
  2. Retirer la solution Tris-HCl les particules du cartilage par centrifugation pendant 20 min à 3 113 x g et jeter le surnageant.
  3. Ajouter 30 mL de la solution détergente préparée de 1 % pour les particules de cartilage. Remettre en suspension les particules de cartilage doucement afin d’éviter la formation de mousse de la solution.
    Remarque : Cette étape se décompose les membranes cellulaires.
  4. Incuber les échantillons sur un rouleau pendant 24 h à température ambiante sur un rouleau.
  5. Supprimer la solution détergente par centrifugation pendant 20 min à 3 113 x g et éliminer le surnageant.
  6. Pour enlever tous les restes des solutions décellularisation, lavez les particules de cartilage dans 6 cycles de 8 h à 30 mL de solution de lavage de cartilage. Effectuer le lavage sur un rouleau à température ambiante.
    1. Pour remplacer le lavage suivant, centrifuger la suspension pendant 20 min à 3 113 x g, éliminer le surnageant et ajouter frais cartilage solution de lavage.
  7. Laisser le dernier lavage dans les tubes et stocker les particules de cartilage decellularise à-80 ° C.

6. création d’échafaudages depuis les particules Decellularise

  1. Si les particules ont été stockées à-80 ° C, dégelez les tubes fermés qui contiennent des particules de cartilage dans l’eau chaude avant de créer les échafaudages.
  2. Transférer les particules du cartilage avec une petite louche dans un moule cylindrique, par exemple, un flacon en plastique avec un diamètre de 8 mm et une hauteur de 2 cm.
  3. Lorsque vous placez les particules de cartilage dans le moule en plastique, presser tous les-bulles d’air dehors pour éviter les cavités à l’échafaud et remplissez le moule jusqu’au bord.
    Remarque : Il sera plus difficile de prendre les échafaudages sur un moule métallique après formation échafaudage, ce qui peut causer des fentes à l’échafaud.
  4. Congeler les moules avec des particules de cartilage pendant 10 min à-20 ° C.
  5. Lyophiliser les échafaudages de cartilage dans leurs moules pendant 24 h dans un gel sèche.
  6. Après lyophilisation, prendre l’échafaud sur le moule (Figure 3) et leur réticulation avec ultraviolets (UV) à une distance de 30 cm et 365 nm pendant la nuit.
  7. Pour pouvoir utiliser les échafaudages pour la culture cellulaire in vitro ou in vivo implantation, stériliser les échafaudages avec, par exemple, les gaz d’éthylène oxyde (EtO).
    Remarque : La stérilisation EtO est effectuée par une partie externe.

7. caractérisation des échafaudages Decellularise avec salissures histologique

Remarque : Afin d’assurer la complète décellularisation et de visualiser son caractère naturel du cartilage restant, effectuez plusieurs salissures histologiques avant d’utiliser les échafaudages dans toute expérience, y compris l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration afin d’assurer décellularisation, safranine-O coloration afin de visualiser la présence résiduelle de GAG, collagène de type I immunohistochemistry pour faire la différence entre la teneur en collagène et collagène type II immunohistochemistry pour faire la différence entre la teneur en collagène.

  1. Couper les échafaudages en fines tranches d’environ 3 mm avec un scalpel.
    Remarque : Si les échafaudages sont coupés à des tailles plus grandes ou plus petites, les durées des cycles déshydratation doivent être adaptées.
  2. Incorporer les échafaudages dans une baisse de 4 % (p/v) d’alginate et induire la réticulation en ajoutant un volume semblable de 3,7 % de formol sans tampon qui contient 20 mM CaCl2.
    Remarque : L’alginate incorporation rend les tranches échafaudage plus rigide par rapport à des étapes de lavage avant enrobage de paraffine. En cas que les échafaudages ont été cellulaire graines ou en vivo implantés, l’alginate incorporation n’est pas nécessaire, car la composition des échafaudages seront assez résistante en raison de l’incorporation de ECM par les cellules.
  3. Déshydrater les échantillons en les plaçant dans une série graduée de l’éthanol, commençant par cycles d’une heure de 70 %, 96 %, éthanol à 96 %, 100 % et 100 %, suivie de deux cycles de 1 h du xylène et se terminant par deux cycles de 1 h de paraffine à 60 ° C.
  4. Après déshydratation, paraffine-incorporer les échantillons dans un moule et refroidir les échantillons.
  5. Couper les échantillons avec un microtome en tranches de 5 μm d’épaisseur.
  6. Avant la coloration, réhydrater les échantillons en les plaçant dans une série d’éthanol graduée retournée. Commencez avec deux lavages de xylène pendant 5 min, suivie de 2 lavages d’éthanol 100 %, 95 % et 70 % pendant 3 min / cycle de lavage. Enfin, laver les échantillons 3 fois dans l’eau pendant 2 min.
    Remarque : En cas d’utilisation d’alginate pour traiter les échantillons pour enrobage de paraffine, veillez à rincer l’alginate avec acide citrique 10 mM avant réhydratation des sections paraffine.
  7. Tacher les échantillons à l’hématoxyline et éosine, safranine-O, collagène I et collagène II comme précédent décrit11.

8. caractérisation des échafaudages Decellularise avec des Analyses quantitatives

  1. Obtenir des résumés de papaïne des échafaudages comme décrit plus haut11.
  2. Effectuer un essai avec un kit de quantification de l’ADN basés sur la fluorescence pour mesurer la teneur en ADN double-brin d’échafaudages afin d’assurer la complète décellularisation. Suivre le protocole fourni par le fabricant. Exprimer la quantité d’ADN par un poids sec de l’échafaudage.
  3. Effectuer un essai de dimethylmethylene bleu pour quantifier le reste des GAGs au sein de l’échafaud, comme décrit plus haut11. Exprimer le montant au GAG par ADN.

9. ensemencement des échafaudages Decellularise

  1. Couper les échafaudages stérilisés de l’étape 6,7 dans 3 mm tranches épaisses.
  2. Transférer les échafaudages en puits séparés d’une plaque de 6 puits.
  3. Réhydrater les échafaudages avec milieu de culture cellulaire par pipetage 1 mL de milieu sur le dessus de l’échafaud et laisser tremper pendant 30 min. Utilisez chondrocyte ou moyen d’expansion des cellules souches mésenchymateuses (CSM).
    Remarque : Utilisez le même support pour réhydratation échafaudage en ce qui concerne la culture cellulaire des cellules qui seront attribués. Le milieu de chondrocytes expansion est composé de milieux modifiés de Dulbecco (DMEM) avec 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 10 ng/mL fibroblaste croissance factor-2 (FGF-2). MSC expansion milieu est composé de minimum essentiel alpha moyen (a-MEM) avec 10 % inactivés par la chaleur FBS, 0,2 mM L-ascorbique acide 2-phosphate, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 10 ng/mL FGF-2.
  4. Préparer 3 x 106 cellules dans 100 μl de milieu, qui est le volume requis pour chaque échafaudage avec un diamètre de 8 mm et une hauteur de 3 mm.
    Remarque : Plusieurs types de cellules provenant de différentes espèces peuvent être utilisés pour l’amorçage. Lorsque vous utilisez des chondrocytes ou cellules stromales mésenchymateuses, isoler les cellules comme décrit précédemment11. Lorsque vous utilisez des chondrocytes, assurez-vous qu’ils n’ont pas été développés après le passage de P1 afin de minimiser le nombre des chondrocytes dédifférenciées. Lorsqu’à l’aide de cellules stromales mésenchymateuses, ils doivent être testés sur leur capacité de différenciation des lignées multiples, comme précédemment décrit14.
  5. Pipetter 50 μL de préparé la suspension cellulaire sur le dessus de l’échafaud préalablement trempé et incuber l’échafaud pendant 1 h à 37 ° C.
  6. Soigneusement tourner l’échafaud upside down, pipette le reste 50 μL de la suspension cellulaire de ce côté-ci de l’échafaud et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
  7. Après incubation, ajouter 3 mL de milieu dans les puits et de la culture cellulaire graines échafaudages à 37 ° C. Gérer la plaque doucement pour éviter le détachement des cellules de culture.
  8. Les échafaudages de la culture pour la période de temps qui est nécessaire pour l’expérience et changer le support de 2 à 3 fois par semaine. Pipette lentement et aussi loin à l’abri de l’échafaud que possible.
  9. Après mise en culture de l’échafaudage de graines cellulaire, réduire de moitié les échafaudages et les traitent pour des analyses biochimiques et histologiques.

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Résultats

Décellularisation de MDP échafaudages doit toujours confirmer à l’aide de salissures histologiques ainsi que pour mesurer la quantité de restes d’ADN à l’aide de quantification de l’ADN. Décellularisation insuffisante pourrait conduire à des réactions immunologiques qui influencent les résultats in vivo paramètres15,16,17. Pour cette méthode spécifique décellularisation, ADN était inférieure à la...

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Discussion

L’ECM du cartilage articulaire est très dense et très résistant aux différents traitements enzymatiques. Le protocole décellularisation plusieurs étapes décrit dans cet article traite de cette résistance et avec succès génère des matrices decellularise. Pour y parvenir, le processus s’étend sur plusieurs jours. De nombreux processus de décellularisation ont été proposées pour différents types de tissus18, et cet article décrit un protocole adapté à la décellularisation du cartilage. Dans ce protoc...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Les auteurs aimerait W. Boot pour aide à la production d’échafaudages. Cintreuses de Kaka est supporté par le Alexandre Suerman Stipendium de l’University Medical Center. Levato R. et J. Malda sont soutenus par la Fondation néerlandaise de l’arthrite (subvention accords CO-14-1-001 et LLP-12, respectivement).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Joint cadavériqueIl peut être obtenu comme matériau de repos auprès du boucher local ou du centre vétérinaire.
Solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS)
Pénicilline-StreptomycineGibco15140
Amphotéricine BThermo Fischer Scientific15290026
Azote
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolThermo Fischer Scientific25200072
Tris-HCl pH 7,5
Désoxyribonucléase I du pancréas bovinSigma-AldrichDN25
Ribonuclease A du pancréas bovinSigma-AldrichR6513
Triton X-100 (octoxynol-1)Sigma-AldrichX100
PapainSigma-AldrichP3125
Citrate trisodique dihydratéSigma-AldrichS4641
AlginateSigma-Aldrich180947
Formalin
CaCl2
Ethanol
Xylène
Paraffine
Stérilisation à l’oxyde d’éthylèneSynergy Health, Venlo, Pays-Bas
Les cellules stromales multipotentes/chondrocytes provenant de donneurs, les CSM et les chondrocytes peuvent être isolés à partir d’articulations de donneurs qui sont du matériel de repos, provenant du boucher local ou du centre vétérinaire.
MEM alphaThermo Fischer Scientific22561
Acide L-ascorbique 2-phosphateSigma-AldrichA8960
DMEMThermo Fischer Scientific41965
Albumine sérique bovine inactivée par la chaleurSigma-Aldrich10735086001
Facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2)R & D Systems233-FB
Kit de quantification de l’ADN (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)Thermo Fischer ScientificP7581
1,9-Diméthyl-Méthylène Bleu chlorure de zinc double selSigma-Aldrich341088
LyophilisateurSALMENKIPPALPHA 1-2 LD plus
Broyeur analytiqueIKAA 11
mortier/pilon basiqueHaldenwanger 55/0A
Plaque à rouleauxCATRM5
Centrifugeuse (pour tubes de 50 mL)Eppendorf5810R
Capsule (moule cylindrique)TAAB8 mm plat
Superlite S UVLumatec2001AV
Incubateur
Microtome
Tamis (maille 0,71 mm)Scalpel VWR34111229
Porte-scalpel
Petite poche
liquide équins

Références

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