Poumon microARN profilage à travers le œstrus chez les souris exposées à l’Ozone

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour évaluer l’expression de poumon des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires utilisant des souris exposées à l’ozone ou de l’air filtré à différents stades du cycle oestral.

Résumé

Profilage de microARN (miARN) est devenu d’intérêt pour les chercheurs qui travaillent dans divers domaines de recherche de biologie et de médecine. Les études actuelles montrent un prometteur future de l’utilisation des miARN dans le diagnostic et le soin des maladies pulmonaires. Ici, nous définissons un protocole pour miRNA profilage pour mesurer l’abondance relative d’un groupe des miARN prévues pour réguler les gènes inflammatoires dans le tissu pulmonaire, partir d’un modèle de souris de l’inflammation des voies respiratoires induite par l’ozone. Parce qu’il a été démontré que les niveaux de l’hormone sexuelle peuvent influer sur la régulation de l’immunité innée pulmonaire chez les femelles, cette méthode vise à décrire un miRNA inflammatoire protocole chez les souris femelles, prenant en considération le cycle oestral de profilage stade de chaque animal au moment de l’exposition à l’ozone. Nous abordons également approches bioinformatiques applicable miRNA découverte et cible méthodes d’identification Leduc, un logiciel R/Bioconductor, et logiciel d’analyse fonctionnelle pour comprendre le contexte biologique et les voies associées expression différentielle de miRNA.

Introduction

microARN (miARN) sont courts (19 à 25 nucléotides), naturels, non codantes des molécules d’ARN. Séquences de miARN sont évolutifs conservé selon les espèces, ce qui suggère l’importance des miARN dans la régulation des fonctions physiologiques¹. profil d’expression des micro-ARN a été prouvé pour être utile pour identifier les miARN qui sont importants dans la régulation de divers processus, y compris la réponse immunitaire, différenciation cellulaire, processus de développement et l’apoptose². Plus récemment, les miARN ont été reconnus pour leur utilisation potentielle dans le diagnostic de la maladie et la thérapeutiqu....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de la Penn State University.

1. évaluation de la phase du Cycle oestral

1. Bien retenir une femelle souris C57BL/6 (8-9 semaines) en utilisant la technique de retenue une main souris décrite dans Machholz et al.,¹⁰.
2. Remplir la pipette en plastique stérile avec 10 μL d’eau ultra pure.
3. Introduire l’embout de la pipette en plastique dans le vagin.
4. Doucement purger le liquide 4-5 fois pour prélever l’échantillon.
5. Placez l’éclat final contenant des sécrétions vagina....

Résultats

Les différents types cellulaires observés dans les frottis sont utilisés pour identifier l’étape de cycle oestral de la souris (Figure 1). Ceux-ci sont identifiés par la morphologie des cellules. Au cours du proestrus, cellules sont presque exclusivement des amas de cellules épithéliales nucléées (Figure 1 a) forme ronde, bien formées. Lorsque la souris est dans la phase d’oestrus, les cellules sont des cellules épithéliales squa.......

Discussion

Profilage de microARN est une technique avantageuse pour diagnostic des maladies et recherches mécanistes. Dans ce manuscrit, nous avons défini un protocole visant à évaluer l’expression des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires dans les poumons des souris femelles exposées à l’ozone dans le cycle oestral différents stades. Méthodes pour la détermination du cycle oestral, telles que la méthode de détection visuelle, ont été décrits¹⁶. Cependant, ceux-ci s’appuient sur des mesu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	8 semaines
Eau ultra-pure	Thermo Fisher Scientific	10813012
Pipette en plastique stérile	Fisher Scientific	13-711-25	Capacité : 1,7 mL
Lames de microscope givrées	Thermo Fisher Scientific	2951TS
Microscope	Microscope World	MW3-H5	Objectif 10x et 20x
Kétathésie- Kétamine HCl Injection USP	Henry Schein Santé Animale	55853	90 mg/kg. Médicament contrôlé.
Solution stérile de xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	10 mg/kg. Drogue contrôlée.
Éthanol	Fisher Scientific	BP2818100	Diluer à 70 % d’éthanol avec de l’eau.
Aiguille de calibre 21 G	BD Biosciences	305165
Seringue	Fisher Scientific	329654	1 mL
Ciseaux opératoires	World Precision Instruments	501221, 504613	14 cm, tranchante/émoussée, incurvée et 9 cm, droite, fine pointe pointue
Kit de pince à épiler	World Precision Instruments	504616
Spectrum  ; Pulvérisateurs de tissus Bessman	Fisher Scientific	08-418-1	Capacité : 10 à 50 mg
Tubes de microfuge sans RNase Thermo	Fisher Scientific	AM12400	1,5 mL
Réactif TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus	Zymo Research	R2071
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
miScript II RT kit	Qiagen	218161
Souris Réponse inflammatoire & Auto-immunité miRNA PCR	Array Qiagen	MIMM-105Z
Tubes PCR à paroi mince, sans DNase, sans RNase	Thermo Fisher Scientific	AM12225	pour 20 &mu ; L réactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610
Microsoft Excel	Microsoft Corporation		https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen		https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software	The R Foundation		https://www.r-project.org/
Thermocycleur ou bloc de refroidissement/chauffage	Fournisseur général Microcentrifugeuse
	Fournisseur général Cycleur
PCR en temps réel	Fournisseur général Pipette
multicanaux	Fournisseur général Fournisseur général Tampon
de lavage d’ARN	Zymo Research	R1003-3-48	48 mL
Tampon de digestion de l’ADN	Zymo Research	E1010-1-4	4 mL
Tampon de prélavage de l’ARN	Zymo Research	R1020-2-25 25	mL
Analyseur d’ozone ultraviolet	Teledyne	Modèle T400	http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Régulateurs de débit massique	Sierra Instruments Inc	Flobox 951/954	http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html