Article de méthode

Évaluation de l'interaction entre le complément protéique C1q et l'acide hyaluronique dans la promotion de l'adhérence cellulaire

DOI :

10.3791/58688

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15 juin 2019

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1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Le composant de complément C1q est une molécule pro-inflammatoire fortement exprimée dans le microenvironnement de tissu qui peut interagir avec la matrice extracellulaire. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique affecte l'adhérence cellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il a été de plus en plus démontré que le microenvironnement de tumeur joue un rôle actif dans la croissance et la métasse de néoplasia. Par différentes voies, les cellules tumorales peuvent recruter efficacement des cellules stromales, immunitaires et endothéliales en sécrétant des facteurs stimulants, des chimiokines et des cytokines. À leur tour, ces cellules peuvent modifier les propriétés de signalisation du microenvironnement en libérant des signaux favorisant la croissance, des métabolites et des composants de matrice extracellulaire pour soutenir une forte prolifération et la compétence métastatique. Dans ce contexte, nous identifions que le composant complémentaire C1q, fortement exprimé localement par une gamme de tumeurs malignes humaines, en interagissant avec l'acide hyaluronique de matrice extracellulaire, affecte fortement le comportement des cellules primaires isolées de la tumeur humaine Spécimens. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique (HA) affecte l'adhérence de cellules de tumeur, sous-jacente au fait que les propriétés biologiques des composants principaux de la matrice extracellulaire (dans ce cas HA) peuvent être façonnées par des signaux bioactifs vers la tumeur progression.

Introduction

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Le microenvironnement de tumeur (TME) influence le développement et la progression de cancer puisqu'il peut fournir une niche permissive pour la survie, la croissance et l'invasion cellulaires. L'identification de nouveaux acteurs clés dans le TME peut être utile pour la découverte de nouveaux outils moléculaires pour la thérapie ciblée. TME comprend un réseau complexe et dynamique de cellules non malignes, telles que les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules du système immunitaire, intégrées dans les composants de la matrice extracellulaire environnante (ECM), y compris les collagènes, les laminins, les fibronectines, protéoglycanes et hyaluronans. Les cellules tumorales et non tumorales synthétisent et sécrètent des composants ECM ainsi que des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance et des enzymes inflammatoires et matricielles qui modifient globalement les propriétés physiques, chimiques et de signalisation du TME. Parmi ces constituants, l'acide hyaluronique (HA) a émergé pour exercer un rôle crucial dans la biologie de tumeur. Malgré sa composition chimique simple, HA, avec ses molécules HA-contraignantes (hyaladherins), peut moduler l'angiogenèse, la réactivité du système immunitaire et eCM remodelage d'une manière dépendante de la taille et la concentration1.

Le système de complément (C) fait également partie du TME local, qui a récemment reçu une attention croissante. Le système C englobe un ensemble de protéines solubles et liées à la membrane impliquées dans la première ligne de défense contre les non-autocellules, les éléments hôtes indésirables et les agents pathogènes. Fonctionnellement, le C relie les bras à deux effecteurs des systèmes innés et adaptatifs pour favoriser soit l'abattage direct des cellules, soit le montage d'une réponse inflammatoire2. L'activation de C peut supprimer la croissance de tumeur, en détruisant des cellules cancéreuses ou en inhibant leur excroissance, mais il est devenu de plus en plus clair qu'elle peut posséder une activité de tumeur-promotion en soutenant l'inflammation chronique, favorisant l'établissement d'un milieu immunosuppresseur, induisant l'angiogenèse, et activant les voies de signalisation liées au cancer3. Dans ce contexte, C1q, la première molécule de reconnaissance de la voie classique du système C a émergé pour exercer des fonctions importantes dans le microenvironnement tumoral indépendamment de l'activation C4. C1q a été montré pour être exprimé localement par une gamme de tumeurs malignes humaines, où il peut favoriser l'adhérencede cellules cancéreuses, la migration et la prolifération en plus de l'angiogenèse et la métase 5. Il est intéressant de noter que le C1q interagit avec un constituant important de l'ECM comme l'HA.

Nous avons développé une technique pour isoler les cellules cancéreuses primaires de la masse tumorale. En outre, nous avons créé la matrice, qui peut stimuler le microenvironnement de tumeur, particulièrement l'interaction entre C1q et acide hyaluronique de poids moléculaire élevé. C1q lié à HA a été en mesure d'induire l'adhérence des cellules tumorales.

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Protocole

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Des échantillons de tissus prélevés sur des patients ont été prélevés après consentement éclairé à la suite de l'approbation des considérations éthiques par le conseil institutionnel de l'hôpital universitaire de Trieste, en Italie.

1. Isolement et culture des cellules tumorales (Jour 1)

  1. Isoler les cellules du mésothéliome humain à partir de spécimens solides MPM. Hacher finement le tissu à l'aide d'un cutter pour obtenir des fragments d'environ 2-3 mm2 de taille et incuber dans 5 mL de solution de digestion composée de Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) complétée par 0,5 mM Ca2/Mg2 ,0,5% trypsine et 50 g/mL DNase I, la nuit à 4 oC.
  2. Isolement et culture des cellules tumorales (Jour 2)
    1. Après l'incubation de la nuit, placer le tissu digéré pendant 30 min dans un incubateur de 37 oC avec des secousses douces.
    2. Remplacer la solution de digestion sur la centrifugation (250 x g)par 3 mg/mL de collagène de type 1 dissous dans 5 mL de Medium 199 avec HBSS et encore incuber pendant 30 min à 37 oC avec des secousses douces.
    3. Bloquez la réaction enzymatique en ajoutant 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS). Resuspendre les cellules très soigneusement avec un pipet de 5 ml pour s'assurer que la plupart des cellules sont libérées du tissu. Ensuite, filtrez la suspension de la cellule à travers un filtre de 100 m.
    4. Semer les cellules dans un flacon de 12,5 cm2 et les faire la culture à 37 oC avec un milieu sans sérum de cellules endothéliales humaines (HESF), avec 10 % de FBS et complété par eGF (10 ng/mL), FGF de base (20 ng/mL) et 1 % pénicilline-streptomie.
      REMARQUE : Remplacer par un milieu frais tous les 2-3 jours.

2. Revêtement HA (Jour 1)

  1. Resuspendre le poids moléculaire élevé HA (1,5 kDa) dans de l'eau distillée double à la concentration de 1 mg/mL6.
  2. Diluer la solution de stock HA à 50 g/mL dans le tampon carbonate/bicarbonate (0,1 M, pH 9,6) avec tuyauterie douce.
  3. Enrober la plaque de 96 puits de 100 L de solution de bouillon de dilution HA par puits pendant la nuit à 4 oC.
    REMARQUE: L'acide hyaluronique a été un cadeau aimable du professeur Ivan Donati, Département des sciences de la vie, Université de Trieste7.

3. Revêtement C1q (Jour 2)

  1. Après l'incubation de nuit, aspirer sous vide les puits traités et laver la plaque de 96 puits avec 100 L de PBS (dPBS) de Dulbecco par puits.
  2. Permettre au C1q (25 g/mL ou à différentes concentrations pour des expériences de réponse à la dose) ou BSA (comme un contrôle négatif) de se lier au plastique immobilisé-HA en incuber ces protéines à une concentration de 25 g/mL dans 100 L de dPBS - 0,5% BSA et 0,7 mM Ca2/Mg2 . Puis incuber toute la nuit à 4 oC.
  3. Aspirez les puits sous vide et lavez la plaque de 96 puits avec 100 L/puits de dPBS.

4. Étiquetage cellulaire avec FAST DiI

  1. Resuspendre 1 x 105 cellules tumorales dans 500 L de dPBS contenant 10 g/mL du colorant fluorescent FAST DiI. Incuber pendant 15 min à 37 oC dans un incubateur v/v CO2 de 5 % pour l'étiquetage, en mélangeant manuellement après 5 min d'intervalle.
    1. Pour éliminer l'excès exEX DiI, ajouter 10 mL de dPBS, pipette doucement de haut en bas, et centrifugeuse à 250 x g pendant 7 min. Resuspendre le granule de cellules dans 1 mL de milieu humain endothélial libre contenant 0,1% BSA (HESF - 0,1% BSA).

5. Adhérence cellulaire sur les matrices HA/C1q (Jour 1)

  1. Aspirateur aspirateur les puits enduits des différentes matrices (les puits ont été enduits à l'étape 3.2).
  2. Distribuer 100 L de la suspension cellulaire étiquetée aux puits enduits et incuber la plaque pendant 35 min à 37 oC dans l'incubateur v/v CO2 à 5 %.
  3. Enlever les cellules non adhérentes en aspirant le supernatant. Laver une fois avec dPBS contenant 0,5% BSA, 0.7 mM Ca2 et 0.7 mM Mg2.
  4. Lyse les cellules adhérentes en ajoutant 200 L/puits de 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 - 0.1% v/v SDS et lire immédiatement la plaque de 96 puits avec un lecteur de fluorescence (544 nm, émission 590 nm) en utilisant une courbe d'étalonnage générée par la lyse d'un nombre croissant de étiquetés Cellules.

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Résultats

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L'HA est un polysaccharide à poids moléculaire élevé chargé négativement, qui est composé de répéter (1-4) -Acide glucuronique-(1-3)-N-acétyl-D-glucosamine unités de disaccharide (figure 1B)7. L'occurrence de la liaison de L'HA sur la plaque de 96 puits ainsi que l'efficacité de son immobilisation ont été testées en tirant parti de l'HA biotinylated (bio-HA). Différentes concentrations de Bio-HA, allant de 10 g/mL à 1 mg/mL, ont été re...

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Discussion

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Nous décrivons une méthode facile pour étudier comment le composant de complément C1q, interagissant avec l'acide hyaluronique, est capable de moduler le comportement des cellules primaires isolées des tissus tumoraux humains. Les deux HA et C1q sont abondamment présents dans le microenvironnement tissulaire à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques, participant à plusieurs processus biologiques cellulaires. Par exemple, C1q a été montré pour être présent dans le microenvironnement du placenta où il f...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d'intérêts potentiel.

Remerciements

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Nous remercions Ivan Donati pour la fourniture de HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Département de gynécologie de l'IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italie) et Andrea Romano (Unité Clinique Opérationnelle d'Anatomie et d'Histologie Pathologique, Hôpital Cattinara, Trieste, Italie ) pour la collecte d'échantillons de tissus. Nous remercions également Nicolo Morosini pour l'aide dans la préparation vidéo et Alex Coppola, la voix. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut pour la santé maternelle et infantile, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italie (RC20/16) et Fondazione Cassa di Risparmio Trieste à R.Bulla.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100&thinsp ; et micro ; m filtre à poresBD Falcon352360
Solution d’amphotéricine B (fungizone)Sigma-Aldrich  ;1397-89-3
FGF de baseSciences immunologiquesGRF-15595
Chlorure de calciumSigma-Aldrich  ;C-4901
Collagénase de type IWorthington Biochemical Corporation, DBAMX1D12644
D-GlucoseSigma-Aldrich  ;50-99-7
DNase I  ;Roche10 104 159 001
EDTASigma-Aldrich  ;60-00-4
EGFSciences immunologiquesGRF-10544
FAST DiISondes moléculaires, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
Sérum fœtal bovinGibco,  ; Thermo Fisher Scientific10270-106
FibronectineRoche11051407001
Fiole pour culture cellulaireCorning430639Solution de
gentamicineSigma-Aldrich  ;G1397-10ML
Hank' s Solution saline équilibrée (HBBS)  ;Sigma-Aldrich  ;H6648Supplémenté en EDTA, glucose, pénicilline-streptamicine, gentamicine et fongizone
Acide hyaluronique de haut poids moléculaireCadeau aimable du Prof. Ivan Donati
Sérum endothélial humain moyen libre  ;Gibco,  ; Thermo Fisher Scientific11111-044Supplémenté en EGF (5&thinsp ; ng/mL), FGF basique (10&thinsp ; ng/mL), et  ; 1 % pénicilline&ndash ; streptomycine (Sigma-Aldrich)
Chlorure de magnésiumCarlo Erba13446-18-9
Medium 199 avec Hank' ssel Sigma-Aldrich  ;M7653
Pénicilline-StreptomycineSigma-Aldrich  ;P0781
Microscopie à intervalle de temps  ;Nikon·s ;Système d’imagerie BioStation IM-Q
Titertek Multiskan Lecteur ELISAFlow Labs
TrypsinSigma-Aldrich  ;Réf. T4674
stérile et ventilée

Références

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  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

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Mots-clés

Extracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

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