Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

Summary

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour le traitement du codage (ARNm) et non-codantes (ARNnc) globine réduite RNA-seq bibliothèques auprès d’un échantillon de sang total unique.

Abstract

L’avènement de l’innovants et de plus en plus puissantes techniques de séquençage prochaines génération a ouvert de nouvelles avenues dans la possibilité d’étudier l’expression des gènes associée à des processus biologiques d’intérêt sous-jacent. Ces innovations permettent non seulement aux chercheurs d’observer l’expression à partir des séquences d’ADN messagère gènes codant cette fonction cellulaire de l’effet, mais les molécules d’ARN (ARNnc) non codantes qui restent non traduits, mais encore ont également des fonctions de réglementation. Bien que les chercheurs ont la capacité d’observer les ARNm et les ARNnc expression, il est d’usage pour une étude visant à mettre l’accent sur l’un ou l’autre. Cependant, lorsque les études sont intéressés par l’expression des ARNm et ARNnc, autant de fois qu’ils utilisent des échantillons distincts pour examiner codage ou non codantes RNAs en raison de la différence dans les préparations de la bibliothèque. Cela peut conduire à la nécessité pour d’autres exemples qui peuvent augmenter le stress animal, consommables et temps. En outre, il peut causer aux chercheurs de décider de préparer les échantillons pour seul analyse, habituellement l’ARNm, en limitant le nombre de questions biologiques qui peuvent être l’objet d’une enquête. Cependant, ncRNA couvrent plusieurs classes avec rôles régulateurs cette expression de l’ARNm effet. ARNnc étant important à des processus biologiques fondamentaux et trouble de ces processus au cours de l’infection, ils peuvent, par conséquent, faire des cibles intéressantes pour les thérapies. Ce manuscrit montre un protocole modifié pour la génération non codantes RNA expression bibliothèques, y compris l’ARN viral, d’un seul échantillon de sang total et l’ARNm. Optimisation du présent protocole, amélioré la pureté du RNA, a augmenté de ligature pour la récupération d’ARN méthylés et omis de sélection de taille, pour permettre la capture de plusieurs espèces d’ARN.

Introduction

Séquençage de la génération suivant (NGS) a émergé comme un outil puissant pour l’étude des changements qui se produisent au niveau génomique d’organismes biologiques. Préparation des échantillons pour les méthodes end peut varier selon l’organisme, le type de tissu, et surtout les questions les chercheurs tiennent à adresse. De nombreuses études se sont tournés vers la NGS comme un moyen d’étudier les différences dans l’expression des gènes entre Etats comme des individus sains et malades^1,2,3,4. Le séquençage de prendre place sur une base ....

Protocol

Protocoles de l’animales ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de la National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC) animalier.

1. collecte de sang de porc échantillons

1. Recueillir des échantillons de sang dans des tubes de RNA. Recueillir ~2.5 mL ou plus si les plus grands tubes de prélèvement sont disponibles.

2. le traitement du sang de porc échantillons

1. Centrifuger les tubes de sang à 5 020 x g pendant 10 min à température ambiante (15-25 ° C). Si des échantillons congelé de traitement Incuber les tubes à température ambiante pendant un minimum de 2 ....

Results

Les échantillons représentatifs dans notre étude sont la globine et les échantillons de sang appauvri en ribo. Les résultats représentatifs du protocole est constitué d’un échantillon de bibliothèque appauvri globine avec un nombre de l’intégrité du RNA (RIN) au-dessus de 7 (Figure 1a) et des ratios de concentration 260/280 nm égale ou supérieure à 2 (Figure 1b et 1c). Valider le résultat de l’éc.......

Discussion

La première étape critique dans le protocole qui fait optimisé inclus les étapes de l’appauvrissement globine ajouté, qui ont permis d’obtenir des lectures de qualité provenant d’échantillons de sang entier. L’une des plus grandes limites sur l’utilisation de sang dans les études de séquençage sont le grand nombre de lectures dans l’échantillon qui seront correspondent à des molécules de globine et réduire les lectures qui pourraient mappent à d’autres molécules d’intérêt¹⁸. Par conséquent, en opt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAXgene Tubes	PreAnalytix	762165
Biologie moléculaire Eau de qualité	ThermoFisher	10977-015
mirVana Kit d’isolation des miARN	ThermoFisher	AM1560
Rneasy MinElute Kit de nettoyage	QIAGEN	74204
100 % éthanol	Decon Labs, Inc.	2716
0,2 mL tubes à paroi mince	ThermoFisher	98010540
1,5 mL RNase/DNase - tubes libres	Tout fournisseur
Veriti 96-well Thermocycler	ThermoFisher	4375786R
Globine Reduction Oligo (&alpha ; 1)	Tout fournisseur		Séquence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (&alpha ; 2)	Tout fournisseur		Séquence TCA ACG ATC AGG AGG GGG GGG TGC AA
Oligo de réduction de globine (&beta ; 1)	Tout fournisseur		Séquence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Oligo de réduction de la globine (&beta ; 2)	Tout fournisseur		Séquence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT CT
10X Tampon
oligo-Tris-HCl, pH 7,6	Fisher Scientific	BP1757-100-KCl
	Millipore Sigma	60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
;-Tris-HCl, pH 7,6	Fisher Scientific	BP1757-100
;-DTT	ThermoFisher	Y00147
;-MgCl2	Promega	A351B
;-Biologie moléculaire Eau de qualité	ThermoFisher	10977-015
RNase H	ThermoFisher	AM2292
SUPERase-IN	ThermoFisher	AM2694	Inhibiteur de rnase
EDTA	Millipore Sigma	E7889
Microcentrifugeuse	Tout fournisseur
; 2100 Instrument d’électrophorèse BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
Agilent ADN haute sensibilité  ; Kit	Agilent Technologies	5067-4626
TruSeq Kit de préparation de banque d’ARN total toronné avec Ribo-Zero  ;	Kit	Illumina RS-122-2201	; Ensemble Humain/Souris/Rat A  ; (48 échantillons, 12 index)
Guide de préparation des échantillons d’ARN total toronné TruSeq	Illumina		Disponible en ligne
Perles RNAClean XP	BeckmanCoulter	A63987
Perles AMPure XP	BeckmanCoulter	A63880
MicroAmp Bande optique 8 tubes	ThermoFisher	N8010580	0,2 ml Tubes à paroi mince
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap	ThermoFisher	N801-0535
RNase/DNase - réservoirs de réactifs libres	Tout fournisseur
SuperScript II Transcriptase	inverse ThermoFisher	18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates	ThermoFisher	N8010560	Ceux-ci ont été utilisés à la place des plaques de .3mL au besoin
Film adhésif MicroAmp Optical	ThermoFisher	4311971
NEBNext Kit de préparation de petite bibliothèque d’ARN multiplex pour Illumina® ; (Série 1)  ;	New England Biolabs	E73005	kit de petite bibliothèque d’ARN
NEBNext Multiplex Small RNA Library Set pour Illumina® ; (Ensemble 2)  ;	New England Biolabs	E75805	petit kit d’ARN
QIAQuick Kit de purification PCR	QIAGEN	28104
96S Super Magnet Plate	ALPAQUA	A001322