Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

Résumé

Ce protocole décrit le manuel de procédure pour isoler les neurones fluorescent étiquetés suivies in vitro l’amplification des ARNm axée sur la transcription pour l’ordonnancement de RNA seule cellule haute-profondeur de tri.

Résumé

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) est maintenant un outil largement utilisé pour analyser l’expression des gènes. Plates-formes de RNA-sequencing unicellulaires commercialement disponibles traitent toutes les entrées des cellules sans discernement. Parfois, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) est utilisé en amont d’isoler une population spécifiquement marquée d’intérêt. Une limitation des FACS est la nécessité d’un nombre élevé de cellules d’entrée avec fractions nettement marquées, qui n’est pas pratique pour la collecte et le profilage des populations de neurone rares ou peu marqué par le cerveau de souris. Nous décrivons ici une méthode pour recueillir manuellement clairsemée fluorescent étiqueté de neurones fraîchement dissociées tissu de cerveau de souris. Ce processus permet de capturer des neurones seule avec haute pureté et intégration ultérieure avec un protocole de transcription basé sur l’amplification in vitro qui préserve les ratios de transcription endogène. Les auteurs décrivent une méthode de double amplification linéaire qui utilise des identificateurs de la molécule unique (UMIs) pour générer des comtes d’ARNm individuels. Deux séries de résultats d’amplification dans un degré élevé de détection de gènes par une cellule unique.

Introduction

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) a transformé la transcriptomique études. Tandis que RNAseq de cellule unique à grande échelle peut être effectuée en utilisant une variété de techniques, telles que les gouttelettes^1,2, microfluidique³, nanogrids⁴et⁵de micropuits, la plupart des méthodes ne peut pas trier les types cellulaires définis qui expriment des fluorophores codés génétiquement. Pour isoler une population cellulaire select, cellule activée par fluorescence triant (FACS) est souvent utilisé pour trier des cellules marquées e....

Protocole

Toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par IACUC à Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. Manuel de tri des neurones de souris fluorescent étiquetés

1. Tirer microcapillaries de verre (voir Table des matières) pour 10 à 15 µm sortie diamètre moyen d’un extracteur capillaire avec les paramètres suivants : chaleur : 508, tirer : vierge, vel : horaire vide, : vide.
2. Fixer tube de silicone flexible de 120 à 150 cm (~0.8 mm diamètre intérieur) à un filtre de seringue en membrane 0,2 µm polyvinylidène difluoride (PVDF) et d’une vanne de tube bidirectionnel à l’aide ....

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, GABAergiques neurones ont été manuellement triés (Figure 1) et ARN a été amplifié, puis transformé en une banque d’ADNc (Figure 2) et séquencé à haute profondeur⁸. Les produits amplifiés de RNA (aRNA) variaient entre 200 – 4 000 bp dans la taille, avec une distribution de pointe légèrement supérieure à 500 bp (Figure 3 a). L’ADNc de .......

Discussion

Le manuel de protocole de tri est adapté pour un séquençage de RNA encadré de neurone des populations qui sont soit peu marquées dans le cerveau de souris ou représentent une population de cellules rares qui est par ailleurs pas possible d’étudier à l’aide de la cellule active de haut débit méthodes de tri et d’amplification. Soumis à des FACS habituellement les cellules subissent des pressions de ligne gaine et échantillon de l’ordre de ~ 9 – 14 lb/po2, selon la taille de la buse et désiré taux d’événements. En outre, à.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ERCC RNA Spike-In Control Mix Thermo	Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Inhibiteur de la ribonucléase recombinante	Thermo Fisher	Cat# 10777019 Tampon
de fragmentation de l’ARN	New England Biolabs	Cat# E6105S
Kit d’ARN MinElute	Qiagen	Cat# 74204
Phosphatase antarctique	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucléotide kinase	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 ARN ligase2, tronquée	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp perles magnétiques	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIsélectionner la taille billes	magnétiquesThermo Fisher	Cat# B23317
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Protéase de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Message Amp II kit	Thermo Fisher	Cat# AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina		Cat# RS-200-0012
Bioanalyseur RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalyseur Puce ADN haute sensibilité	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalyseur 2100	Agilent
Microscope de dissection avec fluorescence et éclairage en champ clair avec optique DIC. (modèle Leica MZ-16F).	Leica	Modèle MZ-16F
Microcapillaire en verre : Tubes capillaires en borosilicate 500/pqt. OD = 1 mm, ID = 0,58 mm, paroi = 0,21 mm, Longueur = 150 mm.	Warner instruments	Modèle GC100-15, Commande # 30-0017
Extracteur de pipette capillaire	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Unité de refroidissement tissulaire Vibratome	Thermo Microm	CU 65