Article de méthode

Quantification de l’amélioration dépendante des anticorps du Virus dans les cellules humaines primaires Zika

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DOI :

10.3791/58691

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18 janvier 2019

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1Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, 2National Emerging Infectious Diseases Laborator, Boston University School of Medicine, 3Department of Entomology, Kansas State University

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent une méthode pour évaluer l’effet d’immunité préexistante contre le virus de la dengue sur l’infection par le virus Zika à l’aide de sérum humain, des cellules humaines primaires et quantification de l’infection par PCR en temps réel quantitative.

Résumé

L’émergence récente des flavivirus Zika et des complications neurologiques, tels que syndrome de Guillain-Barré et une microcéphalie chez les nourrissons, a apporté une sécurité publique sérieusement. Parmi les facteurs de risque, mise en valeur dépendante des anticorps (ADE) pose la menace la plus importante, comme la récente résurgence du virus Zika (ZIKV) est principalement dans les zones où la population a été exposée et se trouve dans un état d’immunité avant d’autres étroitement associés flavivirus, notamment le virus de la dengue (DENV). Nous décrivons ici un protocole de quantification de l’effet des anticorps de sérum humain contre le ministère de l’environnement sur l’infection ZIKV dans des cellules humaines primaires ou de lignées cellulaires.

Introduction

Parmi les maladies virales transmises par les moustiques, Zika infection est l’un des plus cliniquement importants1. L’infection est causée par le flavivirus ZIKV qui, dans la plupart des cas, utilise l’Aedes aegypti comme son principal vecteur1,2. Cependant, il y a des études qui ont signalé l’Aedes albopictus comme vecteur principal dans certains foyers ZIKV3. Bien que l’infection est asymptomatique dans de nombreux cas, les symptômes les plus courants sont la fièvre, maux de tête et de douleurs musculaires2. Il n’y a aucun remède ou vaccin disponible pour une infection ZIKV et le traitement disponible est le plus souvent favorable. Les flambées récentes de ZIKV en Amérique du Sud a conduit à des cas graves de la maladie et une augmentation d’environ 20 fois dans le trouble neurologique du développement chez les foetus nommé microcéphalie2. Comme l’Amérique du Sud est une zone endémique de plusieurs arbovirus telles que le virus DENV et du Nil occidental, il est crucial d’étudier si l’immunité préalable aux autres flavivirus(es) joue un rôle dans la sévérité des infections de ZIKV et de la maladie.

Au cours des âges, les virus ont évolué différentes stratégies pour augmenter leurs chances d’infectiosité afin de prendre en charge le mécanisme cellulaire et de réprimer la réponse antivirale. L’un des plus fascinants de tous est l’utilisation d’anticorps préalablement immunisée hôte par des virus pour améliorer leur réplication avec le phénomène ADE4. ADE à travers les quatre sérotypes du ministère de l’environnement a été bien étudiée et démontrée pour augmenter des titres viraux et maladie issue5,6,7. Dans une précédente étude in vitro, nous avons montré une amélioration significative de la réplication en raison préexistants DENV l’immunité dans des cellules immunitaires humaines primaires8ZIKV. Nous avons aussi démontré une méthode in vitro pertinente afin de quantifier la capacité des anticorps préexistants DENV afin d’améliorer la réplication dans les cellules primaires ZIKV.

Le protocole que nous avons développé utilise des échantillons de sérum humain qui sont testés pour la neutralisation DENV DECT-50 ou test de neutralisation de réduction plaque (PRNT) épreuves biologiques, ainsi que ZIKV dans les cellules biologiquement pertinentes ou de cellules provenant de tissus qui peuvent infecter les ZIKV.

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Protocole

Des échantillons de sérum utilisés dans cette étude proviennent de participants humains d’une cohorte de la Colombie. Prélèvement de l’échantillon a été approuvé par la Commission de révision interne (CISR), Universidad de Pamplona (Colombie, Amérique du Sud) et l’hôpital de Los Potios8. Les échantillons ont été anonymement et les enquêteurs n’avaient pas accès à l’information du patient. Les échantillons de sérum ont été vérifiés pour le sérotype DENV. Les échantillons ont été confirmées à neutraliser l’infection DENV in vitro. Pour un contrôle, des échantillons de sérum de sujets sains (HC) des États-Unis ont été utilisés.

Remarque : Ce protocole peut être utilisé pour examiner la réplication ADE de ZIKV dans n’importe quel type de cellules humaines exprimant les récepteurs Fcγ. Le protocole se compose de trois parties (Figure 1).

1. cellules ensemencement et Infection d’installation

Remarque : Pour cette étude en particulier, les macrophages humains primaires ou de lignée U937 myélomonocytaire (ATCC-CRL-1593.2) ont été utilisés. Les cellules ont été maintenues dans le milieu RPMI additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2). Tous les étapes ont été effectuées dans un biosafety level 2 armoire de biosafety (BSL-2) dans des conditions stériles.

  1. Semences 3 x 104 cellules par bien dans une plaque à 96 puits à fond plat stérile avec 100 µL de milieu et les placent dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
  2. Après l’ensemencement les cellules, décongeler les échantillons de sérum à la température ambiante et faire 10 fois des dilutions successives (c'est-à-dire1/10, 1/100, 1/1 000, 1/10 000) en mélangeant les échantillons dans un milieu sans sérum. Aliquote les dilutions dans une plaque à 96 puits stérile. Utiliser le virus sans sérum comme un contrôle supplémentaire.
  3. Décongeler le stock ZIKV à 37 ° C au bain-marie pendant 1-2 min et transférez-la rapidement à la glace pour une utilisation future.
  4. Ajouter une multiplicité de 0,1 de montant équivalent d’infection (MOI) de la souche ZIKV MR766 pour les aliquotes de sérum.
    Remarque : Assurez-vous que le facteur de dilution reste constant et le volume total est ~ 200 µL ; C’est assez pour la géométrie de chaque traitement. Gardez trois puits non infectés à utiliser comme contrôle négatif pour analyse en aval.
  5. Incuber les dilutions du sérum avec le virus ajouté dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2 pendant 1 h afin de permettre les anticorps DENV pour former des complexes avec les virions Zika (pour plus de commodité, ci-après dénommé « complexes immuns »).
  6. Aspirer les médias des cellules qui ont été ensemencés dans la plaque à 96 puits à fond plat. Laver les cellules avec stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (solution de 1 PBS x).
  7. Ajouter 50 µL des complexes immuns dans chaque puits et incuber à eux dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 h avec 5 % de CO2 .
  8. Après 2 h d’incubation, aspirer les médias contenant les complexes immuns, des cellules, à l’aide d’un multicanal pipeter et laver les cellules 2 x avec du PBS 1 x pour supprimer complètement les complexes immuns et toute seules des virions.
  9. Ajouter 100 µL de supports complets neufs additionnés de 10 % FBS à chaque puits et incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2 pendant 48 h.

2. Extraction de l’ARN

  1. Sortir la plaque à 96 puits de l’incubateur et transférez-la sur la biosécurité du cabinet.
  2. Aspirer les médias, laver les cellules 2 x avec du PBS 1 x et de procéder à l’extraction de l’ARN.
    Remarque : ARN peut être extrait par n’importe quelle méthode de choix (voir la Table des matières).
  3. Ajouter 250 µL de tampon de lyse cellulaire avec 10 % de β-mercaptoéthanol / puits. Déposer le tampon et descendre au moins 5 fois ainsi que de rayer les cellules avec l’embout de la pipette pour accélérer la procédure de lyse.
  4. Transférer les lysats cellulaires à tubes neuf, étiqueté, stériles de 1,5 mL.
  5. Ajouter une quantité égale de l’éthanol à 70 % (250 µL). Pipette et descendre 4 x - 5 x jusqu'à ce que le mélange soit clair.
  6. Transférer le mélange (~ 500 µL) à marqué des colonnes à base de silice dans les tubes de prélèvement de 2 mL et centrifuger à 15 000 x g pendant 30 s. jeter le débit à travers et garder les colonnes dans les tubes de prélèvement même.
  7. Ajouter 700 µL de tampon de lavage 1 à chaque colonne et centrifuger à 15 000 x g pendant 30 s. jeter le débit à travers et garder les colonnes dans les tubes de prélèvement même.
  8. Ajouter 500 µL de tampon de lavage 2 dans chaque colonne et centrifuger à 15 000 x g pour 30 s. jeter le surnageant. Répétez cette étape 2 x.
  9. Transfert à gauche les colonnes de nouveaux tubes de prélèvement de 2 mL et centrifuger à 15 000 x g pendant 2 min. veiller à ce que les colonnes à base de silice deviennent complètement secs et il n’y a aucun éthanol du tampon de lavage 2.
  10. Jeter les tubes de 2 mL et placer les colonnes de nouveau, stérile, étiqueté, tubes de récupération de 1,5 mL.
  11. Ajouter préchauffée (42 ° C) 30 µL d’eau exempte de RNase au centre de chaque colonne et centrifuger à 15 000 x g pendant 1 min.
  12. Récupérer l’ARN éluée et quantifier les échantillons, à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde nm 260.
    Remarque : Idéalement, déterminer la pureté de l’ARN en calculant le rapport entre les valeurs d’absorption à 260 nm et 280 nm. Ratio 260/280 de l’ARN purifié est idéalement entre 1,8 et 2,0.

3. quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction

Remarque : Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) peut être réalisée en utilisant n’importe quel mélange SYBR green, qui habituellement se compose de SYBR Green I teindre, Taq DNA polymerase, désoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs) et un colorant passif. N’importe quelle machine de qPCR capable de la détection de SYBR green permet d’effectuer la réaction et se procurer les données. Pour cette expérience, a été utilisé un kit de RT-PCR en une étape, qui avait un cocktail de SYBR Green I, ROX colorant, Taq DNA polymerase, dNTPs et un mélange additionnel de la transcriptase inverse (voir Table des matières). Les amorces conçu contre la région de l’enveloppe et utilisées dans cette étude pour quantifier les niveaux génomiques ZIKV sont CCGCTGCCCAACACAAG pour ZIKV-qF et CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT pour ZIKV-qR. Comme contrôle, β-2-microglobuline humaine (B2M) a été mesurée et utilisée pour normaliser l’expression de ZIKV (gène de ménage). Les séquences d’amorces pour quantifier l’expression de gène de B2M utilisée dans cette étude sont CTCCGTGGCCTTAGCTGTG pour B2M-qF et TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT de B2M-qR. Vérifier que vous mettez trois répétitions techniques pour chaque échantillon pour le ZIKV et les gènes de B2M. Le programme d’installation de la RT-PCR est brièvement décrite ci-dessous.

  1. Installation de RT-PCR
    1. Utilisez 100 ng d’ARN par exemple.
    2. Ajouter 1 µL de 10 stocks µM d’amorces avant et arrière d’un gène particulier de chaque réaction.
    3. Ajouter 0,25 µL du mélange de la transcriptase inverse par échantillon.
    4. Pour chaque réaction individuelle, ajouter 12,5 µL du mélange de SYBR Green.
    5. Ajouter jusqu'à 25 µL d’eau. Faire un master mélanger tous les réactifs susmentionnés sauf RNA, aliquote dans la plaque PCR 96 puits et ajoutez les RNA dernière.
    6. Sceller la plaque avec un ruban adhésif transparent.
    7. Centrifuger la plaque à 1 000 x g pendant 1 min mélanger les réactifs.
    8. Mettre la plaque dans la machine de qPCR.
  2. Profil de RT-PCR
    Remarque : Utiliser le profil de RT-PCR montré tableau 1.
    1. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 10 min afin d’assurer la synthèse de l’ADN complémentaire (ADNc).
    2. Après la synthèse de cDNA, activer l’ADN polymérase de Taq à 95 ° C pendant 5 min.
    3. Effectuez 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pour 10 s et apprêt recuit et extension à 60 ° C pendant 30 s.
    4. Mettre l’étape de courbe de fusion supplémentaires (65° C) en fin de compte.
  3. Analyse des données
    1. Suivre la courbe de fusion en cliquant sur l’onglet courbe de fusion dans le programme utilisé pour faire fonctionner la machine de qPCR, qui, idéalement, montre un pic unique dans tous les échantillons pour un gène particulier confirmer la présence de seulement un amplicon et une amplification plus de 1,6 cas l’algori THM considère que la valeur d’amplification de 100 % (la valeur d’amplification varie selon l’algorithme utilisé par la machine de qPCR) 2. Assurez-vous d’utiliser des tranches de température de 0,5 ° C entre les étapes et un minimum de temps de 10 de retenue s dans le protocole de courbe de fonte, pour des résultats optimaux.
    2. Après avoir vérifié qu’il y a un amplicon unique et une valeur de bonne amplification, cliquez d’abord sur l’onglet données de quantification pour obtenir un cycle quantitatif (valeur Ct/Cq) de chaque échantillon et exporter vers Microsoft Excel.
    3. À l’aide d’un tableur, calculer la moyenne de chaque échantillon à l’aide de la valeur de Ct. Ensuite, cliquez sur les formules puis sélectionnez la moyenne. Les valeurs de CT moyens de chaque échantillon (réplication) sont utilisées pour une analyse ultérieure.
    4. Puis, calculez le ΔCt à l’aide de la formule ΔCt = moyenne Ct du gène cible - moyenne Ct du gène contrôle (dans ce cas, ΔCt = moyenne Ct du gène ZIKV - Ct du gène B2M en moyenne).
    5. Calculer ΔΔCt pour normaliser les données (dans ce cas, ΔΔCt = ΔCt ZIKV échantillons - B2M).
    6. Calculer que le pli augmente l’expression des gènes en tapant la formule 2^-(ΔΔCt) pour chaque valeur unique ΔΔCt normalisé. Les résultats de la multiplication d’effectuer des tests statistiques peuvent être obtenus comme décrit dans les précédentes études9,10.

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Résultats

Dans la Figure 1, il y a une illustration schématique étape par étape de toutes les étapes nécessaires effectuer le protocole de l’ADE. C’est un schéma montrant l’ensemble de la procédure de l’ADE de ZIKV en raison de l’immunité préexistante à DENV. La figure 2 montre comment sériques échantillons ont été classées en trois groupes différents : échantillons d’infection confirmés DENV sont appelées le groupe DENV-infecté, DENV anti...

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Discussion

Réaction croisée des anticorps DENV conduisant à l’ADE des autres sérotypes DENV a entravé le développement d’un vaccin efficace11. ZIKV appartient à la même famille des Flaviviridae et a une grande homologie avec autres flavivirus, surtout DENV12. La principale cible des anticorps neutralisants pour ZIKV et DENV est la protéine de l’enveloppe, qui partage une homologie de séquence de structurelles et quaternaire très élevé entre les deux virus13

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été généreusement soutenu par 1R21AI129881-01 (de T.M.C.), des fonds de démarrage de Emerging Infectious maladies laboratoires nationaux et l’école de médecine de l’Université de Boston.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sérum de Bovin Fœtal  ;GEMINI100-106
iCycler  ;BioRad785BR02188Modèle. CFX96 Module Optique
Microfuge 18 CentrifugeuseBeckman Coulter  ;367160
Nanodrop-1000Thermoscientifique  ;1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit  ;Qiagen  ;204154Utilisé pour la RT-qPCR
RNeasy en 1 étape, Kit d’isolement d’ARNQiagen  ;74106Utilisé pour l’extraction de l’ARN
RPMI-medium  ;Gibco11875093

Références

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