Seule étape Purification des Complexes macromoléculaires utilisant l’ARN attaché à la biotine et un éditeur de liens Photo-clivables

Summary

Les complexes ARN/protéines purifiées à l’aide de la stratégie de streptavidine-botin sont éluées à solution dans des conditions dénaturation sous une forme impropre pour davantage de purification et d’analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici une modification de cette stratégie qui utilise un linker photo-clivables en ARN et une étape d’élution UV douce, ce qui donne des complexes ARN/protéines natives et pleinement fonctionnels.

Abstract

Pendant de nombreuses années, l’interaction exceptionnellement forte et rapidement formée entre la biotine et la streptavidine a été utilisée avec succès pour la purification partielle de biologiquement importants complexes ARN/protéines. Cependant, cette stratégie souffre d’un inconvénient majeur qui limite son utilisation plus large : l’interaction de la streptavidine/biotine peut être cassée seulement dans des conditions qui perturbent également l’intégrité des complexes éluées, excluant par conséquent dénaturantes leur analyse fonctionnelle et/ou encore de purification par d’autres méthodes. En outre, les échantillons éluées sont fréquemment contaminés avec les protéines de fond qui associent non spécifique avec des perles de streptavidine, ce qui complique l’analyse des complexes purifiées par coloration à l’argent et la spectrométrie de masse. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une variante de la stratégie de streptavidine/biotine dans lequel biotine est attaché à un substrat ARN via un linker photo-clivables et les complexes immobilisés sur des billes de streptavidine sont élués sélectivement à la solution dans un forme native de grande longueur d’onde UV, laissant les protéines de fond sur les perles. Substrats de liaison RNA plus courtes peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine et l’éditeur de liens photo-clivables covalente à l’extrémité 5' de l’ARN, tandis que des substrats de RNA plus longues peuvent être fournis avec les deux groupes par un oligonucléotide complémentaire. Ces deux variantes de la méthode d’élution UV ont été testés pour la purification des U7 snRNP-dépendant de traitement complexes qui coupent les histones pré-ARNm à l’extrémité 3' et ils ont tous deux prouvèrent pour comparer favorablement aux autres précédemment développé des méthodes de purification. Les échantillons UV-élué contiennent facilement détectable de la snRNP U7 qui était exempt de contaminants de la protéine majeure et adapté à l’analyse directe par spectrométrie de masse et de tests fonctionnels. La méthode décrite peut être facilement adaptée pour la purification des autres complexes de liaison ARN et utilisée en conjonction avec des sites de liaison simple et double-brin de l’ADN pour purifier les protéines ADN spécifiques et complexes macromoléculaires.

Introduction

Chez les eucaryotes, les précurseurs de l’ARN polymérase II généré ARNm (pré-ARNm) subissent plusieurs événements de maturation dans le noyau avant de devenir des modèles de mRNA entièrement fonctionnel pour la synthèse des protéines dans le cytoplasme. Un de ces événements est 3' fin au traitement. Pour la grande majorité des pré-ARNm, 3' fin traitement implique de clivage couplé à la polyadénylation. Cette réaction en deux étapes est catalysée par un complexe relativement abondant composée de plus de 15 protéines¹. Animaux dépendante de réplication histone pré-ARNm est traitées à l’extrémité 3' par un mécanisme différent, dont le rôle est jou....

Protocol

1. préparation du substrat

NOTE : Substrats RNA inférieurs à 65 ~ nucléotides peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine (B) et le linker de photo-clivables (pc) (ensemble dénommé photo-clivables biotine ou pcB) par covalence attaché à l’extrémité 5' RNA (configurationcis ). RNA substrats contenant des sites de liaison significativement plus longues doivent être générés in vitro de transcription T7 (ou SP6) et ensuite recuit à un oligonucléotide courte adaptateur complémentaires contenant pcB à l’extrémité 5' (trans configuration) (Figure 1).

1. Pour les sites de lia....

Results

La méthode UV-élution a été testée avec deux substrats de RNA synthétisés chimiquement de façon covalente à l’extrémité 5' de la portion de pcB (configurationcis ) : pcB-SL (Figure 1) et pcB-dH3/5 m RNAs (Figure 2). Le 31-nucléotide pcB-SL RNA contient une structure de tige-boucle suivie d’une queue de brin unique 5-nucléotide et sa séquence est identique à l’extrémité 3' de l’histone mature ARNm (i.e., après le.......

Discussion

La méthode décrite ici est simple et outre incorporant un linker photo-clivables et l’étape d’élution UV ne diffère pas des méthodes couramment utilisées qui tirent parti de la très forte interaction entre la biotine et la streptavidine. L’étape d’élution UV est très efficace, généralement libérant plus de 75 % de l’ARN immobilisée et protéines de streptavidine beads, laissant derrière elle un fond important de protéines qui se lient non spécifiquement aux talons associées. En éliminant cette toile de fond, l’étape d’élu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
Lampe UV à ondes longues à haute intensité	Cole-Parmer	UX-97600-00
Ampoule de remplacement	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M ampoule émettant 366 nm de lumière UV (Sylvania)
ARN et oligonucléotides contenant de la biotine et un agent de liaison photo-clivable dans cis	Dharmacon (Lafayette, CO) ou Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Demander une citation dans Dharmacon
Beckman GH 3.8 rotor à godets pivotants	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612