Seule étape Purification des Complexes macromoléculaires utilisant l’ARN attaché à la biotine et un éditeur de liens Photo-clivables

Summary

Les complexes ARN/protéines purifiées à l’aide de la stratégie de streptavidine-botin sont éluées à solution dans des conditions dénaturation sous une forme impropre pour davantage de purification et d’analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici une modification de cette stratégie qui utilise un linker photo-clivables en ARN et une étape d’élution UV douce, ce qui donne des complexes ARN/protéines natives et pleinement fonctionnels.

Abstract

Pendant de nombreuses années, l’interaction exceptionnellement forte et rapidement formée entre la biotine et la streptavidine a été utilisée avec succès pour la purification partielle de biologiquement importants complexes ARN/protéines. Cependant, cette stratégie souffre d’un inconvénient majeur qui limite son utilisation plus large : l’interaction de la streptavidine/biotine peut être cassée seulement dans des conditions qui perturbent également l’intégrité des complexes éluées, excluant par conséquent dénaturantes leur analyse fonctionnelle et/ou encore de purification par d’autres méthodes. En outre, les échantillons éluées sont fréquemment contaminés avec les protéines de fond qui associent non spécifique avec des perles de streptavidine, ce qui complique l’analyse des complexes purifiées par coloration à l’argent et la spectrométrie de masse. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une variante de la stratégie de streptavidine/biotine dans lequel biotine est attaché à un substrat ARN via un linker photo-clivables et les complexes immobilisés sur des billes de streptavidine sont élués sélectivement à la solution dans un forme native de grande longueur d’onde UV, laissant les protéines de fond sur les perles. Substrats de liaison RNA plus courtes peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine et l’éditeur de liens photo-clivables covalente à l’extrémité 5' de l’ARN, tandis que des substrats de RNA plus longues peuvent être fournis avec les deux groupes par un oligonucléotide complémentaire. Ces deux variantes de la méthode d’élution UV ont été testés pour la purification des U7 snRNP-dépendant de traitement complexes qui coupent les histones pré-ARNm à l’extrémité 3' et ils ont tous deux prouvèrent pour comparer favorablement aux autres précédemment développé des méthodes de purification. Les échantillons UV-élué contiennent facilement détectable de la snRNP U7 qui était exempt de contaminants de la protéine majeure et adapté à l’analyse directe par spectrométrie de masse et de tests fonctionnels. La méthode décrite peut être facilement adaptée pour la purification des autres complexes de liaison ARN et utilisée en conjonction avec des sites de liaison simple et double-brin de l’ADN pour purifier les protéines ADN spécifiques et complexes macromoléculaires.

Introduction

Chez les eucaryotes, les précurseurs de l’ARN polymérase II généré ARNm (pré-ARNm) subissent plusieurs événements de maturation dans le noyau avant de devenir des modèles de mRNA entièrement fonctionnel pour la synthèse des protéines dans le cytoplasme. Un de ces événements est 3' fin au traitement. Pour la grande majorité des pré-ARNm, 3' fin traitement implique de clivage couplé à la polyadénylation. Cette réaction en deux étapes est catalysée par un complexe relativement abondant composée de plus de 15 protéines¹. Animaux dépendante de réplication histone pré-ARNm est traitées à l’extrémité 3' par un mécanisme différent, dont le rôle est joué par U7 snRNP, une faible abondance complexe consistant en U7 snRNA de ~ 60 nucléotides et plusieurs protéines^2,3 . Les paires de bases U7 snRNA avec une séquence spécifique en histone pré-ARNm et l’une des sous-unités de la snRNP U7 catalyse la réaction de clivage, générant des histones mature ARNm sans un poly (a) la queue. fin traitement de 3' de l’ARN pré-messager histone exige également la tige-boucle Binding Protein (PBEL), qui lie une tige-boucle conservée située en amont du site de clivage et améliore le recrutement de la snRNP U7 au substrat^2,3. Des études visant à identifier les différents composants de la snRNP U7 ont été difficiles en raison de la faible concentration de la snRNP U7 dans les cellules animales et la tendance du complexe à dissocier ou subir une protéolyse partielle durant la purification suite à l’utilisation détergents doux^4,5,6, lavages de sels élevées et/ou plusieurs étapes chromatographiques^7,8,9.

Récemment, afin de déterminer la composition de la machinerie U7-dépendant de traitement, un court fragment de biotine contenant de histone pré-ARNm à 3' ou 5' est incubé avec un extrait nucléaire et l’assemblé complexes ont été capturés sur la streptavidine d’agarose perles^5,6,10. Due à l’interaction exceptionnellement forte entre la biotine et la streptavidine, protéines immobilisées sur des billes de streptavidine ont été élués dans des conditions dénaturantes par ébullition en SDS et analysées par coloration à l’argent et la spectrométrie de masse. Bien que cette approche simple a identifié un certain nombre de composants de la snRNP U7, il a donné des échantillons relativement grossières, souvent contaminées par un grand nombre de protéines de fond non spécifique lié à la streptavidine perles, potentiellement masquant certaines composantes du les machines de traitement et d’empêcher leur détection sur argent souillé gels^5,6,10. Ce qui est important, cette approche empêche également toute étude fonctionnelle avec le matériel isolé et sa purification plus poussée à l’homogénéité des méthodes supplémentaires.

Un certain nombre de modifications ont été proposé au fil du temps d’aborder le caractère pratiquement irréversible de l’interaction de la streptavidine/biotine, avec la plupart d'entre eux étant conçu soit affaiblir l’interaction ou fournir un bras chimiquement clivables entretoise dans la biotine-contenant les réactifs^11,12. L’inconvénient de ces modifications était qu’ils réduisent significativement l’efficacité de la méthode et/ou des conditions non physiologiques souvent requises lors de l’étape d’élution, compromettre l’intégrité ou l’activité des protéines purifiées.

Nous décrivons ici une approche différente pour résoudre le problème inhérent de la stratégie de streptavidine/biotine en utilisant RNA substrats dans lequel biotine est covalente à la 5' mettre fin via une photo-clivables 1-(2-nitrophényl) portion d’éthyle qui est sensible à la longue vague UV^13,14. Nous avons testé cette approche pour la purification de la machinerie de traitement limitante U7 dépendant de drosophile et mammifères nucléaire extrait¹⁵. Après une courte incubation de biotine contenant de l’ARN pré-messager histone et l’éditeur de liens clivables-photo avec un extrait nucléaire, les complexes de traitement assemblé sont immobilisés sur des billes de streptavidine, lavés et doucement libérés dans la solution en natif se forment par exposition à une lumière ~ 360 nm UV. La méthode UV-élution est très efficace, rapide et simple, ce qui donne une quantité suffisante de la snRNP U7 pour visualiser ses composantes par sliver coloration d’aussi peu que 100 µL de l' extrait¹⁵. Le matériel UV-élué est exempt de protéines de fond et approprié pour l’analyse directe par spectrométrie de masse, des étapes de purification supplémentaire et des essais enzymatiques. La même méthode peut être adoptée pour la purification des autres complexes ARN/protéines qui nécessitent des sites de fixation de RNA relativement courtes. Biotine et l’éditeur de liens clivables-photo peuvent également être par covalence fixés à single - et ADN bicaténaire, potentiellement étendre la méthode d’élution UV pour la purification de divers complexes ADN/protéine.

Synthèse chimique des substrats de RNA contenant par covalence attaché biotine et l’éditeur de liens photo-clivables pratique qu’avec les séquences qui ne dépassent pas 65 ~ nucléotides, plus coûteuse et inefficace pour les séquences significativement plus longues. Pour résoudre ce problème, nous avons développé également une autre approche qui convient à des objectifs contraignants RNA beaucoup plus longues. Dans cette approche, l’ARN de n’importe quelle séquence de longueur et de nucléotide est généré en vitro par transcription T7 ou SP6 et recuite à un court oligonucléotide complémentaire qui contient de la biotine et l’éditeur de liens photo-clivables à l’extrémité 5' (trans configuration). Le duplex qui en résulte est ensuite utilisé pour purifier les protéines de liaison individuelle ou complexes macromoléculaires streptavidine perles suivant le même protocole décrit pour les substrats de RNA contenant photo-clivables biotine attaché de façon covalente (CEI configuration). Avec cette modification, la biotine photo-clivables peut être utilisée en conjonction avec in vitro généré transcriptions, contenant des centaines de nucléotides, d’étendre la méthode d’élution UV pour la purification d’une large gamme d’ARN/protéines.

Protocol

1. préparation du substrat

NOTE : Substrats RNA inférieurs à 65 ~ nucléotides peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine (B) et le linker de photo-clivables (pc) (ensemble dénommé photo-clivables biotine ou pcB) par covalence attaché à l’extrémité 5' RNA (configurationcis ). RNA substrats contenant des sites de liaison significativement plus longues doivent être générés in vitro de transcription T7 (ou SP6) et ensuite recuit à un oligonucléotide courte adaptateur complémentaires contenant pcB à l’extrémité 5' (trans configuration) (Figure 1).

1. Pour les sites de liaison composé de moins de 65 ~ nucléotides, utilisez un fabricant commercial (Table des matières) pour synthétiser chimiquement l’ARN d’intérêt avec pcB par covalence attaché à l’extrémité 5' RNA (Figure 1 et Figure 2 a). Dissoudre dans de l’eau stérile pour obtenir la concentration désirée et stocker dans de petites parties aliquotes à-80 ° C.
2. Accepteurs significativement plus longtemps que les nucléotides ~ 65, forme un duplex partiel d’un in vitro générée, l’ARN d’intérêt et un oligonucléotide adaptateur complémentaires contenant des pcB à l’extrémité 5' (Figure 3 a).
   1. Effectuer T7 transcription sur un Plasmide linéarisé ou un modèle approprié de la PCR pour générer des RNA avec le site de liaison d’intérêt prolongé à l’extrémité 3' par une séquence arbitraire de ~ 20 nucléotides.
   2. Utilisez un fabricant commercial (Table des matières) pour synthétiser chimiquement un oligonucléotide adaptateur est complémentaire à l’extension de 3' dans l’ARN généré T7 et contenant des pcB à l’extrémité 5' (Figure 3 a).
      Remarque : Deux entretoises 18-atom et 2-3 nucléotides non-complémentaire peuvent être placés à l’extrémité 5' de l’oligonucléotide pour réduire le potentiel stérique entre le complexe lié et la streptavidine perles. Il est également souhaitable que l’oligonucléotide est uniformément modifié avec un groupe 2' O-méthyl pour augmenter la force du duplex et pour fournir la résistance contre différentes nucléases.
   3. Recuire l’ARN T7 généré pour l’oligonucléotide adaptateur de pcB.
      1. Mélanger 20 pmol d’ARN et 100 pmol de l’oligonucléotide de BPC d’adaptateur (rapport molaire de 1:5) dans un 1,5 mL tube contenant 100 µL de tampon de liaison avec la composition suivante : 75 mM KCl, 15 millimètres HEPES pH 7,9, 15 % de glycérol, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 10 mM.
         Remarque : Il est important d’utiliser une quantité minimale de l’oligonucléotide adaptateur qui est suffisant pour former un duplex avec la plupart (sinon tous) substrat de pré-ARNm, utilisé dans la réaction de recuit. Cela peut être commodément déterminée par étiquetage substrat de l’ARN à l’extrémité 5' avec ³²P, recuit le substrat marqué avec quantités croissantes de l’oligonucléotide adaptateur utiliser divers tampons conditions et surveillance de la conservation de la signal radioactif sur des billes de streptavidine après plusieurs lavages des perles avec le tampon de liaison.
      2. Placer le tube dans l’eau bouillante pendant 5 min.
      3. Laisser l’eau refroidir à température ambiante.

2. complexes d’assemblage

1. Supplément 1 mL d’un extrait nucléaire de souris (ou un autre extrait de choix) avec 80 mM EDTA pH 8 à une concentration finale de 10 mM pour bloquer les nucléases de métal-dépendante non spécifiques qui sont présents dans l’extrait.
   Remarque : Cela se traduira en ajustant le tampon non contrôlé dans l’extrait de la même composition que celle dans le tampon de liaison (voir étape 1.2.3.1). EDTA n’affecte pas en vitro traitement des histones pré-ARNm, mais peut être nocif dans la purification de protéines ou complexes de protéines qui se réunissent dans une manière dépendante du magnésium. Dans ces cas, EDTA devrait être évitée.
2. Ajouter 5-10 pmol du substrat RNA estampillé de la portion de pcB en cis (voir étape 1.1) ou trans (voir étape 1.2.3.3) à 1 mL de l’extrait contenant 10 mM EDTA.
   Remarque : La quantité de l’ARN doit être soigneusement évaluée dans une série d’expériences du procès. À l’aide de substrat de trop d’ARN pour la purification d’un complexe limitant peut-être contre-productif, augmentant considérablement le fond des protéines de liaison ARN non spécifiques sans aucun effet sur le rendement des protéines spécifiques.
3. Incuber le substrat de l’ARN avec l’extrait pendant 5 min sur la glace, occasionnellement mélanger l’échantillon.
   Remarque : Les deux le temps et la température de l’incubation doivent être établies de façon empirique et peuvent varier considérablement, selon la nature spécifique du complexe ARN/protéines.
4. Tourner le mélange d’incubation dans une micro-centrifugeuse refroidi pendant 10 min à 10 000 g pour enlever n’importe quel potentielles précipités et recueillir délicatement le surnageant évitant transférant le culot.

3. immobilisation des Complexes ARN/protéines sur des billes de streptavidine.

1. Transférer des ~ 100 µL de suspension de perle d’agarose streptavidine auprès d’un fournisseur commercial (Table des matières) dans un tube de 1,5 mL et augmenter le volume avec le tampon de liaison (75 mM KCl, 15 millimètres HEPES pH 7,9, 15 % de glycérol, 10 mM EDTA).
   NOTE : Cette mémoire tampon doit avoir la même composition que celle du mélange de recuit et de l’extrait utilisé pour l’assemblage complexe (point 2.1).
2. Collecter les perles au fond du tube en filature pendant 2-3 min à 25 x g et aspirer le surnageant.
3. Répétez la même procédure de lavage/essorage 2 ou 3 fois pour équilibrer les perles avec le tampon de liaison.
   Remarque : À la fin de cette étape, le culot des perles doit avoir un volume de ~ 30 µL.
4. Charger le surnageant contenant le complexe assemblé (étape 2.4) au cours des streptavidine équilibré d’agarose perles.
5. Faire tourner 1 h à 4 ° C pour immobiliser les ARN et les complexes liés sur les perles.
6. Collecter les perles au fond du tube en filature pendant 2-3 min à 25 x g.
   Remarque : Utilisez une balançoire rotor afin d’éviter une perte importante des perles si ils ont tendance à adhérer à la paroi du tube à rotors angulaires.
7. Aspirer le surnageant et rincer les perles deux fois avec 1 mL de tampon de la liaison, en utilisant les mêmes conditions de centrifugation.
8. Ajouter 1 mL de tampon de la liaison et faire tourner l’échantillon de 1 h à 4 ° C.
   Remarque : Cette étape peut être raccourcie si complexe formé sur le substrat tend à se dissocier.
9. Tournez en bas les perles pendant 2-3 min à 25 x g, ajouter 1 mL de tampon et transférer la suspension dans un nouveau tube.
10. Faites tourner pendant 1 h supplémentaires ou plus courte, si le complexe n’est pas stable, tournez vers le bas pendant 2-3 min à 25 g et transférer les billes dans un tube de 500 µL dans 200 µL de tampon de liaison.

4. UV d’élution.

1. Allumer une lampe UV émettant une lumière de UV 365 nm pendant 5-10 min avant d’atteindre le plein éclat de haute intensité.
   NOTE : Ceci est essentielle pour obtenir une énergie maximale d’émission UV au début de l’irradiation.
2. Remplissez le fond d’un plat de pétri (100 x 15 mm) avec de la glace serrée et empiler sur le couvercle de la capsule.
3. Brièvement vortex le tube contenant le complexe immobilisé, placez-le horizontalement sur la glace et le couvercle avec la lampe préchauffée, veiller à ce que l’échantillon est situé à une distance de 2-3 cm de la surface de l’ampoule.
   Remarque : Si la distance est trop grande, utilisez pétri supplémentaires ou autres objets appropriés pour amener l’échantillon plus près à l’ampoule.
4. Irradier pendant un total de 30 min, en retournant fréquemment et mélangé au vortex le tube pour assurer une exposition uniforme de la suspension aux ultraviolets et pour éviter la surchauffe.
   NOTE : Afin de fournir un refroidissement supplémentaire, l’étape d’élution UV peut se faire dans une chambre froide. Placez-vous dans une boîte de pétri avec de la glace fraîche en cas de fonte des glaces excessive.
5. Tournez en bas les perles pendant 2-3 min à 25 x g et recueillir le surnageant.
6. Re-spin le surnageant à l’aide des mêmes conditions et recueillir le surnageant.
   NOTE : Laisser une petite quantité de liquide surnageant au fond pour éviter de transférer des perles résiduelles.

5. analyse par coloration à l’argent suivi par spectrométrie de masse.

1. Utilisation SDS/électrophorèse sur gel polyacrylamide pour séparer une fraction du liquide surnageant UV-élution et la même fraction du matériel laissé sur les perles après élution UV.
   Remarque : L’analyse peut également inclure une partie aliquote de perles retirés de l’échantillon avant d’élution UV.
2. Souillez le gel contenant des protéines séparées en utilisant une coloration kit à l’argent disponible dans le commerce.
3. Évaluer l’efficacité des UV-élution en comparant les intensités des protéines présentes dans le surnageant UV-élué et ceux laissés sur les perles après irradiation UV.
4. Exciser les bandes de protéines d’intérêt et de déterminer leur identité par spectrométrie de masse à l’aide de protocoles standard^10,15.

6. global analyse d’échantillon UV-éluée par spectrométrie de masse.

1. Analyser directement une fraction de surnageant UV-éluée par spectrométrie de masse pour déterminer le protéome ensemble des matières purifiées de manière impartiale.
   NOTE : Cela peut être fait par-solution traitement des échantillons purifiés avec de la trypsine suivie de protocoles de spectrométrie de masse standard pour déterminer l’identité des peptides générer^10,15.

Results

La méthode UV-élution a été testée avec deux substrats de RNA synthétisés chimiquement de façon covalente à l’extrémité 5' de la portion de pcB (configurationcis ) : pcB-SL (Figure 1) et pcB-dH3/5 m RNAs (Figure 2). Le 31-nucléotide pcB-SL RNA contient une structure de tige-boucle suivie d’une queue de brin unique 5-nucléotide et sa séquence est identique à l’extrémité 3' de l’histone mature ARNm (i.e., après le...

Discussion

La méthode décrite ici est simple et outre incorporant un linker photo-clivables et l’étape d’élution UV ne diffère pas des méthodes couramment utilisées qui tirent parti de la très forte interaction entre la biotine et la streptavidine. L’étape d’élution UV est très efficace, généralement libérant plus de 75 % de l’ARN immobilisée et protéines de streptavidine beads, laissant derrière elle un fond important de protéines qui se lient non spécifiquement aux talons associées. En éliminant cette toile de fond, l’étape d’élu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
Lampe UV à ondes longues à haute intensité	Cole-Parmer	UX-97600-00
Ampoule de remplacement	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M ampoule émettant 366 nm de lumière UV (Sylvania)
ARN et oligonucléotides contenant de la biotine et un agent de liaison photo-clivable dans cis	Dharmacon (Lafayette, CO) ou Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Demander une citation dans Dharmacon
Beckman GH 3.8 rotor à godets pivotants	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612