Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba

Summary

Cet article détaille un protocole pour la préparation d'une co-culture de cellules cryptococciques et d'amibes qui est étudiée à l'aide d'images fixes fluorescentes et d'images de microscope électronique à transmission haute résolution. Illustré ici est comment les données quantitatives peuvent compléter ces informations qualitatives.

Abstract

Pour simuler l'infection à Cryptococcus, l'amibe, qui est le prédateur naturel des cellules cryptococciques dans l'environnement, peut être utilisée comme modèle pour les macrophages. Cet organisme prédateur, semblable aux macrophages, utilise la phagocytose pour tuer les cellules intériorisées. À l'aide d'un microscope à balayage laser confocal, des images illustrant des moments interactifs entre les cellules cryptococciques et les amibes sont capturées. La puissance de résolution du microscope électronique aide également à révéler le détail ultrastructural des cellules cryptococciques lorsqu'ils sont piégés à l'intérieur de la vacuole alimentaire amibe. Comme la phagocytose est un processus continu, les données quantitatives sont ensuite intégrées dans l'analyse pour expliquer ce qui se passe au moment où une image est capturée. Pour être précis, des unités de fluorescence relative sont lues afin de quantifier l'efficacité de l'amibe dans l'intériorisation des cellules cryptococciques. À cette fin, les cellules cryptococciques sont tachées d'un colorant qui les rend fluoresce une fois piégés à l'intérieur de l'environnement acide de la vacuole alimentaire. Lorsqu'elles sont utilisées ensemble, l'information recueillie grâce à de telles techniques peut fournir des informations critiques pour aider à tirer des conclusions sur le comportement et le sort des cellules lorsqu'elles sont intériorisées par l'amibe et, éventuellement, par d'autres cellules phagocytiques.

Introduction

Les microbes ont évolué au fil du temps pour occuper et prospérer dans différentes niches écologiques telles que les limites physiques ouvertes du sol et de l'eau, entre autres¹. Dans ces niches, les microbes se livrent souvent à la concurrence directe pour des ressources limitées; important, pour les nutriments qu'ils utilisent pour soutenir leur croissance ou l'espace, dont ils ont besoin pour accueillir la population en expansion^2,3. Dans certains cas, certains organismes holozoïques comme l'amibe peuvent même être antérieurs sur les cellules cryptococciques comme un moyen d'extraire....

Protocol

Cryptococcus neoformans et certaines souches Acanthamoeba castellanii sont considérées comme des agents pathogènes de niveau de biosécurité-2 (BSL-2); ainsi, les chercheurs doivent prendre les précautions appropriées lorsqu'ils travaillent avec ces organismes. Par exemple, le personnel de laboratoire devrait avoir un équipement de formation et de protection individuelle (EPI) spécifique, comme des blouses de laboratoire, des gants et une protection oculaire. Un coffret de sécurité biologique (niveau-2) devrait être employé pour des procédures qui peuvent causer l'infection^14.

1. Cultivation et normali....

Results

Les microbes sont des organismes microscopiques qui ne peuvent pas être perçus à l'œil nu. Cependant, leur impact peut entraîner des maladies cliniquement évidentes observables, telles que des infections de peau. Lors de l'étude de certains aspects des microbes, allant de leur morphologie, sous-produits, et les interactions, être en mesure de fournir des preuves picturales et vidéo est de la plus haute importance.

Nous avons d'a.......

Discussion

Dans l'article, différentes techniques ont été utilisées avec succès pour révéler les résultats possibles qui peuvent survenir lorsque l'amibe interagir avec les cellules cryptococciques. En outre, nous avons été intéressés à montrer les effets des acides gras 3-hydroxy sur les résultats des interactions Cryptococcus-amoeba.

La première technique utilisée était la microscopie confocale, qui rendait des images fixes. Le principal inconvénient de cette technique ici était qu'elle ne no.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane	Sigma-Aldrich	D27802-1,5
mL tube en plastique  ;	Thermo Fisher Scientific	69715-15-mL
Tube à centrifuger  ;	Thermo Fisher Scientific	Tube à
centrifuger 7252018-50 mL	Thermo Fisher Scientific
1132017-8-Lame de chambre à 8 puits	Thermo Fisher Scientific		1109650-Acétone
	Merck
SAAR1022040LC-Amoeba souche	ATCCÒ ;	30234TM	-
ATCC medium 712	ATCCÒ ;	712TM	Amoeba medium
Plaque microtitrée noire à 96 puits	Thermo Fisher Scientific		152089-Centrifugeuse
	Hermle	-	-
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432-Microscope
confocal	Nikon	Nikon TE 2000-Résine
			époxy
[1] NSA	[1] ALS[	1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS[	2] R1073	-
[3] Résine ERL Y221	[3] ALS[	3] R1047R	-
[4] S1 (2-diméthylaminoéthanol)	[4] ALS  ;	[4] R1067-Isothiocyanate
de fluorescéine	Sigma-Aldrich	F4274-Acide
formique	Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	Lecteur de microplaques
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-Glutaraldéhyde
	ALS	R1009	-
Hémocytomètre	Boeco	-	-
Citrate de plomb	ALS	R1209-Chromatographie
liquide Spectromètre de masse	Thermo Fisher	Scientific-Méthanol
	Sigma-Aldrich	R 34,860-Agitateur
orbital	Lasec  ;	-	-
Tétroxyde d’osmium	ALS	R1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	Il s’agit du colorant sensible au pH
Solution tampon physiologique	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB-Agitateur
rotatif	Labcon	-	-
Tampon de phosphate de sodium :
[1] hydrogénophosphate disodique dihydraté	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] di-hydrogène orthophosphate de sodium dihydraté	[2] Merck  ;	[2] Microscope électronique à
	Philips	Philips EM 100	-
Trypan bleu  ;	Sigma-Aldrich	T8154-Ultramicrotome
	Leica	EM UC7-Acétate
d’uranyle	ALS	R1260A-Dessiccateur
sous vide	Lasec  ;	-	-
Flacon	Sigma-Aldrich	29651-U-YNB
	Lasec  ;	239210-YPD
gélose	Sigma-Aldrich	Y-1500	-