Une étude Immunohistopathologic pour profiler le Folate récepteurs bêta Macrophage et vasculaire microenvironnement immunitaire dans l’artérite à cellules géantes

Résumé

Le protocole illustre l’utilisation de l’examen histopathologique et immunohistochimie à profil macrophage folate récepteurs bêta et sa relation avec la cellule immunitaire totale s’infiltrent dans les biopsies de l’artère temporale dans l’artérite à cellules géantes.

Résumé

Artérite à cellules géantes (GCA) est une chronique auto-immune maladie des artères de tailles moyenne à grande qui affecte les personnes âgées. GCA manifestes souffrant d’arthrite et symptômes occlusifs de maux de tête, accident vasculaire cérébral ou de perte de vision. Les macrophages et les lymphocytes T-helper s’infiltrer dans la paroi vasculaire et produisent une réponse pro-inflammatoire qui mènent à une lésion vasculaire et une ischémie. A ce jour, il n’y a aucun biomarqueur de GCA qui peut surveiller la maladie activité et guide de réponse thérapeutique.

Acide folique récepteurs bêta (FRB) est une protéine glycosylphosphatidylinositol ancrée sur les membranes cellulaires et normalement exprimée dans la lignée de myélomonocytaire et dans la majorité des cellules de leucémie myéloïde, ainsi que dans la tumeur et les macrophages synoviaux rhumatoïdes, où son expression est corrélée avec la sévérité de la maladie. La capacité de la FRB pour lier des composés de l’acide folique, acide folique-conjugués et médicaments antifoliques a fait une cible thérapeutiques dans le cancer et la recherche sur les maladies inflammatoires. Ce rapport décrit les méthodes histopathologiques et immunohistochemical utilisés pour évaluer l’expression et la distribution de FRB en ce qui concerne les GCAimmunopathology.

Biopsies de l’artère temporale fixés au formol et inclus en paraffine de GCA et témoins normaux ont été colorées à l’hématoxyline et éosine revue histologie du tissu et identifier les fonctionnalités pathognomoniques. L’immunohistochimie a été utilisé pour détecter l’expression FRB, CD68 et CD3. Une analyse microscopique a été réalisée afin de quantifier le nombre de cellules colorées positivement sur les 10 sections de high-power-champ sélectionnées et leurs emplacements respectifs dans la paroi artérielle.

L’inflammation des Lymphohistiocytes (LH) accompagné de l’hyperplasie intimale et limitante élastique perturbé chez GCA avec aucun trouvé chez les témoins. L’infiltrat LH se composait d’environ 60 % de lymphocytes et 40 % de macrophages. L’expression FRB était restreinte aux macrophages, composée de 31 % de la population totale de macrophage CD68 + et localisée à la média et l’adventice. Aucun FRB a été observée chez les témoins.

Ce protocole a démontré une nette tendance numérique et spatiale du macrophage FRB par rapport au micro-environnement immunitaire vasculaire de GCA.

Introduction

Artérite à cellules géantes (GCA) est une maladie inflammatoire des artères moyennes à grandes, ciblant l’aorte et ses branches et qui touchent les personnes âgées. Il présente avec légère à des complications ischémiques sévères tels que maux de tête, douleur à la mâchoire, une perte de vision, accidents vasculaires cérébraux et les tissus de la gangrène. Le diagnostic est confirmé par les marqueurs de l’inflammation élevées comme la vitesse de sédimentation globulaire (VSG) et un modèle histopathologique distinct sur l’artère temporale biopsie (onglet)¹. GCA est la vascularite adulte plus commun, et l’accessibilité de l’artère temporale obtenu pour le diagnostic présente un avantage sur les autres vasculopathies, ce qui permet à on d’étudier sa pathogenèse plus facilement. Les résultats typiques dans onglet incluent un infiltrat des macrophages/histiocytes et des lymphocytes T dans toutes les couches vasculaires de l’intima de tunica, média et adventice avec destruction simultanée de la lame élastique qui sépare normalement ces compartiments². L’évidence actuelle démontre que GCA implique un antigène inconnu qui active les cellules dendritiques dans l’adventitia vasculaire, suivi par le recrutement d’assistant des cellules T (Th), spécifiquement les sous-types Th1 et Th17 qui sécrètent l’interleukine-17 et l’interféron-gamma (IFG) respectivement. IFG puis recrute et active les macrophages pour produire des cytokines et des protéases. Il s’agit de cytokines pro-inflammatoires ; notamment IL-12, qui réciproquement active les cellules Th1 offrant ainsi une boucle de rétroaction positive ; facteur de nécrose tumorale et l’interleukine-6, qui provoquent l’arthrite et les fièvres et les métalloprotéases qui endommagent la lame élastique. Glucocorticoïdes (GC), qui constituent la norme de traitement chronique, contrôlent partiellement les voies des cytokines en atténuant la Th17/IL-17 mais pas le bras Th1/IFG de la réponse immunitaire^3,4. Malheureusement, abandon du GC se traduit par la rechute de la maladie. Comme une modalité alternative, le méthotrexate a été réaffecté pour le traitement de la GCA, mais les critères d’évaluation cliniques désirés n’étaient pas toujours atteint bien que biomarqueurs plus sensibles n’ont pas été utilisés pour la surveillance thérapeutique^5,6 . En 2017, l’inhibiteur de l’interleukine 6, tocilizumab, a été approuvé pour le traitement de GCA, comme l’a démontré efficacement contre la maladie et stéroïde épargnant les effets^7,8.

A ce jour, il n’y a aucune bonnes biomarqueurs de GCA. En conséquence, il est difficile de surveiller l’activité de la maladie et titrer les doses de médicaments disponibles afin d’éviter les effets indésirables et de réduire le fardeau du coût pour la société. Ainsi, il est impératif de chercher un biomarqueur candidat qu’est en corrélation avec l’activité de la maladie, éclairerait roman sur la pathogenèse et l’aide aux décisions thérapeutiques.

Le dérèglement de l’activation des macrophages est un facteur critique dans la pathogenèse de la GCA. Ainsi, un moyen efficace de traiter la GCA peut-être le ciblage sélectif des macrophages activés. L’acide folique récepteurs bêta (FRB) est une glycoprotéine glycosyl-phosphatidylinositol qui est ancrée sur la membrane cellulaire exprimée dans les cellules normales myélomonocytaire, cellules de leucémie myéloïde et activé macrophages. Son ligand, l’acide folique est une vitamine essentielle dans sa forme réduite, ce qui permet à l’ADN cellulaire synthèse, méthylation et réparation⁹. L’expression FRB est induite dans les maladies auto-immunes et au cours de la cancérogenèse. Son expression est limitée à la surface des monocytes ou macrophages pro-inflammatoires de M1 dans la polyarthrite rhumatoïde, ou aux anti-inflammatoires M2 macrophages dans les organes pleins et myéloïde^{10,11,12 , 13}. en plus de son rôle potentiel comme biomarqueur des macrophages activés, la FRB pouvez activer le transport de drogue sélective à travers un processus en plusieurs étapes qui commence par la fixation du récepteur de l’acide folique, antifolates ou médicaments folate conjugué à la cellule surface, suivie d’intériorisation, de libération et de livraison éventuelle de drogue souhaitée à la cellule interne machines^12,14,15,16. Contrairement aux FRB exprimée dans les cellules cancéreuses et activé macrophages, FRB exprimée dans les cellules hématopoïétiques normales ne peut lier les folates assurant que FRB/folate-mediated medicaments se limite à FRB séropositifs inflammatoire ou de cellules cancéreuses.

Dans notre étude précédente, nous avons démontré pour la première fois que FRB s’exprime dans les macrophages de GCA et son expression corrélée avec CD68 + et l’endothéline macrophages de récepteurs bêta, qui contribuent à la GCA pathogenèse¹⁷. Dans ce rapport, nous décrivons la histopathologiques et méthodes immunohistochimiques pour évaluer le macrophage FRB et analysé le total de lymphocytes et macrophages compte pour avoir un aperçu de la position de la FRB dans le paysage vasculaire de GCA.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel Penn State.

1. histopathologique préparation et le traitement après l’obtention de biopsie de l’artère temporale

Remarque : La biopsie de l’artère temporale (onglet) est réalisée sous anesthésie locale et en conditions stériles par un chirurgien. Après l’obtention d’une section artérielle de 3 cm sur le côté plus affecté chirurgicalement, le spécimen est fixé dans du formol immédiatement pendant 24 h, divisé en sections de 3 à 4 mm et incorporé à la paraffine, en faisant attention à l’alignement correct des tissus dans le bloc qui est ensuite stocké à température ambiante. Sélection de l’échantillon est effectuée après avoir vérifié les dossiers médicaux. Le diagnostic repose sur l’American College of Rheumatology 1990 critères qui exige que les sujets remplissent 3 des 5 domaines : âge > 50 ans, nouveaux maux de tête, tendresse de l’artère temporale, une vitesse de sédimentation > 50 mm/heure par méthode Westergren et un onglet anormal. Pour la sécurité, des gants de protection doivent être portés en tout temps lors de la manipulation des échantillons, des produits chimiques et des anticorps.

1. Des blocs incorporés, couper 4-5 µm coupes épaisses à l’aide d’un microtome. et coloration à l’hématoxyline et éosine (H & E). Utilisation d’une section de contrôle de certains tissus normaux pour l’assurance qualité.
2. Flotteur coupe sur un bain d’eau chaude chauffée à 40 ° C pour éliminer les rides et ramasser avec une lame microscopique de verre enduit.  Placez les lames de verre sur une assiette chaude dans un four à 60 ° C pendant 60 minutes faciliter le séchage et le respect de l’article à la diapositive.
3. Placez les lames de verre sur une assiette chaude dans un four à 60 ° C pendant 60 minutes faciliter le séchage et le respect de l’article à la diapositive.
4. Monter 3 sections sur lames de microscope.
5. Placer les lames dans une grille verticale et sécher pendant la nuit à 37 ° C pendant 24 h.
6. Placer les lames dans un récipient et conserver à 4 ° C.

2. Immunohistochemical préparation, décirage, recherche d’antigène et des taches^15,18,19,20

1. Charger des diapositives dans une grille coulissante. Exécutez la grille grâce à des plats comme suit : deux fois dans le xylène à 100 % pendant 5 minutes avec 10 secondes d’agitation douce toutes les 30 secondes, une fois à 100 % d’éthanol en agitant 10 secondes, une fois à 90 % d’éthanol en agitant 10 secondes, une fois dans l’éthanol à 70 % en agitant 10 secondes , et deux fois en double distillée H2O avec agitation de 10 secondes.
   Remarque : Manipulation du xylène et acétone devrait faire dans hottes ventilés pour éviter l’inhalation et toxicité respiratoire.
2. Récupérer l’antigène en transférant la crémaillère dans un récipient en verre avec 200 mL de 10 mmol/L, un tampon au citrate 6.0 pH préchauffé à 95 ° C. Régler la minuterie de 30 minutes dans le bain d’eau, puis laisser refroidir à température ambiante pendant 20 minutes puis rincer à l’eau courante pendant 5 minutes.
3. Supprimer l’activité peroxydasique endogène en incubant dans 200 mL d’eau oxygénée à 3 % pendant 10 minutes. Les lames 3 fois dans 200 µL de solution saline tamponnée Tris (TBSS).
4. Supprimer les diapositives de la crémaillère et tamponnez chacun doucement pour essuyer l’excès de tampon. Pour la coloration, ajouter 200 µL de l’anticorps primaires suivantes, ajoutez les lamelles sur les diapositives et incuber dans une chambre humide pendant 1 heure à température ambiante :
   Anticorps anti-FRB dilué 1:800
   Anti-humain monoclonal de souris CD68, dilution de 1 : 200
   Dilution de 1 : 100 anticorps polyclonal de lapin anti-CD3
   Remarque : Fixés au formol des sections de paraffine du placenta ont été également traitées comme indiqué dans les étapes de 2,1 à 2,9 et incubées avec anti-FRB18 et utilisées comme témoin positif. Coloration des résultats ont été obtenus en trouvant la concentration optimale d’anticorps et a été réalisée par titrage des anticorps dans les dilutions doubles (par exemple, 01:50, 1/100, 1 : 200, 1 : 400, 1:800, 1:1600).
5. Enlever lamelle couvre-objet après incubation et jetez-la. Rincer les lames 3 fois pendant 2 minutes chacun avec TBSS, égoutter et essuyer l’excès de tampon.
6. Ajouter 200 µL de solution d’anticorps secondaire contenant secondaire biotinylé d’Anti-Rabbit/souris pour réagir avec l’anticorps primaire lié aux antigènes de tissu. Lamelles couvre-objet sur des glissières et incuber dans une chambre humide pendant 45 minutes à température ambiante.
7. Enlever lamelle couvre-objet après incubation et jetez-la. Rincer les lames 3 fois pendant 2 minutes chacun avec le SCT, égoutter et essuyer l’excès de tampon.
8. Ajouter 200 µL de la diaminobenzidine (DAB) + tampon de substrat (Imidazole HCl)-système de chromogène et incuber pendant 10 minutes pour visualiser le modèle de marquage. Laver avec TBSS puis dans l’eau courante pendant 10 minutes.
9. Contre-coloration à l’hématoxyline pendant 3 minutes.
10. Monter les diapositives en appliquant 70 µL de milieu de montage à la surface de la lame. Lentement basculer la lamelle sur le support de montage et éviter de créer des bulles comme vous abaissez en place. Attendre 24 heures pour sécher.

3. histopathologique et analyse de l’immunohistochimie (IHC)

Examiner l’H & E et IHC coupes provenant de sujets positifs et normales GCA, à l’aide d’un microscope photonique colorées.

1. Coupes colorées pour le H & E :
   1. Évaluer l’architecture vasculaire et d’identifier les cellules endothéliales dans l’intima de tunica, dans les médias de tunica et les fibroblastes, les cellules musculaires lisses et vasa vasorum dans la tunique adventice^21,22.
   2. Identifier les caractéristiques de GCA, incluent des lymphocytes et infiltration de macrophages/histiocyte, une hyperplasie cellulaire et la dégradation de la limitante élastique interne.
   3. Analyser l’infiltrat lymphohistiocytes de les identifier et de quantifier le nombre de macrophages par rapport à des lymphocytes. Évaluer l’ampleur de la perturbation de la limitante élastique interne et des modifications hyperplasiques dans les cellules résidentes et comparer avec les contrôles.
2. Pour l’IHC coupes coloré :
   1. Examiner le modèle de coloration de la FRB, prenant acte de son expression en un type particulier ou des types de cellules et de sa répartition dans les couches vasculaires et sa relation à l’infiltrat abri total, le marqueur de macrophage total, anti-CD68 et le pan marqueurs lymphocytaires anti-CD3.
   2. Quantifier l’expression des cellules FRB, CD68 et CD3 en comptant les cellules colorées positivement sur 10 champs choisis au hasard haute puissance multiples (hpf) et enregistrer les moyens.
      Remarque : Identification de ces cellules normales et pathologiques et les structures ont été réalisées par un pathologiste cardiovasculaire certifié (J.M.) et rhumatologue (S.A.A.) et les résultats ont été enregistrés dans tous les cas.
   3. Capturer des images représentatives à l’aide d’un appareil photo numérique.
      Remarque : Après ces étapes, restant aliquotes peut-être être conservé à-80 ° C.

Résultats

Constatations histopathologiques

H & E les taches en anatomie artérielle normale démontrée de spécimens normaux avec des cellules endothéliales dans l’intima de tunica, cellules musculaires lisses dans les médias de tunica, et une matrice de collagène hétérogènes incluent des fibroblastes et navires feeder appelé vasa vasorum dans l’adventitia tunica. Il n’y a aucun infiltrat inflammatoire identifié. Artères...

Discussion

GCA est la vascularite plus courante chez les adultes, et sa caractéristique pathologique illustre une combinaison puissante des lymphocytes de T helper et activé macrophages que l'on retrouve également dans d’autres maladies granulomateuses ou vasculopathies comme la sarcoïdose et Polyangéite granulomateuse^2,3. En GCA, l’artère temporale fournit une bonne représentation d’une artère de taille moyenne à grande, et la biopsie TA donne un échantillon non négligeabl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtome	Reichert-Jung
lames de microscope unies et givrées et lamelles de recouvrement	Fisher Scientific  ;
Rack vertical	Fisher Scientific  ;
Microscope optique	Olympus BX60 Microscope
Xylène
Acétone dans l’eau			Concentrations 100 %, 90 %, 70 %
saline tamponnée au Tris (TBS)  ;	Dako Wash BufferS3006
3 % de peroxyde d’hydrogène dans TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  ; Support de montage	Fisher Scientific  ;	SP-15-100
Harleco Gill’s III Hematoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1 % Solution mère alcoolique	Fisher Scientific  ;	23-749-977
10 mM d’acide citrique monohydraté (pH 6,0)
Récepteur polyclonal anti-folate de lapin bêta	Manohar Ratnam		optimisé au 1:800
Souris monoclonale anti-humaine CD68	Dako  ;	M071801	optimisé au 1:200
Lapin polyclonal anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimisé au 1:100
Chèvre polymère anti-lapin/souris Anticorps secondaire	Dako
Tissu			; pour commande positive FRB