Article de méthode

Immunotransfert quantitative de lignées cellulaires comme norme pour valider l’Immunofluorescence pour quantifier les biomarqueurs des protéines dans des échantillons de tissus courants

DOI :

10.3791/58735

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7 janvier 2019

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1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons l’utilisation d’immunotransfert quantitative pour valider l’histologie immunofluorescence couplée avec l’analyse de l’image comme un moyen de quantifier une protéine d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP). Nos résultats démontrent l’utilité de l’examen histologique immunofluorescence pour déterminer la quantité relative de biomarqueurs protéines dans des échantillons de biopsie systématique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantification des protéines d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFPE) est importante dans les cliniques et les demandes de recherche. Une méthode de quantification optimale est exacte, dispose d’une large gamme dynamique linéaire et maintient l’intégrité structurale de l’échantillon permettant l’identification des types de cellules individuelles. Les méthodes actuelles telles que l’immunohistochimie (IHC), spectrométrie de masse et immunoblotting chacun ne satisfont pas à ces dispositions en raison de leur nature catégorique ou besoin d’homogénéiser l’échantillon. Comme méthode alternative, nous vous proposons l’utilisation de l’immunofluorescence (IF) et analyse d’image pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans les tissus FFIP. Dans les présentes, nous démontrons que cette méthode est facilement optimisée, donne une large gamme dynamique et est quantifiable linéairement par rapport à l’étalon-or d’immunoblotting quantitative. En outre, cette méthode permet le maintien de l’intégrité structurale de l’échantillon et permet la distinction des divers types de cellules, qui peut être crucial dans les applications de diagnostic. Dans l’ensemble, c’est une méthode robuste à la quantification relative de protéines dans des échantillons FFPE et peut être facilement adapté à la fonction clinique ou besoins en recherche.

Introduction

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La nécessité de quantifier des protéines dans des échantillons fixés au formol, paraffine de biopsie du tissu (FFIP) existe dans de nombreux domaines cliniques. Par exemple, des protéines de biomarqueurs chez les spécimens de biopsie systématique est employé pour élucider le pronostic et informer le traitement pour le cancer patients1. Cependant, les méthodes actuelles sont généralement subjectives et manquent de validation.

L’immunohistochimie (IHC) est utilisé de manière routinière dans les laboratoires de pathologie et dépend généralement un anticorps primaire dirigé à la protéine cible et un anticorps secondaire ....

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Protocole

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Autorisation d’utiliser des échantillons de tissus humains primaires a été obtenue de la Health Sciences et affilié hôpitaux d’enseignement recherche Ethics Board (HSREB) à l’Université Queen.

1. construction d’un lignée cellulaire tissu Microarray (TMA)

  1. Récolter et laver les cellules.
    Remarque : Ce protocole a été testé sur plusieurs lignes de cellules immortalisées (p. ex. HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. Pour les cellules adhérentes, récolter environ 1,3 x 107 cellules dès qu’ils atteignent environ 80 % de confluence. Détacher les cellules à l’aide d’un réactif approprié pour cette ligne de la cellule.
      ....

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Résultats

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Ce protocole a été utilisé pour confirmer la capacité de IF pour déterminer la quantité relative de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 dans les lignées cellulaires à confectionner des blocs de tissus FFIP. Quantification de Bcl-2 sélectivement dans les cellules cancéreuses peut élucider les mécanismes oncogènes et peut être utile dans le diagnostic pathologique et en informant des décisions de prise en charge clinique24. Plus précisément, Bcl-2 joue un rôle dans le.......

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Discussion

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Nous avons décrit une méthode qui utilise immunoblotting quantitative (IB) pour démontrer l’utilité de l’immunofluorescence (IF) pour déterminer l’abondance relative d’une protéine cible dans les échantillons de tissus FFIP. Les méthodes actuelles de quantification des protéines sont limités par leur nature catégorique, comme chromogène IHC2,3, ou par la nécessité d’homogénéiser les échantillons, empêchant l’enquête sur la population échantillon de structure et c.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été financé en partie par le Fredrick Banting et Charles Best Canada Graduate Scholarship (a.m.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
697DSMZACC 42Lignée cellulaire
JeKo-1ATCCCRL-3006Lignée cellulaire
JurkatATCCTIB-152Lignée cellulaire
RCH-ACVDSMZACC 548Lignée cellulaire
Granta-519DSMZACC 342Lignée cellulaire
REHDSMZACC 22Lignée cellulaire
RajiATCCCCL-86Lignée cellulaire
HeLaATCCCCL-2Lignée cellulaire
Trypsine/EDTA solutionInvitrogenR001100Pour détacher les cellules adhésives
Sérum fœtal bovin (FBS)Wisent Inc.81150Pour neutraliser la trypsine
Protocole de formaline tamponné neutre245-684Pour fixer les pastilles
cellulaires Agarose à faible point de fusion UltraPureInvitrogen15517-022Pour couler les granules cellulaires
Anticorps monoclonal anti-humain Bcl-2 de souris, clone 124Dako (Agilent)cat# : M088729-2, RRID : 2064429Pour détecter Bcl-2 par immunofluorescence et immunotransfert (lot# :  ; 00095786
Ventana Discovery XTRoche-Pourl’automatisation de la coloration par immunofluorescence
Système EnVision+- Polymère marqué HRP (anti-souris)Dako (Agilent)K4000Pour l’amplification du signal d’immunofluorescence
Système EnVision+- Polymère marqué HRP (anti-lapin)Dako (Agilent)K4002Pour l’amplification du signal d’immunofluorescence
Cyanine 5 réactif de tyramidePerkin ElmerNEL745001KTPour l’amplification du signal d’immunofluorescence
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Pourafficher les lames numérisées
Logiciel d’analyse d’images HALOIndica Labs-Pourd’immunofluorescence
(Halt protease inhibitor cocktail, 100X)Thermo Scientific1862209Pour ajouter à Tampon RIPA
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)BioShopEDT001Pour tampon RIPA
NP-40BDH Limited56009Pour tampon RIPA
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750Pour tampon RIPA
GlycérolFisherBiotechBP229Pour tampon Laemlli
Bleu de bromophénolBioShopBRO777Pour tampon Laemlli
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Pour tampon Laemlli
Albumine sérique bovine (BSA)BioShopALB001Pour les lavages immunoblot
Échelle protéique (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Pour l’utilisation du gel protéiné
Papier filtre (Papier tampon extra épais)Bio-Rad1703969Pour le buvard
transfert Membrane nitrocellulosiqueBio-Rad162-0115Pour transfert
trans-blot SD cellule de transfert semi-sècheBio-Rad1703940Pour transfert demi-sec
Lait écrémé en poudre (lait écrémé en poudre)Cell Signaling Technology9999SPour tampon de blocage
Tween 20BioShopTWN510Pour tampon de lavage
GAPDH rabbit anticorps monoclonalEpitomics2251-1Anticorps primaire de la protéine de contrôle (lot # : YE101901C)
Anticorps IgG anti-souris de chèvre (HRP conjugué)abcamcat# : ab6789, RRID : AB_955439Anticorps secondaire pour immunoblot
Anticorps IgG anti-lapin de chèvre (HRP conjugué) anticorpsabcamcat# : ab6721, RRID : AB_955447Anticorps secondaire pour immunoblot (lot # : GR3192725-5)
Clarity Western Substrats ECLBio-Rad1705060Pour la détection des signaux immunoblot
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461Pour la détection des signaux immunoblot
LogicielImageJ Freeware, NIH-Pourl’analyse densitométrique
la quantification des inhibiteurs de protéase anticorps

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A.

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Mots-clés

Immunofluorescence AssayCell Line ValidationProtein Biomarker QuantificationFFPE Tissue AnalysisImage Analysis SoftwareWestern Blot ProtocolFluorescence Intensity MeasurementLinear Dynamic RangePearson Correlation Test

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