Détection de l’activité de dimérisation du domaine ligands de œstrogènes Alpha du récepteur à l’aide de l’essai de deux-hybride chez les mammifères

Yukitomo Arao; Kenneth S. Korach

doi:10.3791/58758

Article de méthode

Détection de l’activité de dimérisation du domaine ligands de œstrogènes Alpha du récepteur à l’aide de l’essai de deux-hybride chez les mammifères

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DOI :

10.3791/58758

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19 décembre 2018

Yukitomo Arao¹ , Kenneth S. Korach¹

¹Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une méthode pour analyser la 4-hydroxy-tamoxifène-dépendants oestrogène receptor ligands domaine dimérisation activité alpha utilisant l’analyse de deux-hybride chez les mammifères.

Résumé

Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. La séquence de la protéine ERα est hautement conservée entre les espèces. On a pensé que la fonction de l’homme et la souris ERαs est identique. Nous démontrons l’effet différentiel 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) souris et ERα ligands domaine (LBD) dimérisation activités humaines utilisant le mammifère-hybride (M2H) test. Le dosage M2H peut démontrer l’efficacité de l’activité de homodimérisation LBD dans les cellules de mammifères, utilisant la transfection des plasmides d’expression de deux protéines (GAL4 DNA-binding domain [DBD] fusion LBD et VP16 transactivation domaine [VP16AD] fusion LBD) et un GAL4-responsive element (GAL4RE) fondue plasmide rapporteur luciférase. Lors de la fusion de GAL4DBD LBD et la fusion de VP16AD LBD font un dimère dans les cellules, ce complexe protéique se lie à la GAL4RE et, ensuite, active l’expression des gènes par le biais de l’activité de transcription dépendant de VP16AD une luciférase. L’activation de la luciférase induite par le 4OHT est plus élevée dans les cellules HepG2 qui ont été transfectées avec les plasmides souris ERα LBD fusion protein expression que dans les ERα LBD fusion protein expression plasmide transfecté des cellules humaines. Ce résultat suggère que l’efficacité de la souris 4OHT-dépendante de l’activité homodimérisation ERα LBD est plus élevée que l’humain ERα LBD. En général, l’utilisation du dosage M2H n’est pas idéale pour l’évaluation de l’activité de dimérisation du récepteur nucléaire LBD, car des ligands agonistes améliorent le niveau de base de l’activité LBD et gêner la détection de l’activité de dimérisation LBD. Nous avons trouvé que 4OHT n’améliore pas l’activité basale ERα LBD. C’est un facteur clé pour être capable de déterminer et de détecter l’activité de dimérisation de LBD 4OHT-dépendant pour l’utilisation avec succès le test M2H. LBD ERα M2H analyses peuvent être appliquées pour étudier l’activité agoniste partielle des modulateurs des récepteurs œstrogènes (p. ex., 4OHT) dans divers types de cellules de mammifères.

Introduction

Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. L’acides aminés sequenceof ERα est hautement conservée entre les espèces. En raison de l’homologie supérieur entre l’homme et souris ERα, la fonction de ces récepteurs est considérée comme identique, et l’activité différentielle des substances oestrogéniques (par exemple, le tamoxifène) chez ces espèces est causée par des différences dans l’espèce métabolismes chimiques plutôt que par des différences structurelles de ERα. ERα a hautement conservée les structures de domaine qui sont fréquents chez la superfamille des récepteurs nucléaires (NR), désignée A p....