Préparation des organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de séchage chimique pour l’analyse morphologique en microscopie électronique (MEB)

Résumé

Analyse de la SEM est une méthode efficace pour aider à l’identification des espèces ou discrimination phénotypique. Ce protocole décrit les méthodes pour l’examen des détails morphologiques spécifiques des trois types représentatifs des organismes et serait applicable à l’examen des caractéristiques d’un grand nombre d’organismique et types de tissus.

Résumé

Microscopie électronique (MEB) est une technique largement disponible qui a été appliquée à l’étude des spécimens biologiques allant des protéines individuelles aux cellules, tissus, organelles et même tout l’organisme. Ce protocole se concentre sur deux méthodes de séchage chimiques, hexaméthyldisilazane (HMDS) et t-butanol (TBA) et leur application à l’imagerie d’organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de sem Dans cet article, nous décrivons comment fixer, laver, déshydrater, sécher, monter, bredouiller manteau et image de trois types d’organismes : les cyanobactéries (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. et un SP inconnue), deux euglènes appartenant au genre Monomorphina (M. aenigmatica et M. pseudopyrum) et la drosophile (Drosophila melanogaster). Le but du présent protocole est de décrire une méthode rapide, peu coûteuse et simple pour obtenir des informations détaillées sur la structure, la taille et des caractéristiques de surface d’échantillons qui peuvent être largement appliquées à un large éventail d’organismes pour morphologiques évaluation. La réussite de ce protocole permettra à d’autres d’utiliser SEM pour visualiser des échantillons en appliquant ces techniques à leur système.

Introduction

Un microscope électronique à balayage (SEM) utilise un faisceau focalisé d’électrons de haute énergie pour générer une image à partir d’électrons secondaires qui montre la morphologie et la topographie d’un échantillon de¹. SEM peut servir à déterminer directement la taille physique d’un échantillon, la structure de la surface et la forme en trois dimensions et offre une plus grande résolution et de la plus grande profondeur de champ par rapport à la microscopie photonique. Une autre forme de microscopie électronique (me), microscopie électronique à transmission (TEM) utilise des électrons focalisés qui traversent l’échantillon, générant des im....

Protocole

1. préparation et Fixation

1. Préparer des cyanobactéries.
   1. Cultiver des cultures pures en F/2 médias^24,25 à une température de 28 ° C sur une 14:10 h cycle sombre de la lumière. Transférer la culture suffisante dans un tube de microtubes de 1,5 mL qu’après avoir laissé 15 min régler, le culot bactérien est environ 0,05 mL taille. Retirez le support et de la remplacer par 1,5 mL de fixateur (glutaraldéhyde à 1,25 %, du tampon phosphate 0,1 M pH 7,0), doucement, inverser plusieurs fois et incuber une nuit à 4 ° C.
   2. Les cellules fixes avec une pipette de verre dans une installation de fil....

Résultats

Les cyanobactéries sont des procaryote groupe d’organismes qui sont essentiels pour le mondial du carbone, oxygène et azote cycles^28,29. Des estimés 6000 espèces de cyanobactéries³⁰, plus entourés d’une gaine mucilagineuse qui couvrent et relient les cellules et à d’autres structures³¹, qui, ainsi que de la forme, peut être résolu au microscope³². La taille de.......

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole utilisant SEM afin d’obtenir des informations détaillées sur les caractéristiques morphologiques externes de trois types d’organismes que d’autres peuvent s’appliquer afin d’examiner les caractéristiques de nombreux types d’organismes ou de tissus. À chaque étape du protocole, il y a des points potentiels d’erreur qui peuvent survenir et sont décrits en détail ci-dessous.

Tandis que les volumes pour le fixateur et lavages donnés ici sont spécifiques, en géné.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
or&ndash ; palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Adhésif conducteur d’argent 503	Microscopie électronique Sciences	12686-15
Membranes gravées par traces Whatman Nuclepore ; diam. 25 mm, taille des pores 8 &mu ; m, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes ; diam. 25 mm, taille des pores 0,8 &mu ; m, polycarbonate, noir	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes ; diam. 25 mm, taille des pores 0,2 &mu ; m, plateau		en aluminium Sigma
	Fisher Scientific	08-732-100
Embouts de montage en aluminium (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
(25 mm)	Tiges	75186
	Microscopie électronique Sciences	76760
languettes adhésives conductrices en carbone	Microscopie électronique Sciences	77825
F/2 media Collection	de culture d’algues à l’Université du Texas à Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	Aucun numéro de catalogue indiqué - voir lien  ;
AF6 media	Bigelow - Centre National des Algues Marines et du Microbiote	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	Aucun numéro de catalogue indiqué - voir lien  ;
Milieu d’eau du sol	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyéthylène glycol tert-octylphényl éther (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	Non Numéro de catalogue indiqué - voir lien  ;
Hitachi 3400N-II SEM  ;	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE	L’entreprise ne semble plus vendre ce modèle.

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