Article de méthode

Génération de Clones de cellules de Cancer de visualiser contenant répétition télomérique RNA TERRA exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes

DOI :

10.3791/58790

⸱

17 janvier 2019

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole visant à générer des clones de cellules de cancer contenant une balise de séquence MS2 à un subtélomère unique. Cette approche, en s’appuyant sur le système de MS2-GFP, permet la visualisation des transcriptions endogènes de télomérique répétition contenant RNA (TERRA) exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Télomères sont transcrits, donnant lieu à télomérique contenant répéter longtemps non codantes RNAs (TERRA), qui ont été proposées à jouer un rôle important en biologie du télomère, y compris la formation de l’hétérochromatine et homéostasie longueur du télomère. Des découvertes récentes ont révélé que les molécules TERRA interagissent aussi avec les régions chromosomiques internes pour réguler l’expression génique dans les cellules souches embryonnaires (ES) de souris. Conformément à cette preuve, RNA fluorescence in situ hybridation RNA-analyses ont montré que seul un sous-ensemble de TERRA transcriptions localiser aux extrémités des chromosomes. Une meilleure compréhension de la dynamique des molécules TERRA aidera à définir leurs fonctions et mécanismes d’action. Nous décrivons ici une méthode pour étiqueter et visualiser les transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules cancéreuses en utilisant le système de MS2-GFP. Dans ce but, nous présentons un protocole visant à générer des clones stables, à l’aide de la lignée de cellules cancéreuses humaines estomac AGS, contenant des séquences de MS2 intégrés à un subtélomère unique. Transcription de TERRA du télomère MS2-tag se traduit par l’expression de molécules TERRA MS2-tag qui sont visualisées par microscopie de fluorescence des cellules vivantes sur la co-expression d’une protéine de liaison à l’ARN MS2 fusionnée à la GFP (MS2-GFP). Cette approche permet aux chercheurs d’étudier la dynamique des molécules TERRA single-télomères dans les cellules cancéreuses, et elle peut être appliquée à d’autres lignées cellulaires.

Introduction

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Le TERRA de RNA longue non codantes est transcrit à partir de la région subtélomériques des chromosomes et sa transcription se dirige vers les extrémités des chromosomes, se terminant au sein du tractus répétition télomérique1,2. Pour cette raison, transcriptions TERRA se composent de séquences subtélomériques dérivées à leur extrémité 5' et se terminer par des répétitions télomériques (UUAGGG chez les vertébrés)3. Important de rôles ont été proposées pour TERRA, incluant la formation de l’hétérochromatine télomères4,5, DNA réplication6, promotion de la recombinaison homologue entre les chromosomes termine7,8 , 9, réglementer les télomères structure10et télomères longueur homéostasie2,11,12,13. En outre, transcriptions TERRA interagissent avec nombreux sites d’extratelomeric à réguler l’expression des gènes très répandue dans les souris de cellules souches embryonnaires (ES)14. Conformément à ces témoignages, RNA fluorescence in situ hybridation (RNA-poisson) analyses ont montré que seul un sous-ensemble des transcriptions TERRA localiser à télomères1,2,15. En outre, TERRA a été signalé pour former des agrégats nuclear localisation sur les chromosomes X et Y dans les cellules de souris2,16. Ces résultats indiquent que les transcriptions TERRA subissent une dynamique complexe dans le noyau. Comprendre la dynamique des molécules TERRA aidera à définir leurs fonctions et mécanismes d’action.

Le système MS2-GFP a été largement utilisé pour visualiser des molécules d’ARN dans les cellules vivantes de divers organismes17,18. Ce système a servi antérieurement de tag et de visualiser des molécules TERRA single-télomère dans S. cerevisiae12,19. Grâce à ce système, il a été montré récemment que les transcriptions TERRA de levure localiser dans le cytoplasme en phase post-diauxique Maj, suggérant que TERRA peut exercer des fonctions extranucléaire20. Nous avons récemment utilisé le système MS2-GFP pour étudier les transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules de cancer du21. Dans ce but, nous avons employé l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9 pour intégrer des séquences MS2 à un télomère unique (télomérique 15 q, ci-après Tel15q) et clones exprimant MS2-tag endogènes Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones) a obtenu. La co-expression d’une protéine de liaison à l’ARN MS2 fusionnée à la GFP (MS2-GFP) qui reconnaît et se lie MS2 RNA séquences permet visualisation des transcriptions TERRA single-télomère vie cellules21. Le but du protocole illustré ici est de décrire en détail les étapes requises pour la génération de clones de TERRA-MS2.

Pour générer des clones de TERRA-MS2, une cassette de MS2 est intégrée au sein de la région subtélomériques télomérique 15 q, en aval du site TERRA de promoteur région et transcription de départ. La cassette de MS2 contient un gène de résistance de néomycine flanqué de sites de saumon fumé-p et son intégration à subtélomère 15 q est effectuée en utilisant le système CRISPR/Cas922. Après transfection de la MS2 cassette, seul les clones sont sélectionnés et subtélomériques intégration de la cassette est vérifiée par PCR, ADN, séquençage et Southern blot. Les clones positifs sont infectés par un adénovirus exprimant le Cre afin de supprimer le marqueur de sélection dans la cassette, laissant seulement les séquences MS2 et un site unique de saumon fumé-p à la subtélomère 15 q. Expression des transcriptions de MS2-tag TERRA de Tel15q est vérifiée par la RT-qPCR. Enfin, la protéine de fusion de GFP-MS2 est exprimée chez TERRA-MS2 clones par infection rétrovirale afin de visualiser les transcriptions MS2-TERRA en microscopie par fluorescence. Transcriptions TERRA peuvent être facilement détectées par RNA-poissons et imagerie de cellules vivantes avec répétition télomérique spécifiques sondes1,2,15,23. Ces approches fournissent des informations importantes sur la localisation de la population totale des molécules TERRA à résolution de cellule unique. La génération de clones contenant des séquences de MS2 à un subtélomère unique permettra aux chercheurs d’étudier la dynamique des transcriptions TERRA single-télomères dans les cellules vivantes, qui aideront à définir la fonction et les mécanismes d’action de TERRA.

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Protocole

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1. Sélection des Clones résistants néomycine

  1. La croissance de cellules AGS dans le milieu F-12_K du jambon (Kaighn) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine, pénicilline (0,5 unités par mL de milieu) et la streptomycine (0,2 µg / mL de milieu) à 37 ° C et 5 % de CO2. Transfecter les cellules à une confluence de 50-60 % avec le sgRNA/Cas9 exprimant le vecteur et la cassette de MS2 à un 01:10 rapport molaire21.
    Remarque : Dans une expérience parallèle, vérifier l’efficacité de transfection par transfectants un vecteur exprimant le GFP (c.-à-d. Cas9-GFP vecteur). Au moins 60-70 % efficacité de transfection devrait être atteints.
  2. Le jour suivant, remplacer le milieu de culture avec un milieu contenant la néomycine à concentration finale de 0,7 µg/mL (milieu sélectif).
    NOTE : Fractionnement des cellules et leur ensemencement en milieu sélectif, le lendemain de transfection permettra d’accélérer le processus de sélection. Toutes les cellules non transfectées mourront immédiatement. Si la transfection est effectuée en 6 assiettes bien, auquel cas chaque puits à un 60 % confluence contiendrait environ 0,7 x 106 cellules, le jour suivant, que les cellules peuvent être divisées dans un puits unique à un milieu sélectif contenant plat de 10 cm.
  3. Garder les cellules dans un milieu sélectif pendant 7 à 10 jours, en changeant de milieu, tout le monde ou deux jours, jusqu'à ce que seul les clones sont visibles.
  4. Cueillette des clones de cellules
    1. Préparer une plaque bien 96 contenant 10 µL de 0,25 % de trypsine dans chaque puits.
      NOTE : Préparez deux 96 plaques bien dans le cas où plus de 96 clones sont censés être cueillies.
    2. Avec l’utilisation d’un microscope, marquer la position de chaque clone visible dans le plat de 10 cm en faisant un point au fond du plat à l’aide d’un marqueur. Chaque point correspond à une colonie à prélever.
    3. Remplacer le milieu de culture avec juste assez Phosphate Buffered Saline (PBS) pour former un mince film de liquide sur les clones et pas sécher les cellules pendant la cueillette de clone.
    4. Prélever des colonies unique à l’aide d’une pipette de 10 µL. Fixez l’embout contenant 5 µL de trypsine à la colonie, puis relâcher lentement la trypsine qui restera localisée sur la colonie. Permettre la trypsine détacher les cellules pendant 1 min, puis grattez la colonie avec la pointe et sucer dans la pointe.
      Remarque : Au cours de cette procédure, renversant le plat un peu d’un côté donc pour diminuer le volume de PBS autour de la colonie étant choisi aidera le processus de cueillette en évitant les diluer la trypsine autour de la colonie. À l’aide d’un anneau de clone peut également aider à ramasser des clones unique.
    5. Placer les cellules de la colonie dans un puits de la plaque bien 96 contenant 10 µL de 0,25 % de trypsine.
    6. Incuber 5 min à température ambiante, puis remplir le puits avec 150 µL de milieu sélectif (moyenne F - 12K de Ham (Kaighn) additionné de 10 % FBS, 2 mM de L-glutamine, pénicilline (0,5 unités par mL de milieu), streptomycine (0,2 µg / mL de milieu) et contenant la néomycine à une concentration de 0,7 µg/mL.
      Remarque : Au cours de la période d’incubation autres clones peuvent être choisies. Il est recommandé de sélectionner des clones autant que possible. Les clones plus sont cueillis plus les chances seront d’identifier les critères positifs.
    7. Une fois que tous les clones sont sélectionnés et transférés dans la plaque 96 puits, laisser les cellules à se développer pendant plusieurs jours dans un milieu sélectif F - 12K de Ham (Kaighn) additionné avec 10 % FBS, 2 mM de L-glutamine, pénicilline (0,5 unités par mL de milieu), streptomycine (0,2 µg / mL du milieu) et contenant la néomycine à une concentration de 0,7 µg/mL à 37 ° C et 5 % de CO2, jusqu’au confluent de 90 %.
  5. Fractionnement des clones
    1. Préparer trois plaques bien 96 enduits avec de la gélatine en ajoutant 100 µL de gélatine / puits, incuber 30 min à température ambiante, puis laver deux fois avec du PBS. Ces plaques serviront pour l’extraction d’ADN (plaque d’ADN) et clone gel (gel plaques).
      NOTE : Gélatine favorisera l’attachement des cellules et de l’ADN dans les puits. En particulier, l’enduit de gélatine permettra à l’ADN de coller au fond des puits lors de l’extraction de l’ADN et laver les procédures (voir ci-dessous). Pendant la procédure de fractionnement du clone, il est conseillé d’utiliser une pipette multicanaux.
    2. Une fois que les clones atteignent 90 % confluence, aspirer le milieu de chaque puits de la plaque 96 puits, laver avec du PBS, ajouter 30 µL de 0,25 % de trypsine / puits et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
      NOTE : Clones grandiront à des rythmes différents, qui dépendront aussi du nombre de cellules cueillies par clone. Ainsi, cette étape se fera au cours des plusieurs jours quand les différents clones atteignent 90 % confluence.
    3. Ajouter 70 µL de milieu sélectif par puits, perturber des amas de cellules en pipettant également monter et descendre dans les puits, puis transférer 30 µL de la 100 µL dans la plaque ADN gélatinisée préremplie avec 120 µL de milieu sélectif par bien et 30 µL à l’esprit de préremplie plaques gel gélatinisé h 50 µL de milieu (sans sélection).
    4. Placer la plaque de l’ADN dans l’incubateur et laisser les cellules à se développer à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu’au confluent de 90 %.
    5. Ajouter 80 µL de glacée fraîchement préparés 2 x gel moyen (80 % FBS et 20 % le diméthylsulfoxyde (DMSO)) dans chaque puits de la plaque de gel, ajouter parafilm (pulvérisé avec l’éthanol à 70 %) sur le dessus de la plaque de manière à sceller chaque puits, placez le couvercle sur le dessus et envelopper la plaque avec du papier aluminium. Placer les plaques de congélation à-80 ° C.
    6. Ajouter 90 µL de milieu sélectif / puits de la plaque 96 puits d’origine contenant les clones qui ont été divisés et gardez-le en culture jusqu’au PCR résultats de dépistage. Cette plaque servira de plaque de sauvegarde.

2. dépistage des Clones résistants néomycine

  1. Extraction de l’ADN de la plaque d’ADN bien 96.
    1. Une fois que les clones cultivés dans la plaque de l’ADN atteint 90 % confluence, laver 2 fois avec du PBS, puis lyse avec 50 µL de tampon de lyse (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, SDS de 0,5 % et de protéinase K 1 mg/mL). Couvrir la plaque avec du parafilm, chaque puits, mettez le couvercle d’étanchéité sur, recouvrir d’une pellicule saran et placer une nuit à 37 ° C.
    2. Ajouter 100 µL d’éthanol froid (Et-OH) / solution de NaCl (0,75 M de NaCl dans 100 % d’éthanol) pour chaque bien et précipiter pendant 6 heures ou toute la nuit à température ambiante.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
    3. Enlever la solution de NaCl-OH/Et en inversant la plaque et laver 3 fois avec 200 µL d’éthanol à 70 % par puits.
    4. Ajouter 25 µL de solution de RNAse A dans l’eau distillée et incuber à 37 ° C pendant 1 h.
  2. Utiliser 3 µL de l’ADN génomique pour l’amplification par PCR. Effectuer le dépistage de la PCR des clones sélectionnés à l’aide d’amorces recuit au sein du gène de résistance de néomycine et subtélomère 15 q. L’amplification par PCR est réalisée à l’aide d’enzymes polymérase standard et de protocoles PCR21.
    Remarque : Des conditions d’amplification pour amorces MS2 (MS2-subtel15q-primer-S et MS2 amorce comme) et amorces CTR (CTR prime S et apprêt CTR comme) sont les suivants : 98 ° C pendant 20 s comme étape de dénaturation et ensuite 34 cycles à 98 ° C 10 s, 58° C, 20 s, 72 ° C 15 s , à l’aide d’enzyme polymérase dans un 25 µL réaction mélanger (voir Table des matières). Séquences d’amorces sont indiqués dans le tableau 1.
  3. Exécuter des réactions de PCR sur gel d’agarose et extraire les bandes PCR obtenus à partir des clones positifs à l’aide de procédés d’extraction gel standard (voir Tableau des matériaux réactifs d’extraction de gel).
  4. Effectuer des analyses de séquençage de l’ADN du produit PCR extraites à l’aide de gel pour la confirmation de la présence des séquences MS221.
    Remarque : Les analyses de séquence peuvent être effectuées en utilisant les amorces utilisées pour le dépistage de la PCR.
  5. Dépistage de la tache méridionale clones positifs PCR
    1. Cultiver les clones positifs à la PCR et le séquençage dépistage de la plaque de 96 puits original (la plaque de sauvegarde) à 6 plats dans Ham F - 12K (Kaighn) additionné avec 10 % FBS, 2 mM de L-glutamine, pénicilline (0,5 unités par mL de milieu), streptomycine (0,2 µg / mL de milieu) et contenant la néomycine à une concentration de 0,7 µg/mL à 37 ° C 5 % CO2.
      Remarque : Par ailleurs, si certaines de ces clones ont été perdues, décongeler parmi les plaques de gel (voir protocole 2.6).
    2. Une fois que les clones sont à 90 % confluent dans la plaque 6 puits, laver les cellules avec du PBS et ajouter 250 µL de tampon de lyse contenant 0,5 µg protéinase K / puits.
    3. Grattez les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules et transférer le lysat dans un tube de 1,5 mL.
    4. Incuber à 37 ° C pendant 16 h.
    5. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 %, agiter vigoureusement et laisser l’ADN précipité au moins 2 h ou jusqu’au lendemain à-20 ° C.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
    6. Filer à 13 400 g à 4 ° C pendant 10 min, jeter le liquide surnageant et laver les boulettes avec l’éthanol à 70 %. Laissez l’air pellets sécher à température ambiante. Vous pouvez également utiliser une pompe à vide.
    7. Remettre en suspension les boulettes d’ADN dans 50 µL d’eau distillée contenant la RNAse A et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    8. Digérer les 5-10 µg d’ADN génomique à l’aide d’enzymes de restriction NCOL et BamHI (deux digestions indépendantes) en volume de réaction 100 µL en incubant les réactions de digestion à 37 ° C pendant la nuit.
    9. Exécuter 4 µL de la digestion sur gel d’agarose (0.8 % d’agarose) pour confirmation de la digestion complète.
    10. Ajouter 1/10 volume de sodium acétate 3M solution pH 5,2 et 2 volumes d’éthanol à 100 % pour les réactions de digestion de restriction et incuber pendant au moins 2 heures ou toute la nuit à-20 ° C à précipiter l’ADN.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
    11. Centrifuger à 13 400 g à 4 ° C pendant 20 min, jeter le surnageant et laver les boulettes avec l’éthanol à 70 %. Laisser les boulettes à l’air sec à température ambiante. Vous pouvez également utiliser une pompe à vide.
    12. Remettre les boulettes dans 20 µL d’eau distillée et charger l’ADN digéré sur un gel d’agarose 0,8 %.
      Remarque : Pour une meilleure résolution de l’ADN digéré, préparer un gel au moins 15 cm de long et exécuter toute la nuit à basse tension (v ̴30). L’électrophorèse mis en place doit être optimisé.
    13. Le lendemain, souillez le gel avec un ADN étiquetage, comme le bromure d’éthidium à concentration finale de 1 µL/10 mL, pendant 30 min à température ambiante et prendre une photo avec une règle proche du gel sur un gel d’imagerie instrument.
    14. Définir le transfert d’ADN d’une membrane de nylon et effectuer le membrane hybridation avec une sonde de séquences spécifiques de MS2 à l’aide de procédures standard21.
    15. Décongeler les clones qui sont positifs à la PCR, ADN, séquençage et Southern blot de l’une des deux plaques gel (voir étape suivante).
  6. Dégel des clones
    1. Préparer un tube de 15 mL contenant 5 mL de préchauffé Ham F - 12 K moyen (de Kaighn) additionné de 10 % FBS, 2 mM de L-glutamine, pénicilline (0,5 unités par mL de milieu) et la streptomycine (0,2 µg / mL de milieu) pour chaque clone à décongeler.
    2. Enlevez une des plaques congélation de-80 ° et ajouter 100 µL de milieu complet de pré chauffé F12K dans la cupule contenant le clone positif à décongeler.
      Remarque : Cette procédure doit être effectuée rapidement et la plaque 96 puits devrait être placés sur glace sèche après que chaque clone est décongelée, afin de permettre les autres clones à restent gelés. Cela est particulièrement important si plusieurs clones doivent être décongelés dans la même assiette bien 96.
    3. Les cellules de transfert dans le tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu et centrifuger à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.
    4. Aspirez le milieu, remettre en suspension les cellules de 500 µL de milieu de F12K complet pré chauffé et transférer chaque clone à un seul puits d’une plaque bien 12.
  7. Élimination du gène de résistance à la néomycine de la cassette de MS2 intégré à subtélomère 15 q.
    1. Laissez les clones passera d’une plaque bien 12 à un plat de 10 cm au milieu de F12K complet.
      Remarque : Néomycine ne devrait pas être inclus dans le milieu sauf indication contraire.
    2. Ajouter l’adénovirus exprimant le Cre aux cellules cultivées dans un plat de 10 cm à 70 % confluence dans 10 mL de milieu de F12K complet.
      NOTE : À l’aide d’un adénovirus exprimant sa Cre-GFP permettra l’évaluation de l’efficacité de l’infection, qui devrait avoisiner les 100 %. L’adénovirus de réplication défectueux seront perdus après quelques passages dans la culture.
    3. 48 heures après l’infection, fractionner les cellules dans les trois plats de 10 cm. Deux plats seront utilisés pour la vérification de la suppression de gène de néomycine par sélection négative, les cellules de néomycine contenant de plus en plus moyen (premier plat) et par Southern blot (second plat).
    4. Culture le troisième plat contenant le clone pour la congélation de cellules et d’extraction de l’ARN.

3. vérification d’Expression de transcription de TERRA-MS2 par RT-qPCR

  1. Après vérification du retrait de gène de néomycine, effectuer l’extraction d’ARN totale de clones de TERRA-MS2 à l’aide de solvants organiques (solution isothiocynats de phénol et de guanidine)21.
    1. Remettre en suspension l’ARN extrait d’un plat de 10 cm dans 100 µL d’eau de diéthyl pyrocarbonate (DEPC).
    2. Exécuter 3 µL d’ARN sur un gel de dénaturation (1 % contenant du formaldéhyde) 1 x 3-(N-Morpholino) le produit acide (MOPS) afin de vérifier la concentration et l’intégrité de l’ARN. Analyse également la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
    3. Traiter 3 µg d’ARN à la DNAse I à l’aide de 1 unité de DNAse I enzyme dans réactionnel final de 60 µL.
    4. Incubez la réaction pendant 1 h à 37 ° C.
  2. Inverser les analyses de réaction et de qPCR transcription
    1. Ajoutez les composants suivants dans un tube de microcentrifuge exempte de nucléase : 2 µL d’une amorce spécifique de 1 µM TERRA, 1 µL du mélange dNTPs (10 mM), 6 µL de DNAse j’ai imprégnées d’ARN (correspondant à l’ARN ̴300ng). Réglez le volume à 13 µL avec 4 µL d’eau DEPC.
      Remarque : Pour chaque ARN pour être analysés, un deuxième tube contenant les mêmes réactifs mais une amorce spécifique de référence, au lieu des amorces spécifiques de TERRA, doit être préparé.
    2. Porter le mélange à 65 ° C pendant 5 min et laisser incuber dans la glace pendant au moins 1 minute.
    3. Recueillir le contenu des tubes de centrifugation courte et ajouter 4 µL d’enzyme 5 X RT tampon, 1 µL 0,1 M le dithiothréitol (DTT), de 1 µL (4 unités) de l’inhibiteur de RNAse et 1 µL de la transcriptase inverse (voir Table des matières).
    4. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 60 min, puis utilisez 2 µL de la réaction de RT pour les analyses de qPCR.
  3. Préparer le mélange réactionnel de qPCR dans un volume final de 20 µL composé de 10 µL du mélange principal de 2 x qPCR, 2 µL de matrice d’ADNc, 1 µL d’apprêt avant (10 µM), 1 µL d’apprêt inverse (10 µM) et 6 µL d’eau.
  4. Effectuer la réaction de qPCR dans un thermocycleur à l’aide de protocoles standard21.

4. production d’un rétrovirus exprimant de MS2-GFP

  1. Pour générer des rétrovirus exprimant MS2-GFP, transfecter 80 % phoenix confluentes emballage des cellules avec une protéine de fusion de GFP-MS2 exprimant des rétrovirus vecteur (pBabe-MS2-GFP PURO) et un gène env exprimant vecteur (par exemple le cmvp-VSVG) à l’aide d’un rapport molaire de 1:4 les deux vecteurs.
  2. Le jour suivant, remplacez frais moyen butyrate de sodium 10mM contenant le milieu de culture (DMEM supplémenté de 10 % de BF, 2 mM de L-glutamine et Pen/Strep).
  3. Incuber pendant 8 h à 37 ° C, 5 % de CO2, puis remplacez le milieu par milieu de culture frais d'où le virus sera obtenue.
  4. Après 48 h, enlever le milieu contenant du rétrovirus provenant des cellules de phoenix. Ce milieu peut être utilisé directement pour l’infection de clones de TERRA-MS2, auquel cas le support de filtration à travers un filtre de 0,45 µm, ajouter polybrene (concentration finale de 30 µg/mL) et l’ajouter aux cellules (dans ce cas le protocole continue à l’étape 5). Par ailleurs, rétrovirus peut être précipité dans un tube falcon de 50 mL en ajoutant 1/5ème volume de 50 % PEG-8000/900 mM NaCl solution et en incubant pendant la nuit à 4 ° C sur une roue de rotator.
  5. Le lendemain, particules rétrovirus culot de centrifugation à 2 000 x g pendant 30 min, retirez le surnageant et resuspendre le culot dans un milieu sans sérum F12K.
    Remarque : Les particules de virus peuvent être remis en suspension dans 1/100ème du surnageant volume original. Un test de l’infection doit être effectué afin de vérifier le volume minimal de rétrovirus pour infecter efficacement les cellules.

5. visualisation de TERRA-MS2 transcrits dans les cellules vivantes

  1. Plaque de clones de TERRA-MS2 et cellules WT AGS dans les plats à fond de verre. Le jour de l’infection, ajoute polybrene au milieu (concentration finale de 30 µg/mL) et le rétrovirus exprimant MS2-GFP.
  2. Après 24 heures, jeter le support contenant le virus et ajouter un milieu frais sans rouge de phénol.
  3. Analyser les cellules au microscope inversé en utilisant le réglage approprié de microscope. Image de cellules avec un 100 X ou 60 X, objectif à grande ouverture numérique (1. 4 X) et à l’aide d’une caméra sensible (EMCCD). Utiliser un système de contrôle de l’environnement pour maintenir les échantillons à 37 ° C et 5 % de CO2 en imagerie.

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Résultats

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Figure 1 représente une vue d’ensemble de la stratégie expérimentale. Les principales étapes du protocole et un calendrier indicatif pour la génération de TERRA-MS2 clones dans les cellules AGS apparaissent (Figure 1A). Au jour 1, plusieurs puits d’une plaque 6 puits sont transfectées avec la cassette de MS2 et sgRNA/Cas9 exprimant des vecteurs (illustrés à la Figure 1<...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article, nous présentons une méthode pour générer des clones de cellules cancéreuses humaines contenant des séquences de MS2 intégrées au sein de subtélomère 15 q. À l’aide de ces clones, les molécules TERRA MS2-tag transcrits à partir de la subtélomère 15 q sont détectés par microscopie de fluorescence par co-expression d’une protéine de fusion de GFP-MS2. Cette approche permet aux chercheurs d’étudier la dynamique de TERRA exprimée à partir d’un seul télomère vie cellules21. Dans ce pro...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants envers le personnel de l’installation d’imagerie avancée de CIBIO à l’Université de Trento et le BioOptics Light Microscopy facility à laboratoires de Perutz pour le F. Max (MFPL) à Vienne. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de la Stiftung Mahlke-Obermann et septième Programme-cadre pour la recherche, de développement technologique et de démonstration de l’Union européenne en vertu de la convention de subvention sans 609431 à EC. EC est soutenu par une bourse de Rita Levi Montalcini du ministère italien de l’enseignement universitaire et la recherche (MIUR).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules AGS--Donde Christian Baron (Université ; de Montré ; al).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Milieu de culture pour cellules AGS
L-Glutamine  ;CORNINGMT25005CIComposant d’un milieu de culture cellulaire
Pénicilline StreptomycineSolution CORNING30-002-CIComposant d’un milieu de culture
cellulaire Sérum fœtal bovinSigma AldrichF2442Composant d’un milieu de culture cellulaire
DMEM 1XGIBCO21068028milieu de culture pour cellule de phénix
CaCl2Sigma AldrichC1016utilisé dans la transfection de cellules de phénix
HEPESSigma AldrichH3375utilisé dans la transfection de cellules de phénix (solution HBS)
KClSigma AldrichP9333utilisé dans la transfection de cellules de phénix (solution HBS)
DextroseSigma AldrichD9434utilisé dans la transfection de cellules de phénix (solution HBS)
NaClSigma AldrichS7653utilisé dans la transfection de cellules de phénix (solution HBS) et la précipitation de rétrovirus
Na2HPO4Sigma AldrichS3264utilisé dans la transfection de cellules de phénix (solution HBS)
TRYPSINE EDTA SOLUTION 1XCORNING59430Cutilisé dans la division cellulaire
DPBS 1XGIBCO14190250Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
DMSOSigma AldrichD8418Composant du milieu de congélation cellulaire (80 % FBB et 20 % DMSO)
G-418 DisulfatéFormediumG4185médicament de sélection pour  ;
Solution de gélatine BioréactifSigma AldrichG1393Codage de la plaque d’ADN à 96 puits et de la plaque de congélation
Tris-baseFisher BioReagents10376743Composant du tampon de lyse cellulaire pour l’extraction de l’ADN génomique
EDTASigma AldrichE6758Composant du tampon de lyse cellulaire pour l’extraction de l’ADN génomique
SDSSigma Aldrich71729Composant du tampon de lyse cellulaire pour l’extraction de l’ADN génomique
Protéinase KThermo FisherAM2546Composant du tampon de lyse cellulaire pour l’extraction de l’ADN génomique
ARNASE AThermo Fisher12091021la dégradation de l’ARN pendant l’extraction de l’ADN
AgaroseSigma AldrichA5304Préparation de gel d’ADN
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Réactif de coloration utilisé pour détecter des échantillons d’ADN et d’ARN dans l’éthanol de gel d’agarose
BioReagentsBP28184précipitation de l’ADN
Acétate de sodiumSigma Aldrich71196Utilisé pour la précipitation de l’ADN à une concentration de 3M pH5.2
Wizard SV Système de nettoyage par gel et PCRPromegaA9282Extraction de fragments de PCR à partir d’un gel d’agarose lors du criblage par PCR de clones positifs à la néomycine
TrizolAMBION15596018Solvant organique utilisé pour l’extraction de l’ARN
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836dégradation de l’ADN génomique de l’ARN  ;
Mélange dNTPInvitrogen10297018utilisé dans les réactions RT et PCR
DTTInvitrogen707265MLutilisé dans les réactions RT
Pyrocarbonate de diéthyleSigma AldrichD5758utilisé pour inactiver les ARN dans l’eau (dilution 1:1000)
RibolockThermo FisherEO0381Inhibiteur de RNase
MOPSSigma AldrichM9381préparation du gel d’ARN
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15710préparation du gel d’ARN dénaturant (1 % de PFA dans 1x MOPS)
Exposant III Transcriptase inverseInvitrogen18080-093Réaction de rétrotranscription
Pfu ADN polymérase (recombinante)Thermo ScientificEP0501Réaction PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14Réaction qPCR
Adénovirus Cre-GFPhttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTutilisé pour infecter les clones de TERRA-MS2 afin d’éliminer le gène néomycn
Butyrate de sodiumSigma AldrichB5887utilisé pour favoriser la production de particules de rétrovirus dans les cellules de phénix
PEG8000Sigma Aldrich89510Précipitation des parties rétrovirales
Fond en verre 35 & micro ;Ibidi81158utilisé dans les analyses d’imagerie de cellules vivantes de clones TERRA-MS2
Fisher

Références

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