Article de méthode

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

DOI :

10.3791/58820

⸱

31 janvier 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole afin de caractériser les particules nucleosome à l’échelle de la molécule unique à l’aide de la microscopie à force atomique statiques et time-lapse (AFM) techniques d’imagerie. La méthode de la fonctionnalisation de surface décrite permet la capture de la structure et la dynamique des nucléosomes dans haute résolution à l’échelle nanométrique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chromatine, qui est une longue chaîne de sous-unités nucléosome, est un système dynamique qui permet à ces procédés critiques comme la réplication de l’ADN et la transcription de prendre place dans les cellules eucaryotes. La dynamique des nucléosomes fournit l’accès à l’ADN par les mécanismes de réplication et de transcription et critique contribue aux mécanismes moléculaires qui sous-tendent les fonctions de la chromatine. Études de la molécule unique comme la microscopie à force atomique (AFM) d’imagerie ont largement contribué à notre compréhension actuelle du rôle de la structure du nucléosome et dynamique. Le protocole actuel décrit les étapes permettant aux techniques d’imagerie à haute résolution de AFM étudier les propriétés structurales et dynamiques des nucléosomes. Le protocole est illustré par les données d’AFM obtenues pour les nucleosomes centromère dans lequel histone H3 est remplacé par sa protéine homologue de centromère A (CENP-A). Le protocole commence par l’Assemblée des mono-nucléosomes en utilisant une méthode de dilution continue. La préparation du substrat mica fonctionnalisé avec aminopropyl silatrane (APS-mica) qui est utilisé pour l’imagerie du nucléosome est cruciale pour la visualisation de l’AFM des nucléosomes décrit et la procédure pour préparer le substrat est fournie. Nucléosomes déposés sur la surface APS-mica sont imagés tout d’abord à l’aide de AFM statique, qui capture un instantané de la population du nucléosome. L’analyse de ces images, on peuvent mesurer des paramètres tels que la taille de l’ADN enroulé autour des nucléosomes et ce processus est également détaillé. Le time-lapse AFM d’imagerie de procédure dans le liquide est décrite pour l’AFM de time-lapse à grande vitesse qui peut prendre plusieurs images de la dynamique des nucléosomes par seconde. Enfin, l’analyse de la dynamique de nucléosomes permettant la caractérisation quantitative des processus dynamiques est décrit et illustré.

Introduction

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Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est très condensé et organisée dans des chromosomes. 1 le premier niveau d’organisation de l’ADN au sein d’un chromosome est l’Assemblée des nucléosomes dans laquelle 147 bp d’ADN est étroitement enroulé autour d’un noyau d’octamère d’histones. 2 , 3 particules nucleosome assemblent sur une longue molécule d’ADN formant un tableau de la chromatine qui est ensuite organisé jusqu'à forme une unité très compacte du chromosome. 4 le démontage de la chromatine offre l’accès gratuit à l’ADN requis par les processus cellulaires essentielles telles que la réplication du génome et de transcription de gène, ce qui suggère que la chromatine est un système hautement dynamique. 5 , 6 , 7 comprendre les propriétés dynamiques de l’ADN à différents niveaux de la chromatine est crucial pour élucider les processus génétiques à l’échelle moléculaire, où les erreurs peuvent conduire à la mort cellulaire ou l’apparition de maladies comme le cancer. 8 une propriété de la chromatine de grande importance est la dynamique des nucléosomes. 9 , 10 , 11 , 12 la grande stabilité de ces particules a permis la caractérisation structurale de techniques cristallographiques. 2 ces quel manque d’études sont déballer les détails dynamiques des nucléosomes tels que le mécanisme de l’ADN du noyau histones ; la voie dynamique qui est requise pour le processus de transcription et de réplication. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 en outre, des protéines spéciales appelées facteurs de remodelage auraient dû être divulgués afin de faciliter le démontage de particules nucléosomique17; Toutefois, la dynamique intrinsèque des nucléosomes est le facteur déterminant dans ce processus qui contribue au processus de démontage complet. 14 , 16 , 18 , 19

Techniques de molécules simples comme single-molecule fluorescence19,20,21, piégeage optique (pincettes)13,18,22,23 et AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 ont grandement contribué à la compréhension de la dynamique des nucléosomes. Parmi ces méthodes, AFM bénéficie de plusieurs caractéristiques uniques et attrayantes. AFM permet de visualiser et de caractériser les nucléosomes individuels, mais aussi la plus longue de tableaux27. Des images de l’AFM, des caractéristiques importantes de structure nucléosomique tels que la longueur de l’ADN enroulé autour du noyau de l’histone peuvent être mesuré 10,14,26,28; un paramètre qui est au cœur de la caractérisation de la dynamique unwrapping nucléosome. Passé AFM études ont révélé des nucléosomes systèmes hautement dynamiques et que l’ADN peut spontanément déballer de l’histone base14. Le déballage spontanée de l’ADN de nucléosomes a été visualisée directement par AFM fonctionnant dans le mode Time-lapse quand l’imagerie est fait dans des solutions aqueuses 14,26,29.

L’avènement de l’instrumentation d’AFM (HS-AFM) time-lapse à grande vitesse a permis de visualiser le processus de déroulement nucleosome à la milliseconde chronologique 14,15,24. HS-AFM 16,30 des études récentes des nucléosomes spécifiques centromère a révélé plusieurs nouvelles caractéristiques des nucléosomes comparées au type canonique. Nucléosomes centromère constituent d’un centromère, une petite partie du chromosome très importante pour le chromosome ségrégation31. À la différence des nucléosomes canoniques dans la chromatine en vrac, le noyau histones des nucléosomes centromère contient histone CENP-A au lieu de l’histone H332,,33. À la suite de cette substitution d’histone, habillage de l’ADN dans les nucléosomes centromère est ~ 120 bp au lieu de la 147 ~ bp pour nucléosomes canoniques ; une différence qui peut conduire à des morphologies distinctes des centromères et des nucléosomes canoniques tableaux34, ce qui suggère que la chromatine centromère subit une dynamique plus élevée par rapport à la plus grande partie un. La nouvelle dynamique affichée par nucléosomes centromère dans les études de30 16,HS-AFM exemplifient l’occasion unique fournie par cette technique de molécules simples de visualiser directement les propriétés structurales et dynamiques de nucléosomes. Exemples de ces fonctionnalités seront brièvement examinés et commentés à la fin du livre. Ce progrès ont été réalisés grâce au développement de nouveaux protocoles d’imagerie AFM des nucléosomes ainsi que les modifications des méthodes existantes. Le protocole décrit ici vise à rendre accessible à tous ceux qui voudraient utiliser ces techniques dans leurs enquêtes de chromatine ces avances excitantes études de molécules simples AFM nucléosome. Plusieurs des techniques décrites sont appliquent aux problèmes au-delà de l’étude des nucléosomes et peuvent être utilisés pour les enquêtes sur les autres systèmes d’ADN d’intérêt et de protéine. Quelques exemples de ces applications se trouvent dans les publications35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 et les perspectives d’études AFM divers systèmes biomoléculaires sont indiquées dans l’examen des29,50,51,53,54.

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Protocole

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1. Dilution continu Assemblée des Mono-nucléosomes

  1. Produire et purifier un substrat d’ADN bp environ 400 qui contient un nucléosome Widom 601 décentré séquence de positionnement. 55
    Remarque : Pour limiter la formation non désirée des di-nucléosomes, chaque « bras » flanquant la séquence de positionnement ne doit pas dépasser 150 ~ bp.
    1. Utilisez le plasmide pGEM3Z-601 avec les amorces et amplifier l’ADN de substrat à l’aide de la PCR. Pour le substrat de bp 423 avec 122 et 154 longueur des bras bp utilisé ici, utiliser avant (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') et inverse (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') des amorces.
    2. Ajouter les tubes contenant le mélange réactionnel à un thermocycleur préchauffé à 95 ° C. Exécutez le programme suivant pour 33 cycles après une dénaturation initiale pendant 5 min à 95 ° C: 30 s dénaturation à 95 ° C, 30 s recuit à 49 ° C, 35 extension s à 72 ° C. Définir une extension finale à 72 ° C pendant 10 min après les cycles de 33.
    3. Purifier l’ADN issu du mélange PCR à l’aide d’un Kit de Purification PCR disponibles dans le commerce. Quand à élution de l’ADN de la colonne de nettoyage PCR, utilisez un tampon Tris 10 mM (pH 7.5) en lieu et place du kit fourni tampon d’élution.
      Remarque : Faire attention à ne pas de transférer des tampons entre les étapes de purification. Un éluant contaminé peut provoquer des problèmes en aval quand mesurer la concentration d’ADN et/ou peuvent modifier la concentration de sel départ du mélange Assemblée nucléosome.
  2. Déterminer la concentration d’ADN en mesurant l’absorbance de l’ADN purifié à 260 nm.
    1. Recueillir un blanc sur le spectrophotomètre UV VIS en utilisant seulement le 10 mM Tris pH 7,5 tampon d’élution. Recueillir une mesure de l’ADN purifié.
  3. Avec la concentration déterminée, aliquote 25 pmol d’ADN purifié dans un tube à centrifuger 0,6 mL et placez-le dans une centrifugeuse sous vide jusqu'à ce que la solution est à peine visible ; Il s’agit généralement de 30 min à 1 h.
    Remarque : Le substrat de l’ADN est maintenant prêt pour l’assemblage du nucléosome. Par ailleurs, le protocole peut être suspendu ici et l’ADN conservées à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
  4. Placer le tube à centrifuger contenant les 25 pmol ADN sur la glace et ajouter les composants d’assemblage de nucléosomes dans le tableau 1, dans l’ordre indiqué. Lorsque tous les composants ont été ajoutés, enlever le mélange sur la glace et laisser incuber à température ambiante (RT) pendant 30 min.
    Remarque : Il est essentiel que la teneur en sel du tampon histone stock est considérée quand calculer le NaCl nécessaires pour atteindre la concentration finale de 2 M. 15 , 56
  5. Assembler les nucleosomes en réduisant la concentration de sel de 2 M du mélange à 200 mM en utilisant une dilution taux continu. 57
    1. Remplir une seringue de 100 µL de tampon de dilution contenant 10 mM Tris pH 7,5 et placez-le sur un pousse-seringue.
    2. Direct l’aiguille de la seringue dans un trou préalablement percé le bouchon du tube microtubes, assurant le contact est fait avec le mélange de l’Assemblée (Figure 1).
    3. Faire fonctionner la pompe de seringue à un taux de 0,75 µL/min pendant 120 min.
      Remarque : La résultante 100 µL de solution contient 250 nucléosomes nM et 200 mM NaCl.
    4. Transvaser le mélange dans un bouton de dialyse MWCO 10 K et de dialyser contre 200 mL de tampon sel faible avance de frais (4 ° C) contenant 10 mM Tris pH 7,5, EDTA de 0,25 mM et 2,5 mM NaCl, pendant 1 h à 4 ° C.
  6. Pour évaluer le contenu de l’histone de l’Assemblée du nucléosome, préparer un gel SDS-PAGE discontinu avec un 15 % séparant et 6 % empilement comme décrit précédemment30.
    1. Aliquote 10-20 µL du nucléosome stock à un tube à centrifuger et ajouter 4 x tampon de Laemmli l’échantillon à une concentration de travail de 1-2 x. 58
    2. Comme un contrôle, répétez cette préparation dans un tube à centrifuger distinct pour 1 à 2 µg du stock histone. Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant ~ 5 min.
    3. Charger les échantillons dans des ruelles adjacentes à un autre sur le gel. Ajouter tampon vers les voies non utilisées pour promouvoir la migration de la même bande.
    4. Exécutez le gel à 65 V jusqu'à ce que le front de colorant se déplace à travers le gel de concentration. Lorsque le gel de séparation est atteinte, passer à 150 V et exécuter jusqu'à ce que le front de colorant a migré totalement hors gel.
    5. Démonter l’appareil d’électrophorèse et transférer doucement le gel à un coloration réservoir rempli de dd H2O. Laisser le gel pendant 5 min avec agitation douce. Répétez cette procédure deux fois plus avec frais dd H2O utilisé chaque fois.
      Remarque : La tache de bleu de Coomassie utilisée dans le présent protocole ne requiert pas les étapes typiques de fixation nécessaires pour les taches de Coomassie (voir Table des matières). Si on utilise une autre préparation de bleu de Coomassie, ajustez les étapes de fixation au besoin.
    6. Retirez l’eau du rinçage final et ajoutez juste assez tache pour couvrir le gel. Laisser le gel avec une agitation modérée pendant au moins 1 h.
      Remarque : Pour l’agitation, le conteneur de coloration peut être placé sur n’importe quel appareil qui favorise le mouvement de la tache sur le gel tout en gardant aussi le gel couvert dans un liquide.
    7. Retirez la tache et rincez le gel avec dd H2O. remplacer le dd H2O et tremper le gel pendant 30 min avec agitation douce. (Le gel devrait apparaître comme ça montre la Figure 2, avec une séparation nette entre les bandes d’histones).
  7. Conserver les nucleosomes à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
    Remarque : S’il est conservé dans ces conditions, nucléosomes restent stables pendant plusieurs mois. Le protocole peut être suspendu ici.

2. la fonctionnalisation de Surface de Mica pour l’imagerie statique AFM de nucléosomes

  1. Préparer une solution mère 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS dans l’eau désionisée comme décrit. 30 magasin 1 ml de cette solution à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
    Remarque : Les aliquotes peuvent être conservées pendant plus d’un an à 4 ° C. 59
  2. Préparer une solution 1 : 300 APS pour modification de mica en dissolvant 50 µL du stock 50 mM APS dans 15 mL dd H2O.
    Remarque : Cette solution de travail peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs jours.
  3. Couper des bandes de 1 x 3 cm de mica de feuilles de mica de haute qualité (voir Table des matières pour mica utilisée ici).
    1. Vérifiez que la pièce s’accorde lorsqu’il est placé en diagonale dans une cuvette. Utiliser la pointe de la pince à épiler pointu, une lame de rasoir ou ruban scotch, en conjonction avec les couches du mica jusqu'à ce que les deux côtés sont fraîchement clivées et la pièce est aussi mince que ~0.1 mm (Figure 3 a). Immédiatement, placez le morceau de mica dans la cupule APS rempli et incuber pendant 30 minutes (Figure 3 b).
  4. Transférer le morceau de mica dans une cuvette remplie de dd H2O et laisser tremper pendant 30 s (Figure 3). Sécher complètement les deux côtés de la bande de APS-mica sous un flux d’argon.
    Remarque : Un non-tissé cellulose et polyester salle blanche (une lingette recommandée détaillées dans les matériaux) peuvent servir à l’aide en évacuant l’eau du bord du mica lors du séchage.
  5. Utilisation de la bande de mica sec est maintenant pour la préparation de l’échantillon. Dans le cas contraire, conserver le morceau dans une cuvette propre et sec (Figure 3D).
    Remarque : Le stockage supplémentaire dans le vide pendant 1-2 h est recommandé lorsque l’environnement est humide. Le protocole peut être suspendu ici.

3. préparation des échantillons de nucléosomes sur APS-Mica pour l’imagerie statique AFM

  1. Appliquer le ruban adhésif double-face à plusieurs rondelles magnétiques et les placer sur le côté.
  2. Couper le substrat APS-mica à la taille désirée (carrés de 1 x 1 cm pour l’AFM MM instrument utilisé ici). Placer ces morceaux dans un plat de pétri propre et rester couvert.
  3. Préparer trois dilutions de l’assemblé nucléosomes (nucléosome final des concentrations de 0,5, 1,0 et 2,0 nM) à l’aide d’un 0,22 µm filtré tampon contenant 10 mM HEPES pH 7,5 et 4 mM MgCl2.
    Remarque : Pour limiter la perte des nucléosomes à la faible concentration finale, les dilutions devraient se faire un à la fois, immédiatement avant le dépôt sur l’APS-mica.
  4. Déposer 5 à 10 µL de l’échantillon dilué nucléosome au centre de la pièce de APS-mica et laisser incuber pendant deux minutes. Rincer doucement l’échantillon avec 2-3 mL de dd H2O pour supprimer tous les composants de la mémoire tampon. Après chaque mL ~0.5 dd H2O utilisé, agiter doucement le mica pour enlever l’eau excédentaire.
    Remarque : Une seringue jetable est recommandée pour cette étape de rinçage.
  5. Sécher l’échantillon déposé sous un léger flux de gaz argon pur.
    Remarque : L’échantillon est maintenant prêt à être photographiée ou peut être stocké dans un vide armoire ou dessicateur rempli d’argon. Les échantillons préparés et stockés tel que décrit ont été imagées un an suivant la préparation sans perte de qualité. Le protocole peut être suspendu ici.

4. statique AFM imagerie des nucléosomes

  1. Montez sur l’embout porte une pointe d’AFM. Utiliser un embout qui a une constante de ressort de ~ 40 N/m et une fréquence de résonance entre 300 et 340 kHz (voir la Table des matières pour les leviers utilisés ici).
  2. Monter l’échantillon préparé à l’article 3 sur la scène de l’AFM en veillant à ne pas communiquer avec la surface de l’échantillon.
  3. Positionner le laser sur le levier jusqu'à ce que la somme soit au maximum et ajuster les valeurs de déviation verticale et latérale pour près de zéro.
  4. Régler la sonde AFM pour trouver sa fréquence de résonance et de régler l’amplitude de la voiture et de définir la taille de l’image à 100 x 100 nm. Cliquez sur le bouton engager pour commencer l’approche.
  5. Une fois approché, optimiser progressivement la consigne de l’Amplitude jusqu'à ce que la surface de l’échantillon est clairement visible. Augmenter la taille de numérisation à 1 x 1 µm et la résolution de 512 x 512 pixels. Cliquez sur le bouton de capture puis le bouton engager pour commencer une acquisition d’images.
    Remarque : Les images dans la Figure 4 indiquent le fond lisse qui peut s’attendre lorsque ces échantillons d’imagerie.
  6. Pour analyser l’échantillon de nucléosomes, ouvrez les images capturées à l’aide du logiciel d’analyse de l’AFM instruments.
    1. Aplatir l’image à l’aide d’une soustraction de polynômes de ligne ou une fonctionnalité similaire.
    2. Définissez la table des couleurs pour refléter la valeur la plus basse pour le minimum et la valeur la plus élevée pour maximum. Conserver un enregistrement de ces valeurs pour chaque image car ils seront nécessaires dans une étape ultérieure.
      Remarque : Si ces valeurs ne sont pas utilisées, données de hauteur est incorrectes dans l’analyse ultérieure comme sections de carottes de nucléosomes apparaîtront comme les plateaux de hauteur égale, plutôt que de variable.
    3. Exporter l’image comme une image .tiff au format original. Décochez toutes les options pour enregistrer l’image avec une bordure ou échelle des barres.
    4. Ouvrez l’image dans le logiciel d’analyse capable de mesures de longueur de contour.
    5. La valeur x, y et z des échelles pour correspondre à l’image.
    6. Une calibration en longueur intérieure, mesurer et noter la longueur contour d’ADN libre d’un bout à l’autre. Pour ce facteur d’étalonnage, utiliser les mesures pour générer un histogramme et fixez-le avec une distribution normale (gaussienne). Diviser le centre de la crête (xc) par la longueur de substrat en paires de bases.
      Remarque : Cette valeur est l’image conversion facteur spécifique de nanomètres de paires de base d’ADN.
    7. Mesurer et noter la longueur contour des deux bras pour chaque nucléosome de l’extrémité libre du bras vers le centre du noyau, par souci de cohérence (Figure 5 a).
    8. Pour chaque noyau nucleosome, recueillir deux pleine largeur à moitié les valeurs maximales de (FWHM) d’une paire perpendiculaire de base les mesures de coupe transversale (Figure 5 b moyenne des deux mesures FWHM et soustraire la moitié de la valeur résultante de chaque bras du nucléosome pour correct pour la longueur mesurée de l’ADN de sortie / d’entrée vers le centre du noyau qui ne fait pas partie de la longueur de bras.
    9. Diviser chaque dépendance par le facteur d’étalonnage calculées (étape 4.5.6) pour obtenir la longueur des bras en paires de bases d’ADN.
    10. Calculer l’étendue de l’ADN d’emballage en soustrayant de la somme de bras nucléosome de la longueur totale des paires de bases du substrat non emballé. Tracer ces valeurs sous forme d’histogramme et monter les pics avec une distribution normale (gaussienne) pour obtenir les paires de bases enveloppés moyennes d’ADN pour la population du nucléosome.
    11. Calculer la hauteur moyenne nucléosome de sections efficaces mesurées. Cela intrigue sous forme d’histogramme et ajuster le temps avec une distribution normale (gaussienne) pour obtenir la hauteur de la population du nucléosome.

5. time-lapse AFM imagerie dynamique du Nucléosome

  1. Monter l’embout de l’AFM sur l’embout porte. Une sonde avec une constante du ressort d’environ 0,1 N/m et de 7 à 10 kHz, une fréquence de résonance peut être utilisée (voir la liste des matériaux des leviers utilisés ici).
  2. Fixez un morceau de 1 x 1 cm de APS-mica à un palet magnétique à l’aide de ruban adhésif double-manche et monter la rondelle sur l’instrument de l’AFM.
  3. Diluer les nucleosomes à une concentration de 1 nM dans un tampon d’imagerie filtrée de 0,22 µm contenant 10 mM HEPES pH 7,5 et 4 mM MgCl2.
  4. Déposer 5 à 10 µL du nucléosome dilué au centre de la pièce de mica pendant 2 min. rincer l’échantillon déposé avec 20 µl du tampon d’imagerie deux fois. Après le deuxième rinçage, garder une goutelette de tampon sur la surface de l’imagerie.
  5. Utilisez la caméra vue de dessus pour trouver la pointe et l’approche de la surface manuellement jusqu'à ce que la pointe soit ~ 100-500 µm de la surface.
  6. Ajouter un tampon d’imagerie supplémentaire pour combler l’écart entre la pointe et la surface. Dans cet exemple, environ 50 µL de tampon d’imagerie est suffisante pour combler le vide. Trouver un pic de résonance pour l’astuce.
  7. Commencer l’approche informatisé à la surface. Lorsque s’est approché, commencent d’imagerie avec 1-2 µm espace pour sélectionner la zone d’intérêt ~ 500 nm. Avec ce domaine d’intérêt sélectionnés, réglez la densité d’acquisition de données à 512 x 512 pixels.
  8. Régler la tension de consigne et conduire les paramètres amplitude pour améliorer la qualité de l’image. Une amplitude gratuite de 10 nm ou moins et une vitesse de balayage de ~ 2 Hz peut être utilisé pour capturer des images de qualité. Un exemple de la dynamique de nucléosomes capturée à l’aide de time-lapse AFM est illustré à la Figure 6.

6. haute vitesse AFM time-lapse imagerie du Nucléosome dynamique

Remarque : Le protocole ci-dessous est fourni pour l’instrument de HS-AFM, développé par le groupe Ando (Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon). 60

  1. Préparer APS-mica pour l’imagerie liquide.
    1. Fixer la tige de verre au stade AFM scanner à l’aide de l’agitateur en verre - colle scanneur (voir Table des matières). Laissez cette sécher pendant au moins 10 min.
    2. Faire ~0.1 mm épaisseur pièces circulaires de mica avec un diamètre de 1,5 mm en perçant des eux d’une plus grande feuille de mica. Utiliser de la colle de tige de verre-mica HS-AFM (voir Table des matières) pour fixer ce morceau de mica à la baguette de verre sur le HS-AFM et sec, intacte pendant au moins 10 minutes. Cliver les couches à l’aide d’un ruban adhésif sensible à la pression jusqu'à ce qu’une couche bien clivée est visible sur le ruban.
    3. Diluer 1 µL de stock APS 50 mM pour 99 µL de dd H2O pour faire une solution APS 500 µM. Déposez 2,5 µL de cette solution sur la surface fraîchement clivé mica et laissez fonctionnaliser pendant 30 min.
      Remarque : Pour éviter le dessèchement de la surface tandis que fonctionnalisation, le bouchon d’un tube à centrifuger conique 50 mL peut être dotée d’une pièce humide de papier-filtre et placé sur le scanner. Le stock de l’APS est dilué 3 fois moins pour l’imagerie liquide que pour l’imagerie statique pour contrôler la dynamique à un taux qui peut être observée avec l’AFM.
    4. Rincez le mica avec 20 µL de dd H2O en appliquant plusieurs rinçages µL de ~ 3. Enlevez l’eau complètement après chaque rinçage en plaçant un chiffon non-tissé au bord du mica. Après le rinçage final, déposer sur la surface ~ 3 µL de dd H2O et laisser reposer pendant au moins 5 min pour enlever n’importe quel APS lié de façon non spécifique.
  2. Placer la sonde dans le porte-HS-AFM et positionner le support sur la scène de l’AFM avec la pointe vers le haut. Rincer le porte-aide ~ 100 µL de dd H2O suivi de rinçages deux ~ 100 µL de 0,22 µm filtré nucléosomes imagerie tampon qui contient 10 mM HEPES pH 7,5 et 4 mM MgCl2.
  3. Avec des rinçages faits, remplir la chambre ~ 100 µL de nucléosomes tampon, submergeant la pointe de l’imagerie. Ajustez la position de porte-à-faux jusqu'à ce qu’elle est frappée avec le laser. Rincez le APS-mica avec 20 µL du nucléosome filtrée d’imagerie tampon, à l’aide de ~ 4 µL par rinçage.
  4. Diluer 1 µL du stock Assemblée nucléosomes dans 250 µL du nucléosome filtrée d’imagerie tampon pour une concentration finale de nucléosomes de 1 nM. Déposez 2,5 µL de cette dilution sur la surface et laisser reposer pour 2 min. rincer la surface avec ~ 4 µL du nucléosome imagerie tampon deux fois. Après le rinçage final, laisser la surface couverte en imagerie tampon.
    Remarque : Si la surface n’est pas rincée après avoir déposé l’échantillon du nucléosome, la surface va rapidement devenir surpeuplée.
  5. Définissez le scanner et l’échantillon sur le dessus de l’embout porte afin que l’échantillon est face cachée. Pour commencer l’approche, utilisez la fonction auto-approche avec une amplitude de point de consigne, uns à proximité de l’oscillation libre amplitude A0.
    NOTE : Idéalement, uns = 0,950, cependant, fonctionne à 82 % de0 fonctionnera aussi bien si prudent.
  6. Régler le point de consigne jusqu'à ce que la surface est bien suivie.
    Remarque : Afin de minimiser le transfert d’énergie de la pointe de l’AFM à l’échantillon du nucléosome, l’amplitude du levier doit être maintenu petit, avec des amplitudes aussi bas que 1 nm optimale.
  7. Définir la zone de l’image environ 150 x 150 nm à 200 x 200 nm avec taux d’acquisition de données de ~ 300 ms par imagerie trame.
    Remarque : La taille de cette image est généralement suffisante pour saisir la dynamique des nucléosomes plusieurs simultanément. Une surface moins peuplée peut-être appeler pour faire modifier ces paramètres. La cadence a suggéré est suffisante pour saisir la dynamique des nucléosomes comme en boucle, glissant et déballer, entre autres (voir résultats représentant la section ci-dessous).

7. analyse des dynamiques de nucléosomes capturées à l’aide de time-lapse AFM

  1. Convertir les images du type de données de l’AFM HS (.asd) aux images .tiff.
    1. Aplatir les images à l’aide du logiciel d’analyse du système de l’AFM à l’aide de fonctions avion ou en ligne jusqu'à ce que le fond a contraste uniforme.
    2. Régler le contraste de l’image (échelle de couleurs) sur automatique.
      Remarque : Le contraste peut être réglé manuellement pour fins de présentation, mais pas pour l’analyse. Cela provoque des détails de hauteur pour se perdre dans les images à convertis.
    3. Enregistrer la plage sélectionnée d’images dans un fichier .mov. Décochez la barre d’échelle et options avant d’enregistrer à la frontière.
      NOTES : Ne fais pas d’analyse sur les images qui ont des barreaux de l’échelle dans le cadre. Ceux-ci modifient la taille de l’image et seront traduira par fausses mesures.
    4. Convertir le fichier .mov en images tiff à l’aide d’un logiciel approprié (voir la Table des matières). Utilisez la même cadence pour la conversion que celui utilisé lors de la création du fichier .mov.
  2. Pour mesures contour de longueur de bras, ouvrez les images dans un logiciel de mesure capable de cette mesure (voir Table des matières).
    1. Définissez les dimensions de l’image pour correspondre à ceux à qui il a été capturé.
    2. Mesurer la longueur contour de chaque bras du nucléosome de l’extrémité du bras vers le centre du noyau nucleosome et enregistrer les mesures dans une feuille de calcul (Figure 4 a).
    3. Mesurer la longueur du substrat ADN déballé dans les cadres après qu’un nucléosome déballe. Utilisez-le pour un étalonnage spécifique de film du ratio nm/bp qui est utilisé pour le nucléosome calculs d’emballage
    4. Recueillir deux profils de section pour le cœur du nucléosome et deux pour l’ADN nu (Figure 4 b).
    5. Importer les profils de section transversale dans un tableur et normaliser les parcelles en soustrayant la valeur de z le plus bas de tous les points du profil.
    6. Calculer la hauteur et la largeur à mi-hauteur (FWHM) pour chaque section transversale et la moyenne des valeurs des deux profils pour chaque image.
  3. Soustraire la moitié de la valeur de la FWHM de chacun du nucléosome bras sont tracé comme un nuage de points ainsi que la somme calculée aux armes.
    1. Calculer la longueur moyenne de contour de mesures ADN effectuées pour l’ADN dans des cadres après avoir déballé le nucléosome.
    2. Déterminer le facteur d’étalonnage nm/bp en divisant la longueur moyenne de contour de l’ADN gratuit par la longueur de paires de bases du substrat ADN. Utilisez cette valeur pour calculer l’habillage de nucléosomes dans chaque image, tel que décrit à la section 5.12.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mono-nucléosomes ont été tout d’abord préparés pour AFM d’imagerie expériences utilisant une méthode de montage de dilution continue (Figure 1). Les nucléosomes préparés ont été ensuite vérifiées à l’aide de discontinu SDS-PAGE (Figure 2). Une surface de mica a été ensuite fonctionnalisée à l’aide d’APS, qui capte les nucléosomes à la surface tout en conservant un fond lisse pour l’imagerie à haute résolution (Figure 3). Nucléosomes...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit ci-dessus est assez simple et fournissent des résultats hautement reproductibles, bien que quelques questions importantes peuvent être soulignées. Fonctionnalisés APS-mica est un substrat clé permettant d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Une grande stabilité de APS-mica est l’une des caractéristiques importantes de ce substrat qui permet de préparer le substrat d’imagerie à l’avance pour une utilisation qui peut être utilisée au moins deux semaines après en cours de préparation.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contributions de l’auteur : AVP et MSD a conçu le projet ; MSD assemblé des nucléosomes. MSD et ZS effectué des analyses de données et d’expériences AFM. Tous les auteurs a écrit et édité le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plasmide pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
Amorces PCRIDT, Coralville, IACommande personnalisée(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polyméraseThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Numéro de catalogue pour 200 unités
Kit de purification PCRQiagen, Hilden, Allemagne  ;28104Numéro de catalogue pour 50 unités
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Numéro de catalogue pour 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Numéro de catalogue pour 500 g
(CENP-A/H4)2, EpiCypher humain recombinant, Durham, NC16-0010 Numéro decatalogue pour 50 ug
H2A/H2B, EpiCypher humain recombinant, Durham, NC15-0311Numéro de catalogue pour 50 ug
H3 Octamer, recombinant humainEpiCypher, Durham, NC16-0001 Numéro decatalogue pour 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0,1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Numéro de catalogue pour 10 dispositifs
Sodium ChlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GNuméro de catalogue pour 500 mg
Amicon Ultra-0.5  ; mL Filtres centrifuges  ;Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Numéro de catalogue pour 8 appareils
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLNuméro de catalogue pour 25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GNuméro de catalogue pour 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Numéro de catalogue pour 1 kg
de persulfate d’ammonium (AmmPS)  ;Bio-Rad, Hercules, CA1610700Numéro de catalogue pour 10 g
solution d’acrylamide/bis, 37,5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Numéro de catalogue pour 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Numéro de catalogue pour 5 mL
4x Tampon d’échantillon de protéines Laemmli pour SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Numéro de catalogue pour 10 mL
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLNuméro de catalogue pour 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ;ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Numéro de catalogue pour 500 uL
Bio-Safe&trade ; Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Numéro de catalogue pour les
lingettes non tissées pour salles blanches de 1 L : TX604 TechniCloth  ;TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VA
Syntheized as described in 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GNuméro de catalogue pour 25 g
Scotch TapeScotch-3M, St. Paul, MN
Sonde AFM TESPA-V2 (pour l’imagerie statique)Sondes AFM Bruker, Camarillo, CA
Sonde AFM MSNL-10 (pour imagerie time-lapse standard)Sondes AFM Bruker, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Numéro de catalogue pour tube de 2 g
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GNuméro de catalogue pour 100 g
Filtre Millex-GP, 0,22  ; et micro ; mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Numéro de catalogue pour 10 appareils
BL-AC10DS-A2 sonde afm (pour HS-AFM)Olympus, Japon
Compound FG-3020C-20  ;FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japon.
Compound FS-1010S135-0.5  ;FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japon.
Microscope à force atomique multimodeBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Californie
Microsocopie à force atomique à intervalle temporel à grande vitesseToshio Ando, Institut des sciences de la nano-vie, Université de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japon
de Aminopropyl silatrane (APS)Grade 1

Références

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Structure du nucl osomedynamique des nucl osomesimagerie par AFMstructure de la chromatinenucl osomes CENP AAFM en acc l rpr paration du substrat de micacomplexes prot ine ADNtudes sur mol cule unique

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