Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Summary

Nous présentons ici un protocole afin de caractériser les particules nucleosome à l’échelle de la molécule unique à l’aide de la microscopie à force atomique statiques et time-lapse (AFM) techniques d’imagerie. La méthode de la fonctionnalisation de surface décrite permet la capture de la structure et la dynamique des nucléosomes dans haute résolution à l’échelle nanométrique.

Abstract

La chromatine, qui est une longue chaîne de sous-unités nucléosome, est un système dynamique qui permet à ces procédés critiques comme la réplication de l’ADN et la transcription de prendre place dans les cellules eucaryotes. La dynamique des nucléosomes fournit l’accès à l’ADN par les mécanismes de réplication et de transcription et critique contribue aux mécanismes moléculaires qui sous-tendent les fonctions de la chromatine. Études de la molécule unique comme la microscopie à force atomique (AFM) d’imagerie ont largement contribué à notre compréhension actuelle du rôle de la structure du nucléosome et dynamique. Le protocole actuel décrit les étapes permettant aux techniques d’imagerie à haute résolution de AFM étudier les propriétés structurales et dynamiques des nucléosomes. Le protocole est illustré par les données d’AFM obtenues pour les nucleosomes centromère dans lequel histone H3 est remplacé par sa protéine homologue de centromère A (CENP-A). Le protocole commence par l’Assemblée des mono-nucléosomes en utilisant une méthode de dilution continue. La préparation du substrat mica fonctionnalisé avec aminopropyl silatrane (APS-mica) qui est utilisé pour l’imagerie du nucléosome est cruciale pour la visualisation de l’AFM des nucléosomes décrit et la procédure pour préparer le substrat est fournie. Nucléosomes déposés sur la surface APS-mica sont imagés tout d’abord à l’aide de AFM statique, qui capture un instantané de la population du nucléosome. L’analyse de ces images, on peuvent mesurer des paramètres tels que la taille de l’ADN enroulé autour des nucléosomes et ce processus est également détaillé. Le time-lapse AFM d’imagerie de procédure dans le liquide est décrite pour l’AFM de time-lapse à grande vitesse qui peut prendre plusieurs images de la dynamique des nucléosomes par seconde. Enfin, l’analyse de la dynamique de nucléosomes permettant la caractérisation quantitative des processus dynamiques est décrit et illustré.

Introduction

Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est très condensé et organisée dans des chromosomes. ¹ le premier niveau d’organisation de l’ADN au sein d’un chromosome est l’Assemblée des nucléosomes dans laquelle 147 bp d’ADN est étroitement enroulé autour d’un noyau d’octamère d’histones. ^{2 , 3} particules nucleosome assemblent sur une longue molécule d’ADN formant un tableau de la chromatine qui est ensuite organisé jusqu'à forme une unité très compacte du chromosome. ⁴ le démontage de la chromatine offre l’accès gratuit à l’ADN requis par les processus cellulaires essent....

Protocol

1. Dilution continu Assemblée des Mono-nucléosomes

1. Produire et purifier un substrat d’ADN bp environ 400 qui contient un nucléosome Widom 601 décentré séquence de positionnement. ⁵⁵
   Remarque : Pour limiter la formation non désirée des di-nucléosomes, chaque « bras » flanquant la séquence de positionnement ne doit pas dépasser 150 ~ bp.
   1. Utilisez le plasmide pGEM3Z-601 avec les amorces et amplifier l’ADN de substrat à l’aide de la PCR. Pour le substrat de bp 423 avec 122 et 154 longueur des bras bp utilisé ici, utiliser avant (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') et inverse (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') des amorces.
   2. Ajouter....

Results

Mono-nucléosomes ont été tout d’abord préparés pour AFM d’imagerie expériences utilisant une méthode de montage de dilution continue (Figure 1). Les nucléosomes préparés ont été ensuite vérifiées à l’aide de discontinu SDS-PAGE (Figure 2). Une surface de mica a été ensuite fonctionnalisée à l’aide d’APS, qui capte les nucléosomes à la surface tout en conservant un fond lisse pour l’imagerie à haute résolution (Figure 3). Nucléosomes.......

Discussion

Le protocole décrit ci-dessus est assez simple et fournissent des résultats hautement reproductibles, bien que quelques questions importantes peuvent être soulignées. Fonctionnalisés APS-mica est un substrat clé permettant d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Une grande stabilité de APS-mica est l’une des caractéristiques importantes de ce substrat qui permet de préparer le substrat d’imagerie à l’avance pour une utilisation qui peut être utilisée au moins deux semaines après en cours de préparation.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmide pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
Amorces PCR	IDT, Coralville, IA	Commande personnalisée	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polymérase	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Numéro de catalogue pour 200 unités
Kit de purification PCR	Qiagen, Hilden, Allemagne  ;	28104	Numéro de catalogue pour 50 unités
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Numéro de catalogue pour 250 g
EDTA	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Numéro de catalogue pour 500 g
(CENP-A/H4)2, EpiCypher humain recombinant	, Durham, NC	16-0010 Numéro de	catalogue pour 50 ug
H2A/H2B, EpiCypher humain recombinant	, Durham, NC	15-0311	Numéro de catalogue pour 50 ug
H3 Octamer, recombinant humain	EpiCypher, Durham, NC	16-0001 Numéro de	catalogue pour 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Numéro de catalogue pour 10 dispositifs
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Numéro de catalogue pour 500 mg
Amicon Ultra-0.5  ; mL Filtres centrifuges  ;	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Numéro de catalogue pour 8 appareils
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Numéro de catalogue pour 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Numéro de catalogue pour 25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Numéro de catalogue pour 1 kg
de persulfate d’ammonium (AmmPS)  ;	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	Numéro de catalogue pour 10 g
solution d’acrylamide/bis, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Numéro de catalogue pour 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	Numéro de catalogue pour 5 mL
4x Tampon d’échantillon de protéines Laemmli pour SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Numéro de catalogue pour 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Numéro de catalogue pour 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ;	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Numéro de catalogue pour 500 uL
Bio-Safe&trade ; Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Numéro de catalogue pour les
lingettes non tissées pour salles blanches de 1 L : TX604 TechniCloth  ;	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muscovite Block Mica	AshevilleMica, Newport News, VA
	Syntheized as described in 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Numéro de catalogue pour 25 g
Scotch Tape	Scotch-3M, St. Paul, MN
Sonde AFM TESPA-V2 (pour l’imagerie statique)	Sondes AFM Bruker, Camarillo, CA
Sonde AFM MSNL-10 (pour imagerie time-lapse standard)	Sondes AFM Bruker, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Numéro de catalogue pour tube de 2 g
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Numéro de catalogue pour 100 g
Filtre Millex-GP, 0,22  ; et micro ; m	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Numéro de catalogue pour 10 appareils
BL-AC10DS-A2 sonde afm (pour HS-AFM)	Olympus, Japon
Compound FG-3020C-20  ;	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japon.
Compound FS-1010S135-0.5  ;	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japon.
Microscope à force atomique multimode	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Californie
Microsocopie à force atomique à intervalle temporel à grande vitesse	Toshio Ando, Institut des sciences de la nano-vie, Université de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japon