Dosages pour le taux de croissance spécifique et la capacité de liaison de cellule du Rotavirus

Les virus à ARN forment une population génétiquement diverse, connue comme les quasi-espèces¹, en raison de leur taux de mutation,² qui est supérieur à celui des organismes basés sur l’ADN. Structure de la population dans les quasi-espèces est affectée par les facteurs génétiques de la population, y compris la mutation, la pression de sélection et la dérive génétique. Au sein d’une seule lignée génétique des souches peuvent présenter différents phénotypes en raison de la diversité génétique. Par exemple, Yelena et coll. ont montré que la sensibilité de chlore libre était différente parmi les souches de norovirus murin qui proviennent d’une souche purifiés par plaque S7-PP3³.

Rotavirus (rotavirus de genre dans la famille des reoviridae) sont des virus non enveloppé ds RNA formant les quasi-espèces². Outre les facteurs génétiques de la population décrites ci-dessus, un réassortiment du génome affecte la diversité génétique du rotavirus parce que ce virus a 11 génomes segmenté⁴. Rotavirus causent la diarrhée chez les nourrissons, et les décès infantiles en 2013 ont été estimées à environ 250 000⁵. Deux vaccins sont utilisés dans plusieurs pays et ont été efficaces pour réduire la charge de l’infection à rotavirus, mais certains chercheurs sont maintenant discuter de la présence de vaccin-escape mutants^{6,7,8, 9}. la caractérisation des mutants est importante de comprendre les mécanismes de vaccin-s’échapper.

Nous présentons ici les protocoles pour deux essais pour évaluer le taux de croissance spécifique et la capacité de liaison de cellule du rotavirus afin de comprendre les différences phénotypiques entre les souches/des mutants. La courbe de croissance de rotavirus a été présentée dans précédents rapports¹⁰, mais les paramètres de croissance tels que le taux de croissance spécifique ne sont pas habituellement mesurés. Un essai de liaison cellulaire effectué précédemment implique par immunofluorescence technique coloration¹¹. Nous montrons ici des méthodes plus faciles d’utiliser le dosage de la plaque et de la RT-qPCR, qui permettent de discuter quantitativement la différence dans les phénotypes virales. Ces méthodes sont appropriées pour la caractérisation des phénotypes de rotavirus et peuvent enfin participer à la construction de nouveaux vaccins efficaces pour plusieurs génotypes.

1. préparation moyenne

1. Pour rendre un milieu de culture cellulaire (milieu contenant du sérum), ajoutez 4.7 g de poudre MEM d’aigle dans 500 mL d’eau distillée. Autoclave à 120 ° C pendant 20 min et laissez le refroidir moyens à température ambiante. Ajouter de sérum de veau fœtal (concentration finale : 10 %), L-Glutamine (2 mM), la pénicilline, streptomycine (1 %) et le bicarbonate de sodium (1,125 g/L). Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
2. Préparer le milieu sans sérum pour la propagation de virus tel que décrit à l’étape 1.1, mais sans le sérum de veau fœtal. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
3. Pour l’essai de plaque, stériliser 100 mL de milieu MEM de Eagle (ne contenant pas le rouge de phénol) à l’autoclave. Laisser le milieu refroidir à température ambiante, puis ajouter 2 % FBS, 2 % pénicilline streptomycine, 4 mM de L-Glutamine et 2,25 g/L de NaHCO₃. Conserver à 4 ° C.
4. Pour l’essai de plaque, stériliser 100 mL de gel d’agarose 2.5 % par autoclave. Préparer le gel le même jour, que l’essai de plaque est réalisée. Stocker le gel à 47 ° C dans un bain d’eau.

2. Culture cellulaire

1. Supprimer un cryotube contenant des lignées cellulaires MA104 du contenant de l’azote liquide. Placez le cryotube dans un bain-marie à 37 ° C à dégeler les cellules. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans 20 mL de milieu contenant du sérum dans une fiole de T75. Incuber le flacon dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 2 ou 3 jours.
   Remarque : La concentration de la dernière cellule dans la suspension est environ 10⁶ cellules/mL.
2. Une fois que la monocouche cellulaire atteint 80 % confluence, éliminer le surnageant et laver les cellules deux fois avec 5 mL de 1 x PBS de Dulbecco (tamponné phosphate salin).
3. Ajouter 4 mL de 0.05 % trypsine-EDTA au ballon et incuber à 37 ° C pendant 5 min détacher les cellules de la fiole. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger à 190 x g pendant 5 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules granulés (10⁶ cellules) dans 1 mL de 1.1 préparés en moyenne contenant du sérum. Diluer les cellules resuspendues à 100 fois avec le milieu.
5. Ajouter 3 mL de la suspension cellulaire dilué dans chaque puits de 6 puits (pour l’essai de plaque) ou plaques 24 puits (pour l’essai de liaison de cellule), respectivement. Incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂ en vertu de la vapeur saturée pendant 2 ou 3 jours.
   Remarque : Une fiole T75 est conçue pour recueillir des échantillons de temps parce que le volume de l’échantillon du surnageant (1 mL) peut être ignoré par rapport au volume total de surnageant (30 mL). Pendant ce temps, le titre infectieux du virus dans chaque surnageant est mesuré par l’essai de plaque, qui est généralement réalisée à l’aide d’une plaque 6 puits. Une plaque 24 puits est utilisée pour le dosage de la liaison de cellule.

3. taux de croissance spécifique du Rotavirus

Remarque : Rotavirus rhésus (RRV, génotype : G3P[3]) est utilisé dans le présent protocole car RRV peut rapidement et facilement former des plaques avec des cellules MA104.

1. Place un tube contenant 1 mL de la suspension virale (⁷ 10 UFP/mL) dans un milieu sans sérum stockée à-80 ° C dans un bain-marie à 37 ° C à dégeler. Ajouter 1 µg/µL la trypsine du pancréas porcin à 1 mL de la suspension virale (concentration finale de la trypsine est 4 µg/mL), puis vortexer. Incuber la suspension virale à 37 ° C et 5 % de CO₂ en vertu de la vapeur saturée pendant 30 min.
   Remarque : La trypsine provenant des autres sources peut être utilisée, mais l’effet sur l’infectivité antirotavirus doit être testé à l’avance.
2. Diluer la suspension de virus activés avec un milieu sans sérum pour ajuster la multiplicité d’infection (MOI) à 0,1 pfu/cellule.
3. Ajouter 1 mL de suspension virale dilué aux lignées de cellules MA104 (confluent de 80 %) dans une fiole de T75 3 jours après la cellule électrodéposition (2.1), incuber à 37 ° C pendant 1 h et agiter doucement le flacon toutes les 15 min.
4. Puis, ajouter 30 mL d’un milieu sans sérum contenant 0,13 µg/mL de trypsine du pancréas porcin dans le ballon. Incuber le ballon à 37 ° C et 5 % de CO₂ en vertu de la vapeur saturée.
5. Collecter 1 mL du surnageant dans le ballon à 0, 6, 12, 18, 24 et 36 (ou 48) h après l’infection (hpi) et remplacer le liquide surnageant dans les tubes de 1,5 mL à l’aide d’une pipette.
6. Procéder au gel (-80 ° C) et faire fondre au bain-marie à 37 ° C cycle trois fois. Puis centrifuger les tubes à 12 600 x g pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le liquide surnageant.
7. Filtrer le liquide surnageant avec un filtre de distillée 0,2 µm pour éliminer la fraction cellulaire. Conserver le surnageant-80 ° C dans le réfrigérateur jusqu'à l’appliquant à l’essai de plaque pour mesurer le titre du virus.
8. Placer les tubes contenant le liquide surnageant collecté (étape 3.5) dans un bain-marie à 37 ° C. Ajouter 4 trypsine µg/mL à un 1 mL d’échantillon dilué 10 fois et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
9. Au cours de l’incubation de 30 min à 3,8, pour commencer l’essai de plaque pour mesurer le titre virus obtenu à partir d’échantillons de cours temps (étape 3.5), laver les cellules de MA104 deux fois dans une plaque 6 puits avec 2 mL de solution 1 PBS x après avoir enlevé le milieu contenant du sérum.
10. En série, diluer les échantillons incubés avec un milieu sans sérum et ensemencer 1 mL de l’échantillon dilué dans chaque puits. Incuber les plaques pendant 90 min à 37 ° C et 5 % de CO₂ en vertu de la vapeur saturée et secouez légèrement la plaque toutes les 15 min.
11. Après incubation, retirer l’inoculum de la plaque de 6 puits. Ajouter 4 trypsine µg/mL dans le milieu préparé (étape 1.3). Doucement, mais immédiatement ajouter 3 mL de milieu mélangé avec du gel d’agarose (le ratio est de 1:1) dans chaque puits.
12. Maintenir la plaque à température ambiante pendant plus de 10 min (jusqu'à ce que le gel d’agarose devient solid) et incuber pendant 2 jours à 37 ° C et 5 % de CO₂ en vertu de la vapeur saturée.
    Remarque : Versez le milieu mélangé avec agar du bord du puits.
13. Ajouter 1 mL de la solution de rouge neutre de 0,015 % diluée avec 1 x PBS dans chaque puits et incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ en vertu de la vapeur saturée. Enlever la teinture après 3 h et incuber pendant 1 jour à 37 ° C et 5 % de CO₂ en vertu de la vapeur saturée.
14. Le lendemain, compter le nombre de plaques dans chaque puits et calculer l’UFP/mL. Vérifiez soigneusement la confluence de la cellule avant l’essai de plaque pour assurer le nombre de plaques.

4. cellule-liaison Assay

Remarque : Ce protocole est basé sur rapport^{13 de Gilling}.

1. Ajouter 1 µg/µL la trypsine du pancréas porcin à 1 mL de la suspension virale (concentration finale de la trypsine est 4 µg/mL), puis vortex (de la même manière qu’en 2.1). Diluer la suspension virale avec un milieu sans sérum pour ajuster le ministère de l’intérieur de 1 pfu/cellule.
2. Ensuite, laver les cellules MA104 deux fois sur la plaque 24 puits avec 1 ml de tampon Tris salin (SCT ; base de 2,53 g/L Tris, 6,54 g/L de NaCl, 0,3 g/L de KCl, 0,046 g/l Na₂HPO₄ pour atteindre 1 L avec de l’eau distillée).
3. Ensemencer 100 µL de la suspension du virus dilué dans chaque puits d’une plaque 24 puits avec des cellules et incuber à 4 ° C pendant 90 min, en agitant doucement toutes les 15 min.
4. Retirez l’inoculum de virus et laver les cellules deux fois avec 1 mL du SCT. Pour extraire le double-brin (ds) RNA du rotavirus, ajouter 140 µL de 1 x PBS et 560 µL de tampon d’extraction de la RNA (voir Table des matières) dans chaque puits. Mélangez bien avec une pipette (environ 10 x ou jusqu'à ce que la brume ou le contaminant des cellules dans la mémoire tampon n’est pas vu).
5. Après avoir récupéré l’ARN double brin (dsRNA) selon le protocole du fabricant, placer les tubes de 1,5 mL contenant l’extrait de dsRNA sur un bloc chauffant à 95 ° C pendant 5 min à dénaturer l’Arndb, immédiatement placer les tubes sur la glace, puis incuber pendant plus de 2 min.
6. Faire la synthèse de l’ADNc en utilisant une transcriptase inverse nécessaire (voir la Table des matières). Ajouter 4 µL de solution de RNA virale dénaturée dans un tube PCR contenant 16 µl du mélange (tableau 1) et mélanger soigneusement avec une pipette de manière à ne pas générer des bulles. Tournez en bas des tubes.
7. Effectuer la transcription inverse avec un thermocycleur dans les conditions indiquées au tableau 2. Si l’ADNc n’est pas utilisé immédiatement, ranger le tube PCR contenant l’ADNc à-20 ° C pendant 1 an.
8. Utiliser les amorces pour la PCR quantitative (avant 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', inverses ; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ et une sonde d’insertion d’un extincteur (qPCR sondes ; 5'- / FAM/ATGAGCACA/extincteur/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3'), ciblant les 963 – région de 1049 du segment du génome NSP3 du rotavirus (souche ST3, GenBank : X81436).
   NOTE : Quencher est inséré dans la sonde conçue par Zeng et coll.¹⁴
9. Diluer le plasmide standard en série (10¹ 10⁶ copies/ml) avec PCR de grade d’eau pour le mélange de qPCR (tableau 3) et faire des master mix (20 µL/échantillon) pour qPCR suivant tableau 4.
10. Ajouter 20 µL du mélange maître dans le puits d’une plaque PCR 96 puits et mélanger puis 5 µL d’échantillons de cDNA ou 5 µL du plasmide standard en pipettant également 10 fois. Démarrer la réaction de l’installation de qPCR selon les modalités indiquées dans le tableau 4.
11. Pour calculer le génome de rotavirus lié à la surface des cellules MA104, effectuer une régression linéaire entre les valeurs de Ct et le nombre de génomes connus d’un plasmide standard et d’estimer le nombre de génome de l’échantillon. Puis calculer le ratio de liaison numéros virion aux cellules (G,_t) à ceux de l’inoculum initial (G₀).

Un aperçu des deux protocoles pour le taux de croissance spécifique et l’analyse de cellule-fixation de plaque-purifiée souches RRV est montré à la Figure 1 a et 2 a, respectivement.

Dans l’analyse du taux de croissance spécifique, le titre final virus atteint plus de 107 UFP/mL lors de la propagation sur la fiole T75. Si la concentration maximale est inférieure à 107 UFP/mL, la cellule MA104 ne peut-être devenir confluente ou RRV n’était pas activé par la trypsine. Certains modèles de croissance sont disponibles pour estimer le taux de croissance spécifique en utilisant les données de l’unité infectieuse. Dans ce protocole, le modèle de Gompertz mis à jour le12 est employée à titre d’exemple ;

où N0 (104 UFP/mL dans cette étude) et Nt (104 à 108 UFP/mL) sont le titre infectieux du virus (UFP/mL) à 0 et t (exemple : 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectivement, A est la valeur asymptotique [log (N∞/n0 )] (exemple : 3 à 4), µ est le taux de croissance spécifique [1/h], e est constante de Napier et λ est la période de latence [h]. Paramètres du modèle sont obtenus par la fonction solveur du logiciel d’analyse, ce qui minimise la somme des carrés des différences entre les valeurs observées et modélisées. Dans l’exemple de la Figure 1 b, le taux de croissance spécifique (µ) est estimé à 0,197 [1/h] et la période de latence (λ) est 6,61 [h] en appliquant la méthode des moindres carrée à un mis à jour le modèle de Gompertz et le titre de virus relatif à la phase stationnaire de la (titre initial échelle des journaux) (A) est de 3.15 [log (∞de N/n (0)]. Nous avons testé les 6 clones de rotavirus au total, et les valeurs estimées du taux de croissance spécifique variaient de 0,19 à 0,27 [1/h]. Ces estimations de valeurs sont fiables, car le coefficient de détermination des valeurs dans l’ajustage de précision de modèle est plus que 0,98.

RRV virions liaison à surfaces cellulaires sont environ 103 copies/mL (liant efficacité était d’environ 1 %) lorsque vous utilisez une plaque 24 puits pour le dosage en liant le cellulaire (Figure 2 b). Le dosage est généralement mené trois fois pour chaque échantillon, et si un écart important dans le nombre de copies est observé dans un échantillon, certains problèmes tels que l’activation trop lavage et insuffisante du RRV par la trypsine peuvent survenir. La valeur de Ct de qPCR dépassant environ 36,0 n’est pas préférable et est considérée comme inférieur à une limite de détection dans notre condition de qPCR.

Tableau 1 : Master mix composition pour la synthèse de cDNA du génome de rotavirus.

Tableau 2 : État de réaction pour la synthèse de cDNA du génome de rotavirus.

Tableau 3 : Master mix composition pour PCR quantitative du rotavirus un génome.

Tableau 4 : Condition de réaction PCR quantitative du rotavirus un génome.

Figure 1 : aperçu schématique de l’estimation de la croissance de rotavirus et la courbe de croissance du rotavirus. (A) l’unité infectieuse du rotavirus est mesurée avec l’essai de plaque. (B) la courbe (ligne bleue) a été approchée par le mis à jour le modèle de Gompertz basé sur des données observées dans notre laboratoire (cercle blanc). Le taux de croissance spécifique [µ] ; 0,197 [h-1], lag période (λ) ; 6,61 [h], le titre virus relatif à la phase stationnaire au titre initial (échelle logarithmique) (A) ; 3.15 [log (∞de N/n (0)]. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : aperçu schématique et résultat représentatif de l’essai de liaison cellulaire de cinq souches RRV purifiée à partir de plaques dans notre laboratoire. Plaque de culture cellulaire (A) A inoculé par un rotavirus est incubée à 4 ° C pour empêcher l’invasion de virus dans les cellules. Après incubation et enlever les particules virales non liés aux cellules, quantifier le nombre de génomes provenant des particules virales liés à la surface de la cellule avec la RT-qPCR. (B), le résultat de la cellule-liaison dosage s’affichait comme liant de rendement (%), qui était le taux de particules virales liées à celles présentes dans l’inoculum. Bar "BOLD" : médian, fin des cases : déviation quartile, fin de ligne : maximum et minimum. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.