Article de méthode

Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel

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DOI :

10.3791/58824

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16 janvier 2019

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Biotechnology Research Department, Gedeon Richter Plc

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici la procédure détaillée d’une plateforme de test de protéase récemment développés utilisant la protéine liant le maltose/protéine N-terminale et fusionné avec protéines recombinantes substrats fluorescents attachés à la surface de nickel-nitrilotriacétique acide magnétique agarose perles. Une analyse ultérieure de dans-gel de l’essai des échantillons séparés par électrophorèse sur gel sodium dodécyl sulfate polyacrylamide est également présentée.

Résumé

Protéases sont des enzymes étudiés en raison de leur rôle essentiel dans plusieurs voies biologiques des organismes vivants et la pathogenèse ; Ils sont donc des cibles thérapeutiques importants. Nous avons développé une plateforme magnétique d’agarose-perle-test pour l’étude de l’activité protéolytique, qui repose sur l’utilisation des substrats protéiques fusion recombinantes. Afin de démontrer l’utilisation de ce système de dosage, un protocole est présenté sur l’exemple du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) protéase. La plateforme de test introduits peut être utilisée efficacement dans la caractérisation biochimique des protéases, y compris les mesures de l’activité enzymatique dans la mutagenèse, cinétique, inhibition ou études de spécificité, et il peut être approprié pour le haut débit dépistage de substrat ou peut être adaptée à d’autres enzymes protéolytiques.

Dans ce système de dosage, les substrats appliquées contiennent la protéine N-terminale (ses6) et les balises de la protéine (PBM) liant le maltose, sites de clivage du tabac etch virus (TEV) et protéases du VIH-1 et une protéine fluorescente C-terminal. Les substrats peuvent être efficacement produites en cellules d’Escherichia coli et facilement purifié à l’aide de perles - chélate - revêtement de nickel (Ni). Au cours de l’essai, le clivage protéolytique des substrats rattaché au talon entraîne la libération de fragments de clivage fluorescent, qui peut être mesurée par fluorimétrie. En outre, les réactions de clivage peuvent être analysées par électrophorèse sur gel sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE). Un protocole pour la renaturation de dans-gel des éléments d’analyse est également décrite, car la renaturation partielle des protéines fluorescentes permet leur détection basée sur la masse moléculaire et de la fluorescence.

Introduction

Les enzymes protéolytiques appartiennent aux groupes enzyme plus intensivement étudiés en raison de leur importance dans les voies métaboliques et les applications industrielles, aussi bien. Leur rôle essentiel dans les maladies virales, la régulation de la coagulation sanguine, cancer et cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives fait des protéases cibles éminents dans le domaine de découverte de médicaments. Par conséquent, la caractérisation détaillée de spécificité de substrat et inhibiteur de la protéase (PR) d’intérêt de profilage sont essentielle et s’effectués de préférence par des épreuves biochimiques rapides, rentables et robustes1,2, 3.

De nos jours, la grande majorité des tests in vitro protéase appliquée dans le domaine de découverte de médicaments pour le profilage de composés est homogène, fluorescent dépistage peptidique et haut débit (HTS)-plateformes compatibles4. En outre, peptides marqués ne conviennent pas uniquement pour le dépistage de la bibliothèque, mais ils offrent également d’excellents outils pour le dosage de l’enzyme des paramètres cinétiques sur les substrats sélectionnés. Dans d’autres cas, où l’étiquetage du substrat n’est pas possible, analyses séparation peuvent fournir une solution possible pour évaluer les propriétés cinétiques des réactions protéolytiques3.

Généralement, les dosages in vitro protéase reposent sur l’utilisation de deux types de substrat : courts peptides ou protéines entières. Dans ces cas, où le clivage des séquences peptidiques court reflètent les propriétés de clivage suffisamment, les approches standards suivantes sont applicables : (i) examiner les substrats de la protéine standard telles que l’insuline oxydé chaîne B, (ii) test substrats disponibles dans le commerce des autres protéases, (iii) bibliothèques de peptides synthétiques et fluorescent étiquetés créés par la chimie combinatoire, ou (iv) de dépistage à l’aide des méthodes génétiques, par exemple, biologique afficher technologies5, 6. Outre la classification conventionnelle, autres nouvelles plates-formes sont également disponibles pour la production du substrat (par exemple, la formation de peptides dérivés du protéome bibliothèques7 ou sous-types spéciales des méthodes génétiques, comme la fusion recombinante substrats à base de protéines8,9,10,11,12).

Tous les types de substrats susmentionnées et les dosages ont leurs propres avantages et limites, et le développement des formats de dosage combinant et/ou d’améliorer les avantages des plates-formes connues est toujours en demande. Nous décrivons ici un protocole pour un dosage de protéase fluorescent axée sur la séparation, qui utilise des substrats recombinants. Ces protéines de fusion se composent de ses balises MBP fusionnés à un site de clivage de contrôle de TEV PR, qui est suivie de la séquence de substrat d’intérêt qui est directement relié à une protéine fluorescente C-terminal (FP) (Figure 1 a) et6 . Le clonage d’une séquence d’ADN codant pour un site de clivage de l’intérêt dans la cassette « clonage » peut être effectué par une réaction de ligature unique dans le plasmide d’expression, qui a été linéarisé précédemment par endonucléases de restriction.

figure-introduction-1
Figure 1 : Principe de l’analyse de la protéase fluorescent. Protéase (A) la représentation schématique d’un substrat fluorescent et son clivage par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est montré. La flèche indique la position de clivage au sein de la séquence de site de clivage de matrice/capside de protéase du VIH-1 (VSQNY * PIVQ). Substrats (B), la fluorescence peuvent être utilisés pour analyser les réactions enzymatiques lors du test de billes magnétiques dotés de Ni-NTA et électrophorèse sur gel de polyacrylamide, ainsi, comme le montre le diagramme de flux de travail. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protéolytiques essais en utilisant une protéine recombinante similaire des substrats contenant une balise d’affinité, un site de clivage protéolytique et un protéine fluorescent-ont déjà été décrits8,9,10, le système présenté ici a l’intention d’intégrer et d’améliorer les avantages de ces méthodes. Une différence importante est que les substrats de protéine de fusion dans cette plateforme d’essai sont équipés de MBP pour améliorer les protéines solubilité13 et contiennent un site de clivage de contrôle vét SPE. En outre, les substrats contiennent des protéines fluorescentes de nouvelle génération, qui sont très stables et ont une forme monomérique pour empêcher l’agrégation de substrat. Outre la demande précédemment publiée de mTurquoise2 et érable ondé-fusionné avec formes14, ici nous montrons aussi résultats donnés par l’utilisation d’un substrat recombinant contenant un monomère amélioré tag fluorescent protéine fluorescente jaune (mEYFP). Par les présentes, nous démontrer la compatibilité du système avec d’autres protéines fluorescentes et représentent certains types généraux de résultats qui peuvent être acquis par le dosage de la protéase.

Les protéines de fusion recombinantes sont exprimés dans les cellules d’e. coli BL21 (de3) et sont utilisés comme substrats pour l’essai dans un acide nitrilotriacétique-nickel (Ni-NTA)-enduit magnétique d’agarose-perle-rattaché au formulaire. Les produits de clivage C-terminal soient libérés de la surface de la perle dans le surnageant par clivage de la protéase d’intérêt. Après la séparation du liquide surnageant (contenant l’enzyme et les produits de clivage) de billes magnétiques, la fluorescence peut être mesurée pour déterminer les propriétés de clivage de l’enzyme. Par contraste avec les méthodes décrites précédemment, dans le système présenté ici, la quantité de substrat et produits de clivage C-terminal est unique quantifiée basé sur une procédure de calibrage de substrat détaillée. Le système de dosage peut être soutenu par une analyse en SDS-PAGE de l’essai des échantillons ; une visualisation de dans-gel fluorescente subséquente peut-être être appliquée immédiatement après l’électrophorèse ou la renaturation de dans-gel des composants fluorescents nondenatured et dénaturés, respectivement le14.

La flexibilité et la structure de la cassette de « clonage » permettent une insertion de temps et coût-efficace d’une grande variété de séquences dans la construction et, par conséquent, favorise la génération de bibliothèques de substrat. Étant donné que toutes les étapes de test sont compatible automation et HTS, le système peut être particulièrement attrayant pour, par exemple, protéase spécificité des mesures et études de mutagenèse ou il peut également être utilisé efficacement pour le dépistage d’inhibiteur de la protéase industrielle et/ou le développement de médicaments antiviraux, aussi bien.

Paramètres cinétiques de l’enzyme (kchat, Km) peuvent être déterminées par l’essai reposant sur la séparation développé ; par conséquent, il peut être adapté pour effectuer des mesures cinétiques enzymatiques individuels, tels que les études d’évolution temporelle, axées sur le substrat et l’inhibition. Cela prouve que les substrats de protéine recombinante fusion constituerait un bon pour les substrats d’oligopeptide synthétique fréquemment utilisés, et en raison de leur similitude élevée aux substrats polyprotéine, ils représentent la naturellement les interactions enzyme / substrate avec plus de précision.

Protocole

1. génération des plasmides codant pour substrat expression

  1. Linéariser le plasmide d’expression - MBP-FP pDest-His6par des endonucléases de restriction PacI et NheI. Pour la génération de pDest-His6- MBP-FP, consultez Bozóki et al.14.
    1. Ajouter 1 500-2 000 µg de plasmide d’expression pDest-His6- MBP-FP, 2 µL de chaque de PacI et endonucléases de restriction NheI, 10 µL de tampon de x 10 (voir Table des matières) et de l’eau exempte de nucléase (NFW) 100 µL dans un tube de microcentrifuge.
    2. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 1 h.
  2. Ajouter 20 µL de 6 x purple ADN colorant au mélange réactionnel de chargement et de séparer les produits de clivage par électrophorèse, gel d’agarose à 1 %. Appliquer une échelle 1 kB d’ADN en standard.
  3. Rincer le gel pendant 15 min dans 20 mL de tampon (40 mM Tris, d’acide acétique 20 mM, 1 mM EDTA, pH 8,5) de TAE contenant 20 µL de solution SYBR green et exciser la bande du plasmide linéarisé hors du gel d’agarose, avec un outil bien aiguisé.
    Remarque : Tout en éclairant le gel par un transilluminateur bleu foncé-lecture (DRBT), plasmide linéarisé pDest-His6- MBP-FP apparaît comme une bande discrete et lumineuse à environ 7-8 kB.
  4. Purifier le plasmide linéarisé expression de la tranche de gel en utilisant un gel extraction kit selon les instructions du fabricant.
  5. Insérez la séquence de substrat dans le plasmide linéarisé pDest-His6d’expression - MBP-FP.
    1. Recuire le vers l’avant (FWD) et les marche arrière (REV), e. coli codon optimisé amorces codant pour la séquence de substrat d’intérêt.
      Remarque : Les amorces recuits seront flanqués par les extrémités cohésives correspondant aux sites de clivage de l’endonucléase de restriction PacI et NheI (Figure 2).
      1. Mix 150 ng de plasmide linéarisé expression avec 200 ng de FWD et 200 ng de REV oligonucléotides amorces dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) 0,2 mL de tube et ajuster le volume à 17 µL en ajoutant NFW.
      2. Incuber le mélange à 65 ° C pendant 2 min et, ensuite, à 4 ° C pendant au moins 2 min.
    2. Effectuer l’insertion des amorces recuits dans le plasmide linéarisé par ligature.
      1. Ajouter 2 µL de tampon de ligase T4 (10 x) et 1 µL de ligase T4 au mélange contenant le plasmide linéarisé et les amorces de recuit.
      2. Incuber le mélange de ligature à 16 ° C pendant 16 h.

figure-protocol-1
Figure 2 : Amorces codant pour un clivage protéolytique du site séquence. Amorces et inverses encoder le VSQNY * séquence de site de clivage PIVQ du VIH-1 PR. Après le recuit les amorces complémentaires, l’ADN double-brin court contient les extrémités cohésives, correspondant à celle des endonucléases de restriction PacI et NheI. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Transformer 100 µL de cellules compétentes BL21 (de3) par 5 µL du mélange de la ligature et la propagation des cellules sur plaques de gélose de bouillon (LB) de lysogénie contenant l’ampicilline.
    Remarque : Les protéines fluorescentes seront dans le même cadre de lecture ouvert avec les balises de fusion N-terminale qu’après une ligature réussie. Quelques jours après la transformation, les colonies (contenant le plasmide d’expression codant pour le site de clivage inséré d’intérêt) montrera la fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT.
  2. Préparer le stock de glycérol des colonies dépeinte.
    1. Laver une colonie discrète dans un tube à centrifuger 50 mL contenant 5 µL de milieu LB contenant l’ampicilline (à une concentration finale de 100 µg/mL).
    2. Il incuber à 37 ° C pendant 8 h et en agitant continuellement à 220 tr/min ; puis, récolter les cellules par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    3. Doucement, suspendre les cellules dans 1 mL de solution de glycérol de 80 % (diluée avec de l’eau distillée) et ajouter 500 µL de 10 mM MgCl2 solution dans la suspension.
    4. Transférer la suspension dans un tube de gel et de conserver les stocks à-70 ° C.
  3. Vérifier la séquence du plasmide généré par séquençage de l’ADN.
    1. Ajouter 10 µL du stock de glycérol (préparé à l’étape 1.7) dans 5 mL de milieu LB contenant 100 ampicilline µg/mL dans un tube à centrifuger 50 mL.
    2. Incuber la suspension à 37 ° C pendant 16 h et en agitant continuellement à 220 tr/min ; puis, récolter les cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Isoler le plasmide d’expression depuis le culot cellulaire par un miniprep plasmide kit (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant et utilisez le plasmide purifié pour le séquençage de l’ADN.
      Remarque : pour le séquençage, 5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3' (avec impatience) et 5'-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3' amorces (inverse) peuvent être utilisés.

2. expression des substrats fluorescents

  1. Préparer la culture starter.
    1. Ajouter 10 µL du stock de glycérol (préparé à l’étape 1.7) dans 5 mL de milieu LB contenant 100 ampicilline µg/mL dans un tube à centrifuger 50 mL.
    2. Incuber la suspension à 37 ° C pendant 15 h et en agitant continuellement à 220 tr/mn.
  2. Transfert de la culture bactérienne (5 mL) à 50 mL de milieu LB frais contenant 100 ampicilline µg/mL dans un Erlenmeyer de 500 mL stérile.
  3. Cultiver les cellules à 37 ° C pour une absorbance de 0,6 à 0,8 à une longueur d’onde 600 nm, tout en agitant continuellement à 220 tr/mn.
    Remarque : Si un traitement tétracycline doit s’appliquer à l’étape 2.5, il est déconseillé de cultiver les cellules à une absorbance de plus de 0,6 à 600 nm.
  4. Ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la concentration finale de 1 mM pour induire l’expression de la protéine.
  5. Si un traitement tétracycline n’est pas appliqué, incuber la culture pendant 3 h à 37 ° C en agitant continuellement à 220 tr/min et continuer le protocole avec étape 2.6. Si l'on applique un traitement tétracycline, continuer le protocole avec des mesures 2.5.1-2.5.3.
    Remarque : Certains FPs produites par les cellules d’Escherichia coli peuvent avoir un temps de maturation plus longs (voir travaux antérieurs)16,17; dans ces cas, la traduction des protéines peut être éventuellement stoppée par le traitement de la tétracycline, afin d’augmenter le rendement fluorescent de la solution de substrat.
    1. Incuber la suspension cellulaire pendant 2 h à 37 ° C en agitant continuellement à 220 tr/min ; Ensuite, ajouter une solution de tétracycline (à une concentration finale de 200 µg/mL).
    2. Incuber les cultures cellulaires selon le temps de maturation de la protéine fluorescente de choix à 37 ° C, et en agitant continuellement à 220 tr/mn.
  6. Transférer 2 x 25 mL de la culture pour nettoyer les tubes à centrifuger 50 mL et de récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Jeter le surnageant et stocker les pellets de la cellule bactérienne à-70 ° C pendant au moins 1 h.
    Remarque : Les cellules contenant les substrats fluorescents exprimées montrent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT.

3. cellule perturbation

  1. Placez le culot cellulaire congelés sur la glace et laissez-le décongeler pendant 15 min.
  2. Ajouter 2 mL de tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 8) au culot et suspendre les cellules.
  3. Ajouter 10 µL de solution d’inhibiteur de protéase fraîchement préparés phénylméthanesulfonyle-fluorure (PMSF) (8,7 mg/mL, dissous dans l’éthanol) dans la suspension.
  4. Ajouter 2 mg de lysozyme et 20 unités de DNase à la suspension et le suspendre.
  5. Incuber la suspension sur la glace pendant 15 minutes et vortex il occasionnellement.
  6. Transfert de 2 x 1 mL de la suspension pour tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et laisser agir les suspensions pendant 3 min, en séries de 10 s de sonication et 5 s de repos.
  7. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 20 min à température ambiante ; Ensuite, retirer le surnageant fluorescent (défrichée cellule bactérienne lysat) soigneusement dans chaque tube et le transférer dans de nouveaux tubes de microcentrifuge.
    Remarque : Les lysats défrichées contenant le substrat fluorescent montrent une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT et peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 semaines. Ne congelez pas. Défrichée lysats peuvent être utilisés directement pour la préparation de l’échantillon dans le dosage de la protéase (voir point 4.1) ou peut également être utilisé pour la purification de substrat (voir étape 4.5.1).

4. dosage de protéase perles magnétiques dotés de Ni-NTA

Remarque : En raison de la flexibilité de la plate-forme de test, il peut être optimisé pour différents types d’études. Pour cette raison et à cause de la différence dans le taux d’activité des enzymes de choix, certains paramètres de l’essai (où elle est notée) ne peut pas être décrit explicitement mais doivent être optimisées les buts individuels et de la conception expérimentale. Comme une ligne directrice, les paramètres de certains types d’études sont dénotés les étapes particulières.

  1. Préparation des échantillons
    1. Génération de billes magnétiques rattaché au substrat
      1. Placer un tube de microcentrifuge fermé 2 mL basse-protéine-contraignante (voir Table des matières) contenant neuf ou recyclé (voir section 4.7) Ni-NTA magnétique d’agarose perles dans un concentrateur de particules magnétiques (MPC).
        Remarque : Le montant de la suspension de perle appliquée doit être définie selon le protocole expérimental. Nous avons utilisé 1 mL de solution de billes magnétiques (5 %, v/v) à chaque expérience.
      2. Perles peuvent coller à la paroi ou dans le couvercle du tube microcentrifuge ; par conséquent, renversez le MPC dans tous les sens pour s’assurer que toutes les perles sont collectés.
      3. Retirez le surnageant et jetez-le.
      4. Laver les perles de tampon de lyse.
        1. Ajouter 1,8 mL de tampon de lyse aux talons et retirez le tube fermé de la MPC.
        2. Suspendre les perles dans le tube en secouant et/ou en retournant les tubes jusqu'à ce que l’échantillon soit complètement homogène.
        3. Placer le tube dans le CPP et tournez-le à l’envers pour recueillir les perles.
        4. Ouvrir le tube et éliminer le surnageant.
      5. Ajouter 1.0-1.8 mL de la défrichées lysat (préparé à l’étape 3,7) aux talons et retirer le tube du CPP.
      6. Tourner le tube fermé à l’envers jusqu'à ce que les perles sont parfaitement homogènes et tournent lentement le tube par un agitateur à température ambiante pendant 30 min.
      7. Placez-le dans la MPC et retirez la cellule défrichée lysate les perles et du couvercle.
        Remarque : La cellule défrichée lysate peut être mis au rebut ou enregistrée pour une utilisation ultérieure (voir la note après l’étape 3,7).
      8. Ajouter 1 % Tween 20 (pH 7) à billes magnétiques (Samb) rattaché au substrat.
        NOTE : Samb montre une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT.
    2. Lavage de la Samb
      1. Placer le tube avec la suspension SAMB dans la MPC et éliminer le surnageant.
      2. Laver le Samb 3 fois avec chaque tampon : i) 1.8 mL de 1 % Tween 20 (pH 7) ; II) 1,8 mL de tampon de lavage (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazole de 5 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 7) ; III) 1,8 mL de tampon de clivage (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05 % de Tween 20, pH 7).
        Remarque : Pour la procédure de nettoyage, consultez l’étape 4.1.1.4. Le tampon de clivage peut-être être modifié selon les besoins expérimentaux, mais il est recommandé de consulter le manuel de billes magnétiques Ni-NTA pour déterminer la compatibilité.
    3. Préparation de la solution mère SAMB
      1. Ajouter un tampon de clivage à la Samb lavées pour créer une solution stock SAMB.
        Remarque : Après l’ajout de la mémoire tampon, ne pas secouer ou tournez le tube à l’envers. Le volume de la mémoire tampon de clivage dépend de la conception expérimentale individuelle et doit être calculé sur la base du nombre de billes magnétiques (voir étape 4.1.1.1) et sur les volumes à utiliser à l’étape 4.1.4.2. Tubes de 2 mL, le volume appliqué est jusqu'à 1 900 µL (voir tableau 1). La densité des billes magnétiques recommandée de la solution mère SAMB est 2-10 % (v/v).
        Type d’étudeVolume de tampon de clivage (µL)
        S-dépendante des mesures (Fig 4)1600
        Mesures de temps (fig. 5 a)1600
        Étude de l’inhibition (Fig 5 b)1900
        étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6)1400

        Tableau 1 : Volume de la mémoire tampon de clivage utilisé pour préparer la solution SAMB dans les différents types de mesures.
      2. Enlever le tube fermé du CPP. Utiliser la solution-mère SAMB immédiatement ou conserver à 4 ° C pendant 24 h.
    4. Génération de l’essai des échantillons à l’aide de la solution mère SAMB
      Remarque : Les détails de cette partie de l’essai sont fortement dépendantes de la conception expérimentale individuelle (exemples types sont indiqués dans le tableau 2).
      Type d’échantillonNotes
      Exemple de réaction (R)-utilisé pour l’évaluation des propriétés de clivage
      -contient l’enzyme et le substrat dans un tampon de clivage
      Échantillon témoin de substrat (B)-utilisé pour évaluer la dissociation spontanée de substrat (voir étape 4.6.2)
      -contient seulement le substrat dans un tampon de clivage
      Exemple de contrôle de substrat (C)-pour la concentration de substrat de déterminer (voir étape 4.6.3)
      -contient seulement le substrat dans un tampon d’élution

      Tableau 2 : Types d’échantillons de l’essai de protéase magnétique-perle à base de Ni-NTA.
      1. Préparer 2 mL de tubes de microcentrifuge basse-protéine compromettante pour l’essai des échantillons.
        Remarque : Autre hypoprotidique contraignant de marchandises en plastique peut également être utilisé. Tubes fond rond ou plat permet d’assurer la libre circulation des Samb. Voir le nombre recommandé de tubes dans le tableau 3.
        Type d’étudeRBC
        S-dépendante des mesures (Fig 4)552
        Mesures de temps (fig. 5 a)662
        Étude de l’inhibition (Fig 5 b)771
        étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6)551

        Tableau 3 : Nombre de tubes de microcentrifuge requis 2 mL pour chaque type d’échantillon dans les études démontrées.
      2. Suspendre la solution SAMB jusqu'à homogénéité et transférer la quantité de substrat doit être analysé dans les réactions immédiatement dans les flacons d’échantillon. Le volume recommandé est de 25 à 300 µL, mais il doit être réglé selon le protocole expérimental individuel (tableau 4).
        Remarque : Vérifiez si tous les Samb ont été mesurées dans le fond des tubes. Samb peut coller à la paroi de la trompe, qui peut fausser les résultats de titrage. Si différents volumes doivent être mesurés de façon séquentielle, démarrez aliquotage avec le plus grand volume et tenter de réduire au minimum le changement des pipettes ou des pointes de pipette.
        Type d’étudeRBC
        S-dépendante des mesures (Fig 4)25 – 50 – 100 – 150 – 25025 – 50 – 100 – 150 – 25025
        Mesures de temps (fig. 5 a)252525
        Étude de l’inhibition (Fig 5 b)120120120
        étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6)100100100

        Tableau 4 : Volume de la solution SAMB mesuré dans les flacons d’échantillon de chaque type d’échantillon dans les études démontrées.
      3. Placer les tubes échantillon contenant la suspension SAMB aliquotée dans la MPC et déplacer légèrement le MPC en arrière.
      4. Retirez délicatement le surnageant de la Samb et jetez-le.
      5. Retirer les tubes du CPP et ajouter le volume calculé du tampon (buffer [100 mM EDTA, 0,05 % de Tween 20, pH 7] clivage ou d’élution) de la réaction soigneusement à la Samb.
        Remarque : Calculer le volume de tampon selon le protocole expérimental individuel (tableau 5). Pour tubes de 2 mL, le volume final conseillé du mélange réactionnel (le volume de la mémoire tampon de réaction à ajouter dans cette étape + le volume de la solution d’être ajouté à l’étape 4.2.3) est de 50-150 µL. s’assurer que tous les Samb sont lavés dans le tampon supplémentaire. Tampon d’élution est utilisé au lieu de clivage tampon non contrôlé dans les cas d’échantillons de contrôle (C) de substrat. Pour une étude de l’inhibition, l’inhibiteur de choix est recommandé d’ajouter à cette étape.
        Type d’étudeVolume de la mémoire tampon de réaction (µL)
        S-dépendante des mesures (Fig 4)68 µL de tampon de clivage
        Mesures de temps (fig. 5 a)68 µL de tampon de clivage
        Étude de l’inhibition (Fig 5 b)Stock de 67,3 µL de tampon de clivage + inhibiteur de 0.7 µL solution *
        étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6)Clivage de 69,5 µL tampon **

        Tableau 5 : Volume de tampon de réaction dans les études démontrées. * L’amprénavir a été résolu en diméthylsulfoxyde ; les solutions mères amprénavir (allant de 1 nM à des concentrations de 1 µM) ont été appliquées pour l’étude de l’inhibiteur (voir Figure 5 b). ** Le pH de la mémoire tampon de clivage appliquées varie de pH 6.0-8,5.
      6. Fermer les couvercles des tubes. Maintenant, les échantillons sont prêts pour le dosage.
        Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant 24 h, mais le stockage ne s’applique que si la solution SAMB a été utilisée immédiatement après la préparation (voir étape 4.1.3.2).
  2. Initiation des réactions protéolytiques
    1. Préparer la solution d’enzyme protéolytique selon les besoins expérimentaux.
      Remarque : Il est recommandé d’utiliser un tampon de clivage pour dissoudre ou diluer l’enzyme. Protocoles de purification de HIV-114 et TEV PRs18 ont été publiés précédemment.
    2. La valeur de la thermoshaker taux d’agitation (600 tr/min) et température d’incubation (tableau 6).
      Type d’étudeTempérature d’incubation (° C)
      S-dépendante des mesures (Fig 4)37
      Mesures de temps (fig. 5 a)37
      Étude de l’inhibition (Fig 5 b)37
      étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6)30

      Tableau 6 : les températures d’Incubation appliquées dans l’étude de différents types. Pour le VIH-1 PR, 37 ° C est recommandée, alors que 30 ° C est recommandé pour le TEV PR.
    3. Ajouter la solution d’enzyme pour les échantillons de réaction pour l’initialisation des réactions protéolytiques.
      Remarque : Dans le cas des exemples C et substrat blanc (B), ajouter clivage buffer (tampon enzymatique) et élution, respectivement. Le volume est calculé selon les besoins individuels et expérimentales (tableau 7). Pour tubes de 2 mL, le volume final conseillé du mélange réactionnel (le volume de la mémoire tampon de réaction ajoutée à l’étape 4.1.4.5 + le volume de la solution pour être ajouté à cette étape) est de 50-150 µL.
      Type d’étudeVolume de l’enzyme solution/enzyme / l’élution de la mémoire tampon tampon (µL)
      S-dépendante des mesures (Fig 4)2
      Mesures de temps (fig. 5 a)2
      Étude de l’inhibition (Fig 5 b)2
      étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6)0,5

      Tableau 7 : Volume du tampon tampon/élution solution/enzyme enzyme ajouté lors de l’initialisation de l’essai des échantillons dans le cas des études démontrées.
    4. Attiser les perles soigneusement en déplaçant doucement les tubes et placer les tubes immédiatement dans le thermoshaker déjà secouer.
      NOTE : Résiliation manuelle échantillon (voir la section 4.3) prend plus de temps que l’initiation ; par conséquent, un retard enregistré d’au moins 2 min est recommandé entre les initiations des réactions.
    5. Incuber les échantillons selon le protocole expérimental (tableau 8).
      Type d’étudeD’incubation temps (min)
      Mesures axées sur le S (fig. 4 a)7
      Mesures axées sur le S (fig. 4 b)120
      Mesures de temps (fig. 5 a)0-2,5-5 – 10 – 15 – 20
      Étude de l’inhibition (Fig 5 b)10
      étude de dépendance à l’égard de pH (Fig 6)60

      Tableau 8 : Temps d’Incubation appliqués à l’essai des échantillons dans les différentes mesures.
  3. Termination des réactions protéolytiques
    1. Prendre l’échantillon de l’agitateur, 30 s avant la fin de l’incubation et faire tourner rapidement.
    2. Placer le tube sur le CPP, laissez reposer pendant 15 s, et déplacer légèrement le MPC en arrière.
    3. Ouvrez le couvercle et transférer le surnageant soigneusement sur une plaque ou un nouveau tube.
      Remarque : Ne pas toucher les billes concentrés avec l’embout de la pipette. Le liquide surnageant collecté des échantillons de C et R avec un degré élevé de clivage peut-être présenter une fluorescence visible avec ou même sans l’aide d’un DRBT.
  4. Détection par fluorescence
    1. Transférer 2 x 30 µL de surnageants échantillon séparé dans une microplaque de moitié-zone noire.
    2. Mesurer la fluorescence en utilisant les filtres appropriés d’excitation et d’émission.
      Remarque : Mesurer la fluorescence de base du tampon de clivage et tampon d’élution, aussi bien. Nécessité de combinaisons filtre à choisir basée sur la protéine fluorescente mesurée (tableau 9).
      Protéine fluorescenteFiltres d’excitation (nm)Filtres d’émission (nm)
      mTurqiouse2355/40460/25
      mEYFP544/15590/10
      mApple544/15590/10

      Tableau 9 : Filtres d’Excitation et d’émission utilisés pour détecter les différentes protéines fluorescentes.
  5. Calibration
    NOTE : Pour générer des courbes d’étalonnage à l’étape 4.6.1, les valeurs d’intensité de fluorescence du clivage - ou d’élution-tampon-résolu des substrats purifiées, à différentes concentrations besoin à mesurer.
    1. Purifier les substrats fluorescents.
      Remarque : Pour la purification, Samb substrat blancs (B) des échantillons d’après que l’essai de la protéase peut-être être collecté ou un nouveau SAMB suspension peut aussi être préparée (voir les sections 4.1.1 et 4.1.2).
      1. Placer un tube avec Samb en suspension dans 1 mL de tampon de clivage (2-10 % ; v/v) à la MPC et collecter les billes magnétiques en retournant le MPC dans toutes les directions.
      2. Ouvrir le tube et retirer le tampon de clivage, le tube et le couvercle.
      3. Enlever le tube du CPP et ajouter 400-600 µL de tampon d’élution de la Samb.
      4. Tournez lentement le tube fermé avec une coiffe à température ambiante pendant 5 min.
      5. Placer le tube sur la MPC et collecter les perles en retournant le MPC.
      6. Retirez le surnageant contenant du substrat fluorescent intact purifié (éluat) et transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge basse--la liaison aux protéines.
        NOTE : Éluat montre une fluorescence visible avec ou même sans utiliser un DRBT.
    2. Procéder à l’échange de la mémoire tampon parallèle à l’aide de deux dispositifs d’ultrafiltration 0,5 mL 10K.
      1. Mesurer le volume de la moitié de l’éluat préparé (200-300 µL) dans chaque unité d’ultrafiltration.
      2. Après à chaque étape de centrifugation, diluer l’éluat concentré dans le premier et les deuxième dispositifs ultrafiltration par élution buffer et clivage, respectivement.
      3. Après la récupération, ajuster les échantillons concentrés résolus dans les tampons différents sur le même volume, entre 120-200 µL.
        NOTE : Maintenant la teneur en protéines du substrat tampon-résolu clivage est identique au substrat résolu-tampon d’élution ; par conséquent, il n’est pas nécessaire de déterminer la teneur de celui-ci à l’étape 4.5.3, en protéines si la méthode utilisée pour mesurer la concentration de protéines interfère avec l’EDTA.
    3. Déterminer la teneur en protéines des substrats dissous soit dans un tampon d’élution ou clivage en mesurant l’absorbance à 280 nm.
      Remarque : Autres méthodes (par exemple, Bradford bicinchoninic acide (BCA) essais ou) peuvent également servir à mesurer la concentration de protéines, mais des interférences possibles avec l’EDTA (présent dans la mémoire tampon d’élution) ou avec l’absorbance du substrat fluorescent doivent être considéré. La teneur en protéines initiale de la solution de substrat à appliquer à l’étape 4.5.4 est recommandée d’être entre 0,4 et 2,0 mg/mL afin de générer un étalonnage courbe dans une gamme appropriée. Voir le tableau 10 pour les coefficients d’extinction.
      SubstratPoids moléculaire
      (Da)      		Coefficient d’extinction
      (Cm-1 M-1, à 280 nm mesurés dans l’eau)
      Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise272101.796845
      Son6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise272042.795355
      Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP72367.194325
      Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple72145.9105200

      Tableau 10 : poids moléculaires et les coefficients d’extinction des substrats différents recombinant fusion fluorescent protein.
    4. Préparer une dilution en série double au moins huit étapes, tant de l’élution - les solutions de substrat clivage-tampon-résolu, à l’aide d’élution ou tampon de clivage pour la dilution, respectivement.
    5. Transférer 30 µL de chaque dilution point à une microplaque de moitié-zone noire.
    6. Mesurer la fluorescence avec un fluorimètre, à l’aide du paramètre est appliqué à l’étape 4.4.2.
      Remarque : Mesurer la fluorescence base du clivage et la mémoire tampon d’élution.
  6. Évaluation de l’essai
    1. Tracer les courbes d’étalonnage.
      1. Calculer la concentration (en mM) des solutions substrat purifiée (utilisé à l’étape 4.5.4), basée sur la teneur en protéines déterminée à l’étape 4.5.3.
      2. Corriger les valeurs d’intensité de fluorescence relative (RFU) les points de dilution en série par les valeurs fondamentales de la RFU de la mémoire tampon de dilution appliquée (le tampon de clivage ou la mémoire tampon d’élution).
      3. Tracer les valeurs corrigées de la RFU contre la concentration molaire des substrats purifiées clivage - ou d’élution-tampon-résolu et effectuer une régression linéaire (force de l’ordonnée à l’origine à zéro).
        NOTE : Une valeur élevée de2 R (˃0.97) indique une bonne corrélation linéaire entre la fluorescence et la concentration de la protéine fluorescente. Dans ce cas, la pente de la courbe de régression peut servir à évaluer la concentration des composants dosage dans la gamme examinée lors des étapes 4.6.2 et 4.6.3. Distribution de point les erreurs et les données expérimentale peut-être influer sur la fiabilité de l’étalonnage ; ainsi, une évaluation graphique peut être effectuée à l’aide du zoom en graphiques (comme illustré à la Figure 3), afin de vérifier si R2 et les valeurs de pente sont influencées par les données.
    2. Calculer la quantité de produit de clivage fluorescent C-terminale dans les échantillons de réaction.
      1. Corrigez les valeurs de la RFU de chaque échantillon R avec les valeurs de la RFU de l’échantillon B correspondant.
      2. Calculer la concentration de produit de clivage (en mM) dans les échantillons de réaction en divisant le corrigé valeurs RFU par la pente de l’étalonnage de clivage-tampon-base courbe (voir étape 4.6.1.3).
    3. Calculer la concentration de substrat appliquée dans les échantillons de réaction.
      1. Corrigez les valeurs de la RFU de l’échantillon C avec la valeur de la RFU de la mémoire tampon d’élution de base.
      2. Calculer la concentration du substrat éluée (en mM) dans le cas de l’exemple C en divisant leur corrigé valeurs RFU par la pente de l’étalonnage d’élution-tampon-base courbe (voir étape 4.6.1.3).
      3. Déterminer la concentration du substrat (en mM) de la solution mère de SAMB, utilisée pour la création de l’essai des échantillons à l’étape 4.1.4.2, basé sur l’équation suivante :
        figure-protocol-2
        Ici, cSAMB est la concentration molaire de la solution mère de SAMB, préparée à la section 4.1.3 ; cC est la concentration molaire du substrat éluée dans l’échantillon C calculé à l’étape 4.6.3.3 ; Vr est le volume du mélange réactionnel créé par l’ajout du buffer de réaction à l’étape 4.1.4.5 et l’enzyme à l’étape 4.2.3. ; et VSAMB est le volume de la solution de l’échantillon C (étape 4.1.4.2) SAMB.
      4. Calculer la concentration molaire des substrats dans chaque échantillon de R basée sur la concentration molaire de la SAMB solution mère (en mM) selon le volume (en µL) mesurée dans chaque tube à essais réaction au palier 4.1.4.2.
    4. Exécuter le traitement de données.
      Remarque : L’analyse des données dépend de l’objectif de l’expérience. La vidéo montre un exemple pour le traitement des données d’une étude cinétique de substrat dépendant sur le VIH-1 PR à l’aide de son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat. Les valeurs de la vitesse initiale sont calculés à partir de fragments de clivage C-terminal et sont tracées contre la concentration du substrat appliquée. Les paramètres cinétiques sont déterminés par une analyse de régression non linéaire de Michaelis-Menten.
  7. Recyclage des billes magnétiques
    NOTE : Après avoir effectué un essai, les perles magnétiques d’agarose peuvent être collectées et recyclées.
    1. Recueillir les billes magnétiques utilisés avec le MPC et éliminer le surnageant.
      1. Laver les billes avec 1,8 mL des tampons suivants, dans l’ordre indiqué : tampons de régénération A (0,05 % Tween 20, 0,5 M NaOH), tampon de régénération B (0,05 % Tween 20), tampon de régénération C (0,05 % de Tween 20, 100 mM EDTA, pH 8), tampon B de la régénération, la régénération tampon D ( 0,05 % de Tween 20, 100 mM NiSO4, pH 8), buffer B de la régénération et la régénération E (0,5 % de Tween 20, 30 % éthanol, pH 7).
        Remarque : Pour la procédure de nettoyage, consultez l’étape 4.1.1.4.
    2. Stocker les perles recyclées dans un tampon de régénération E à 4 ° C.

5. analyse de la PAGE

  1. Préparation des échantillons
    Remarque : Après avoir effectué le test de billes magnétiques dotés de Ni-NTA, les surnageants de dosage peuvent être analysés par PAGE. Dans ce cas, ignorez les étapes 5.1.1 et 5.1.2. Cependant, il est également possible d’analyser la solution purifiée de substrats fluorescents et/ou de leurs fragments de clivage après digestion solution avec la protéase d’intérêt. Dans ce cas, continuer le protocole avec étape 5.1.1.
    1. Préparer la solution de substrat fluorescent purifiée selon étape 4.5.1.
    2. Effectuer la digestion en solution.
      1. L’échange tampon d’élution avec tampon de clivage dans le dispositif de l’ultrafiltration de 0,5 mL 10K et l’aliquote les échantillons pour être digéré dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
        Remarque : pour l’analyse de PAGE, nous aliquotés 68 µL de chaque substrat, mais le nombre de tubes d’échantillons et le volume de solution de substrat d’être aliquotés peut être optimisée selon le protocole expérimental individuel.
      2. Ajouter la solution enzymatique aux échantillons.
        Remarque : Pour l’analyse de PAGE, nous avons appliqué 2 µL de VIH-1 PR, préparé comme indiqué par Bozóki et coll.14, mais le volume peut être optimisé selon le protocole expérimental individuel. Il est recommandé d’utiliser le tampon de clivage à dissoudre ou diluer l’enzyme.
      3. Incuber les échantillons selon le protocole expérimental.
        Remarque : Pour l’analyse de PAGE, nous avons incubé le mélange réactionnel pendant 45 min à 37 ° C, mais le temps d’incubation et la température doivent être définis selon le protocole expérimental.
      4. Mettre fin à la réaction en effectuant l’étape 5.1.3.
    3. Préparation des échantillons pour la PAGE.
      Remarque : Les échantillons contenant du substrat fluorescent peuvent être préparés pour la PAGE par un non dénaturant ou par une méthode de dénaturation. Pour l’utilisation des conditions non dénaturantes ou dénaturation, suivez l’étape 5.1.3.1 ou 5.1.3.2, respectivement.
      1. Préparer un échantillon nondenatured : mélanger 30 µL de l’échantillon avec 6 µL de 6 x tampon de chargement d’échantillon non dénaturant (300 mM Tris, 20 % de glycérol, 0.05 % bromophénol bleu, pH 6,8).
      2. Préparer un échantillon dénaturé : mélanger 30 µL de l’échantillon avec 6 µL de 6 x dénaturation tampon échantillon-chargement (300 mM Tris, 20 % de glycérol, 0.05 %, 100 mM bleu de bromophénol 12 % SDS, β-mercaptoéthanol, pH 6,8) et chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 min.
  2. Analyse de SDS-PAGE
    Remarque : En option, si seulement les échantillons de nondenatured (document établi en étape 5.1.3.1) doivent être analysés, une PAGE native aussi est possible. Dans ce cas, ignorez la section 5.3.
    1. Préparer un gel SDS-polyacrylamide (gel de concentration d’utilisation 14 % séparant et 4 %) et remplissez le réservoir avec le tampon d’électrophorèse (2,5 mM Tris, glycine 19,2 mM, SDS de 0,01 %).
    2. Ajouter les échantillons (préparés à l’étape 5.1.3.1 ou 5.1.3.2) sur les puits d’un gel de polyacrylamide et effectuer l’électrophorèse à 120 V tension.
    3. Retirez la cassette de gel du module en cours d’exécution et placer le gel dans une cuve de lavage.
      Remarque : Nondenatured échantillons sont déjà visibles dans le gel, même à l’oeil nu ou avec un DRBT.
  3. Détection de protéines fluorescentes et renaturation en gel
    NOTE : Pour détecter les protéines fluorescentes dans les échantillons dénaturés (préparés à l’étape 5.1.3.2) sur la DRBT, SDS doit être emportés par le gel, partiellement renaturaliser les protéines.
    1. Ajouter environ 100 mL d’eau distillée au gel et de rincer le gel au moins pendant 30 min.
      Remarque : Pour améliorer l’élimination du SDS, remplacez l’eau toutes les 10 min, ou rincer jusqu'à 60 min.
    2. Visualiser les protéines fluorescentes en utilisant un DRBT, ou par imagerie UV.
  4. Coloration de Coomassie conventionnelle du gel
    1. Souillez le gel avec le colorant bleu de Coomassie brillant bleu pour visualiser les protéines fluorescentes.

Résultats

Figure 1 a montre la structure schématique d’un substrat fluorescent représentatifs de la protéine recombinante qui peut être traitée par le VIH-1 PR à sa séquence de site spécifique de clivage. Figure 1 b représente la production du substrat et leurs applications possibles dans les essais de protéase, y compris analyse magnétique-perle-basée de Ni-NTA et/ou de la PAGE.

Pour obtenir des données fiables par fluorimétrie, une procédure d’étalonnage est nécessaire, afin de déterminer les quantités de produits de clivage et de substrats fluorescents. Pour ce faire, les valeurs d’intensité de fluorescence des différents substrats dans les conditions de tampon différents doivent être mesurés et doivent être corrélés à leurs concentrations dans la gamme de concentration dosé (Figure 3). Les valeurs de la pente des courbes d’étalonnage peuvent être appliqués pour déterminer les montants des substrats et des produits de clivage dans les échantillons d’essai. Les pentes des courbes d’étalonnage sont indépendantes des séquences clivage site insérés dans les substrats (tableau 11) et peuvent potentiellement être utilisés pour une série de substrats fusionné au même type de protéine fluorescente. Zoom en graphiques sont indiquées pour toutes les régressions linéaires, pour agrandir les plages de concentration inférieures ainsi (Figure 3). Il est important de noter que l’étalonnage doit être effectuée avec précaution car une distribution appropriée des points de données est requise pour un étalonnage fiable. Pour cette raison, dilution en série double est appliquée afin de préparer les échantillons pour l’étalonnage, parce que la valeur de2 R indique une bonne corrélation entre la concentration de la protéine fluorescente et fluorescence que si un nombre suffisant de points de données ont été utilisés pour couvrir la gamme entière de concentration. En outre, erreurs expérimentales peuvent influer fortement sur la précision de l’étalonnage ; ainsi, une évaluation graphique droites de régression peut être également nécessaire.

Une variété de mesures enzymatiques peut être effectuée par le dosage de la protéase, y compris l’examen de l’effet de la concentration du substrat sur la vitesse de réaction (Figure 4 a). Par régression non linéaire, les données peuvent servir à déterminer les paramètres cinétiques de l’enzyme (par exemple, vmax et Km). Une suspension de perle insuffisante et dispersion et un arrêt de la réaction inadéquate peuvent provoquer des résultats sous-optimaux (Figure 4 b), qui ne conviennent pas pour le calcul des valeurs cinétiques enzymatiques fiables.

Une dépendance à l’égard de la formation du produit à l’heure peut être déterminée par l’essai (Figure 5 a) (par exemple, au cours de l’optimisation des paramètres de réaction du clivage). L’activité enzymatique en présence d’un inhibiteur peut également être étudiée (Figure 5 b) pour la détermination de la concentration de l’enzyme active et constante inhibitrice. Selon la même méthodologie, les effets d’autres inhibiteurs peuvent également projetés lors du test.

Le dosage de la protéase est utile pour étudier les effets du pH sur l’activité de l’enzyme, ainsi. Figure 6 a représente la dépendance à l’égard de l’activité enzymatique pH par l’exemple de TEV PR, qui dispose d’une gamme de pH optimal large (pH 6-9). Si on étudie l’influence du pH sur de l’activité enzymatique (ou besoin d’enzymes ayant un pH acide optimal à mesurer), il est nécessaire de considérer que l’affinité des substrats recombinants aux talons peut être restreinte à un pH légèrement acide. Une dissociation élevée des substrats de la perle (Figure 6 b) peut causer une distorsion des résultats de l’analyse. Afin d’étudier la dissociation spontanée de substrat des perles, les valeurs mesurées pour les échantillons de réaction doivent être corrigées par celles des échantillons B.

La figure 7 montre que les protéines fluorescentes nondenatured peuvent être différenciés dans le gel issu de leurs couleurs, à l’aide de transillumination de lumière bleue (Figure 7 a). Si la détermination des poids moléculaires des fragments de substrats/clivage est nécessaire, des conditions dénaturantes peuvent également servir pour la préparation de l’échantillon, car les protéines fluorescentes peuvent être partiellement renaturé dans le gel et peuvent être détectées par illumination UV (Figure 7 b) ou de bleu de Coomassie coloration (Figure 7). Si les échantillons de R sont analysés, seuls les produits de clivage C-terminal sont visibles (Figure 7), tandis que les fragments de clivage N-terminal et les substrats clivés restent attachées aux talons. Occasionnellement, protéines peuvent être partiellement dénaturés malgré l’utilisation des conditions non dénaturantes (Figure 7), et tandis que les protéines nondenatured sont plus abondants, dénaturés formes sont aussi décelables dans l’échantillon. Ce phénomène n’influence pas la détection de clivage protéolytique mais doit être envisagé dans le cas de la densitométrie quantitative d’échantillons nondenatured.

Bien que la description détaillée est montrée que pour un 2 mL tube-test, le test peut être adapté pour un 96 puits plaque système (Figure 8), qui a déjà été testé avec succès dans notre laboratoire (non illustré). Le format adapté à la plaque de 96 puits est entièrement compatible avec le fluorimétrique et l’analyse électrophorétique, ainsi, et les données obtenues peuvent également être évaluées à l’issu des méthodes décrites dans cet article.

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Figure 3 : Courbes d’étalonnage. Courbes d’étalonnage représentative de substrat sont démontrés avec l’exemple de deux substrats recombinants fusionnée à différentes étiquettes fluorescentes de C-terminal : (A et B) son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 (etC D ) Son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom en chiffres sont également indiqués pour représenter la régression linéaire de points de données dans le 0-0,005 plage de concentrations de substrat mM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

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Figure 4 : Détermination des paramètres cinétiques enzymatiques. Substrat-dépendante des mesures cinétiques ont été effectuées par le VIH-1 PR (à une concentration finale d’active de 41,2 nM). Les valeurs de la vitesse initiale ont comploté contre la concentration du substrat et une analyse de régression non linéaire de Michaelis-Menten a été réalisée. Les barres d’erreur représentent SD (n = 2). Résultat optimal représentatif (A) A est montré avec l’exemple de son6- MBP-VSQNY * substrat protéique de PIVQ-mApple fusion. (B) un résultat sous-optimal représentatif montre aussi pour le son6- MBP-KARVL * substrat AEAM-mTurquoise2, où le paramètre de concentrations du substrat approprié était problématique à cause d’une homogénéisation insuffisante de la solution mère de SAMB , alors que les erreurs relativement élevées ont été causés par la cessation d’une mauvaise réaction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Étude temporelle et inhibitrice. (A) Sa 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP substrat protéique fusion recombinantes (à une concentration finale de 0,00326 mM) a été coupée par le VIH-1 PR (à une concentration finale d’active de 41,2 nM), et la libération de fragments protéolytiques de fluorescent PIVQ-mEYFP a été mesurée à effectuer une analyse temporelle. Les mesures ont été effectuées à cinq moments différents. Les barres d’erreur représentent SD (n = 2). (B), son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP a été utilisé comme substrat (à 0,0015 mM) afin de déterminer l’effet inhibiteur de l’amprénavir sur l’activité du VIH-1 PR (à une concentration totale de 163,8 nM). Par tracer les données, la moitié de la concentration inhibitrice maximale (CI50) pouvaient être évaluées et la concentration de l’enzyme active (une concentration active finale de 41,2 nM) du VIH-1 PR appliquée pourrait également calculées d’après la courbe de l’inhibition. Les barres d’erreur représentent SD (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Étudier la dépendance de l’activité enzymatique et dissociation spontanée de substrat sur Ph. (A) le son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (en 0,033 mM) a été utilisé pour mesurer l’activité enzymatique de TEV PR (à une concentration totale finale de 91.42 nM) dans un tampon de clivage a un pH différent, entre la plage de 6,5 à 8,5. Les barres d’erreur représentent SD (n = 2). Les données tracées ont été publiées auparavant14. (B) basé sur les valeurs d’intensité de fluorescence relative des échantillons vide substrat, la dissociation spontanée de son6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0,033 mM) de billes magnétiques a été étudiée à l’aide de tampons de clivage avec un pH différent, entre 6,0-8,5. Les données tracées ont été publiées auparavant14. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Détection de protéines dans le gel par des procédés différents. (A) clivées et substrats protéiques fusion VIH-1 PR digérés après préparation de l’échantillon non dénaturant ont été visualisées par bleue clair transillumination après SDS-PAGE. La réaction de clivage était interprétée par digestion solution. (B) immédiatement après la PAGE, seulement nondenatured protéines pouvaient être détectés dans le gel par illumination UV, alors que, après l’enlèvement du SDS, les protéines fluorescentes précédemment dénaturés est devenu partiellement renaturé et détectable. Les échantillons ont été préparés à partir les surnageants du dosage billes magnétiques dotés Ni-NTA. (C) coloration de Coomassie peut également être utilisée pour la détection de protéines, après la renaturation en gel. Le SDS-présent dans le gel-mai provoquer la dénaturation partielle de la protéine native, mais dans les échantillons de natifs, les formes nondenatured sont plus abondantes. Les échantillons ont été préparés à partir les surnageants du dosage billes magnétiques dotés Ni-NTA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

figure-results-6
Figure 8 : adaptation axée sur la plaque de 96 puits de la plate-forme de test. (A), l’analyse peut être effectuée non seulement dans les tubes de 2 mL, mais dans les puits d’une plaque 96 puits, aussi bien. Ici, nous montrons la représentation schématique de l’application du test étudier la spécificité d’une protéase fictive à l’aide d’une série de substrats fluorescents, qui peut contenir le type sauvage (wt) ou muté (mut-1 à mut-4) séquences de site de clivage. Pour la manutention des billes magnétiques, un concentrateur de particules magnétiques compatibles 96 puits (MPC) doit être utilisé dans les expériences. Tous les volumes indiqués sont liés à un puits unique. Pour comparer l’efficacité de clivage des substrats différents, conversion du substrat peut être évaluée par le pourcentage des valeurs RFU substrat-blanc-corrigé des échantillons réaction, compte tenu des valeurs RFU substrat-blanc-corrigé de la connexes échantillons de contrôle de substrat que 100. (B) après la fluorimétrie, les surnageants séparés du dosage des échantillons peuvent également être analysés par PAGE ainsi que les composants de la protéine fluorescente peuvent être analysés directement ou après renaturation en gel en cas d’échantillon non dénaturant et dénaturation préparation, respectivement. Les trois types de test différents échantillon sont aussi illustrés dans chaque figure : C = contrôle de substrat, B = blanc substrat et R = réaction. Échantillons de contrôle de substrat sont dans la mémoire tampon d’élution, tandis que le substrat blanc et les échantillons de réaction dans le tampon de clivage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Mémoire tamponProtéine fluorescenteCV % de pistes (%)
ÉlutionmTurquoise26.04
Clivage9.11
ÉlutionmApple10.92
Clivage12.68

Tableau 11 : Coefficient des valeurs de variation (CV %) des pentes des courbes d’étalonnage substrat. Pour vérifier si la fluorescence des substrats de la protéine recombinante est dépendante sur le site de clivage inséré, étalonnages ont été réalisés par série de mApple et mTurquoise2-fusionné avec des substrats (six variantes pour chacun, contenant du site de clivage différent séquences de protéase du VIH-1), tous deux dans les tampons d’élution et clivage. Nous avons trouvé que CV % valeurs les pentes sont moins 15 % dans tous les cas, ce qui implique qu’un étalonnage de substrat unique peut être utilisé pour évaluer les différentes mesures effectuées par des variantes de substrat contenant la même balise fluorescente.

Discussion

En raison des enquêtes intensives industriels et universitaires des enzymes protéolytiques et la demande constante pour plates-formes HTS-compatible rapides et abordables de dosage de protéase en conséquence, nous avons développé une protéase fluorescente magnétique base-perle dosage. L’analyse est basée sur l’utilisation de protéines recombinantes fusion qui peut être de nouvelles solutions de rechange aux substrats peptide synthétique largement utilisées.

Dans le format de test avancés, les substrats protéiques de fusion sont immobilisés sur les surfaces de Ni-chélate-enduit magnétique d’agarose perles. La fixation du substrat est assurée par le N-terminal sa balise6 d’affinité de la protéine de fusion, qui est directement fusionnée à une balise MBP afin de faciliter le pliage et la solubilité dans l’eau du substrat13. Le MBP est suivi par des sites de clivage du TEV PR et une protéase d’intérêt. Le premier peut servir un site de clivage de contrôle dans le dosage, tandis que ces derniers puissent être traitées par la protéase à investiguer. Le site de clivage est interchangeable ; un dsDNA courte séquence codant pour le site de clivage d’intérêt peut être inséré dans la cassette souple « clonage » du plasmide expression par la ligature. Les protéines recombinantes fusion contiennent une balise très stable, monomère de protéine fluorescente au C-terminal, qui permet la détection de point de terminaison des produits de clivage C-terminal fluorescents, enzyme-libéré, libéré par clivage protéolytique ( Figure 1 a). Les substrats fluorescents intacts purifiées, résolus dans différents tampons sont également utilisés pour l’étalonnage d’évaluer les concentrations molaires des substrats et des produits de clivage. En outre, après la fluorimétrie, les éléments d’analyse peuvent être analysés par SDS-PAGE, aussi bien. Les deux indigènes (nondenatured) et des protéines fluorescentes dénaturés peuvent être visualisées dans le gel, immédiatement après l’électrophorèse ou ultérieures en gel renaturation, respectivement. Cette supplémentaire procédure-en combinaison avec un classique bleu de Coomassie brillant bleu coloration-mai être utilisé efficacement pour vérifier les résultats de titrage (Figure 1 b).

Le mode opératoire se compose des étapes simples et faciles à exécuter dans un format de faible volume qui peut être entièrement adapté à un environnement automatique de haut débit. Toutefois, indépendamment de la réalisation de l’essai soit manuellement, soit avec un système d’automatisation, les pièces suivantes du test sont considérés comme être crucial et requièrent une attention particulière lors de l’exécution de la procédure. i) homogénéité de la solution de billes magnétiques. Une solution homogène de billes magnétiques doit être utilisée tout au long de l’essai, en purification et étapes de lavage. En particulier, la fiabilité des tests de protéase dépend fortement correctement toutes les solutions mères de billes magnétiques rattaché au substrat (SAMB). Afin d’accroître l’efficacité de la suspension et la dispersion, il est recommandé de définir la concentration en billes entre 2 % et 10 % (v/v). Au cours de la préparation de l’échantillon, l’utilisation de tampons additionnés de détergent non ionique (tels que Triton X-100 ou Tween 20) jusqu'à 2 % peut également diminuer l’adhérence des billes magnétiques pour les surfaces en plastique. L’adhésion des perles aux murs des flacons à échantillon peut être évitée si les suspensions de perle sont appliquées soigneusement le fond des flacons au lieu de sur les parois des tubes d’échantillons. L’homogénéité des billes magnétiques au cours de la réaction enzymatique est également essentielle et peut être assurée en agitant continuellement les échantillons à 600 tr/min pendant l’incubation. Perles sont correctement dispersées dans les produits de plastique rondes ou à fond plat, tandis que l’utilisation de flacons de fond V n’est pas recommandée. Un résultat sous-optimal causé par homogénéisation perle incorrecte est représenté dans la Figure 4 b. II) résiliation des échantillons de la réaction.  Un autre avantage de la méthode est que la réaction enzymatique peut être résiliée sans l’utilisation du traitement de dénaturation thermique ou n’importe quel d’agents chimiques possiblement interférentes15. La résiliation peut être effectuée simplement en séparant les billes magnétiques du mélange réactionnel, à l’aide d’un concentrateur de particules magnétiques classiques. Tandis que le tampon de réaction supprimé contient l’enzyme active et les produits de clivage fluorescent C-terminal générés, les substrats clivés restent attachées aux talons. En raison de la présence de l’enzyme active dans le tampon de réaction, la procédure de séparation doit être effectuée avec soin pour la détection fiable de point de terminaison. Avant de placer les flacons d’échantillon dans le concentrateur, il est recommandé d’appliquer une centrifugation essorage court. Après avoir placé les tubes dans le concentrateur, fournir au moins 15 s pour les perles à collecter. Léger mouvement du séparateur arrière-et-vient peut faciliter la collecte des perles. Veuillez considérer que, au cours d’une séparation réalisée manuellement, la résiliation prend généralement plus de temps que l’initiation des réactions. Par conséquent, un retard min enregistré environ 2 est recommandé entre les initiations si le même temps d’incubation doit être appliqué à tous les échantillons.

Le principe de l’analyse décrite protéolytique est relativement simple ; Cependant, la polyvalence du système est garantie par la structure du substrat flexible et stable. L’optimisation individuelle du test peut être limitée que par la compatibilité des perles d’affinité avec les conditions stipulées, réactifs et d’additifs. En accord avec protocole du fabricant, nous avons également constaté que l’affinité de substrats pour les surfaces de perle de Ni-NTA affaiblit considérablement à pH ≤ 6,515. Par conséquent, il est recommandé d’appliquer les échantillons blancs substrat parallèles aux échantillons de réaction et la vitesse de dissociation spontanée de substrat doit être examinée au cours de l’évaluation des résultats.

Dans ces cas, où magnétique perle-analyses ne peuvent être effectuées en raison de l’utilisation de composants incompatibles avec perle ou un pH bas, digestion en solution des substrats recombinants purifiés peut être également appliquée. Dans ces cas, les mélanges de réaction peuvent être analysés par électrophorèse, et les protéines peuvent être visualisées dans le gel basé sur le protocole décrit. Pour étudier l’activité protéolytique, digestion en solution et en gel-détection des protéines peuvent aussi être des outils alternatifs de fluorimétrie. Une nouveauté introduite par le système de substrat conçu est l’application d’une étape en gel renaturation après dénaturation SDS-PAGE. Tandis que natives protéines fluorescentes (nondenatured) conservent leur fluorescence pendant l’électrophorèse, la propriété fluorescente est supprimée à compter de la dénaturation (Figure 7 b). Cependant, la fluorescence des protéines dénaturées peut être partiellement récupérée par l’élimination du SDS dans le gel. Ainsi, une séparation des composants de réaction à l’aide de conditions de dénaturation permet non seulement la basés sur la fluorescence, mais l’identification moléculaire-basées sur le poids. Un autre avantage de la détection par fluorescence en gel par rapport à l’analyse d’un gel teinté bleu de Coomassie, c’est que les protéines fluorescentes (natif ou renaturé) peuvent être facilement identifiées dans le gel issu de leur fluorescence (voir Figure 7). Cela peut être important si les réactions sont effectuées dans les échantillons contenant des contaminants non fluorescentes ou protéines ressemblant fortement à poids moléculaires des uns des autres.

Tests de protéase à l’aide de substrats conçus de la même façon ont déjà été publiés précédemment8,9,10, et bien que le site de clivage d’intérêt dans ces cas était également situé entre une balise d’affinité et une protéine fluorescente, le système de test présenté ici non seulement reprend les idées décrites mais combine les différents avantages des plateformes précédentes et leur complète aussi avec d’autres améliorations : i) l’utilisation d’un partenaire de fusion MBP, ii) les présence d’un site de clivage de la commande PR TEV, iii) l’utilisation du FPs monomère nouvellement machiné, iv) l’application d’une procédure d’étalonnage de substrat unique. Le test lui-même a été particulièrement conçu pour être utiles à la spécificité de l’enzyme et des études cinétiques dans un coffre-fort, temps et coût-efficace manière, sans la nécessité pour l’instrumentation coûteuse. La méthode est destinée à être un outil convenable et abordable à ces deux fins de la recherche universitaire et industrielle. En raison de la flexibilité de la cassette « clonage » du plasmide expression, le système peut être adapté pour la génération rapide et peu coûteuse de bibliothèques de substrat recombinant. Le test décrit ci-après est un outil possible pour la mise en œuvre de la spécificité de substrat, mutagénèse d’enzyme, et l’inhibition des études et, également, fournir un outil de rechange pour effectuer la cinétique enzymatique. La plateforme de test (à partir de la perturbation des cellules bactériennes à la détermination des paramètres cinétiques) peut être adaptée à un environnement de base de HTS et automatisation et, potentiellement, peut-être être appliquée au dépistage d’inhibiteur de la protéase industrielle et/ou médicament antiviral développement. En outre, l’adaptation du test de protéolyse concurrentiel est également dans le futur champ d’application de notre laboratoire. Dans un test de concurrence, deux différents substrats, chacun contenant un site de clivage différentes fondues à a différents C-terminal fluorescent tag-sont destiné à être utilisés simultanément dans la même réaction de clivage d’enquêter sur la préférence de l’étudiée enzyme pour les séquences cible donnée. En outre, l’utilisation d’un formulaire de test adaptés plaque de 96 puits (Figure 8) est également optimisée pour le dépistage de la mutation en utilisant une série de substrats avec des séquences de site mis à jour le clivage dans le cas de protéases de cystéine.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par le projet de « Équipe PHARMPROT » GINOP-2.3.2-15-2016-00044 et, également, financé par le Programme de l’Excellence institutionnelle l’enseignement supérieur de la ministère des capacités humaines en Hongrie, dans le cadre de la Programme thématique de la biotechnologie de l’Université de Debrecen. Les auteurs sont reconnaissants pour les membres du laboratoire de biochimie rétroviral pour leur aide scientifique lors de l’élaboration de test ainsi que pour leur patience pendant le tournage de l’essai (en particulier à Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz et Vanda Toldi, qui font leur apparition dans l’arrière-plan de la vidéo). Les auteurs tiens également à dire extraordinaire grâce à Gedeon Richter Plc., en particulier au Dr Zoltán Urbányi pour permettre des travaux de Beáta Bozóki dans le département de biochimie et de biologie moléculaire en tant que chercheur invité. Les auteurs aimeraient également exprimer leur gratitude à György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi et Zoltán Király, du multimédia et E-learning Technical Center de l’Université de Debrecen, pour l’assistance professionnelle en audio et vidéo production.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes Amicon 10KMerck-MilliporeUFC501096
2-Mercaptoethanol (&beta ;-ME)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;M6250
d’acrylamide/Bis à 40 % 37,5:1Bio-Rad1610148
Acide acétique  ;Merck100063
AgaroseSERVA11404.04
Alpha Imager HP système de documentation sur gelProteinSimple
Ammonium persulfate (APS)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;A3678
Sel sodique d’ampicillineSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;A9518
Beckman Coulter Allegra X-22centrifugeuse Beckman Coulter392185
Noir Plaques demi-surfaceGreiner bio-One675086
Bleu bromophénolSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;B0126
Tampon CutSmart (10x)New England BiolabsB7204SPour la linéarisation des plasmides (étape 1.1.1)
Transilluminateur Dark ReaderClare Chemical ResearchDR-45M
DNase I  ;New England BiolabsM0303L
Dynamag-2  ; particule magnétique  ; concentrateurThermo Fischer Scientific12321D
Escherichia coli BL21(DE3) cellules compétentes  ;Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)C600003
ÉthanolMerc-Millipore100983
Acide éthylènediaminetétraacétique  ; (EDTA)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis)
Gel Loading Dye, Violet (6X)New England BiolabsB7024S
GlycérolMerck356350
GlycineSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;G7126
Mini-Kit Plasmide Haute VitesseGeneAidPD300
ImidazoleSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;56750
Isopropyle &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)AM9464
Jouan CR 412centrifugeuse JouanCR412
Labinco LD-76 Rotator  ;Labinco7600
Luria-Bertani (LB) bouillonSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;L3022
Lysozyme  ;Sigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis)L6876
Chlorurede magnésium ScharlauMA0036
MERCK eurolab Bain à ultrasonsMERCKUSR54H
Millifuge Centrifugeuse à spin EppendorfMilliporeCT10
Mini-PROTEAN 3 Electrophorèse CellBio-Rad
N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis)T9281
NanoDrop 2000Thermo Fischer Scientific
NheI-HF restriction endonucléaseNew England BiolabsR3131L
Sulfate de nickel(II) (NiSO4)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;
billes d’agarose magnétique Ni-NTA.Qiagen36113
Agitateur orbitalBiosanOS-20
PacI restriction endonucléaseNew England BiolabsR0547L
PageBlue Protein Staining Solution  ;Thermo Fischer Scientific24620
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis)  ;P7626
Tubes micro-centrifugeurs Protein Lobind  ;Eppendorf22431102
QIAquick Kit d’Extraction de GelQIAGEN28704
Snijders Agitateur Press-to-Mix  ;Gemini34524
Acétate de sodium trihydratéSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;S7670
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis)  ;S9888
Hydroxyde de sodium  ;Sigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis)S5881
SYBR Green I Nucleic Acid Gel StainThermo Fischer ScientificS7563
T4 DNA ligasePromegaM180A
Thermo shakerBiosanTS-100avec bloc d’accessoires SC-24
TrisSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;T1503
Tween 20Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  ;P2287
WALLAC VICTOR2 1420 Compteur multi-étiquettesWallac Oy, Turku, Finlande
Solution 798681656895

Références

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Réimpressions et autorisations

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Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel
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