Article de méthode

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

DOI :

10.3791/58830

⸱

30 janvier 2019

 , 
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Détection d’endotoxines dans les nanomatériaux représente un des grands défis dans le domaine de la nanomédecine. Nous présentons ici une étude de cas décrivant le cadre composé de trois formats différents de LAL pour évaluer la contamination potentielle d’endotoxines dans les nanoparticules.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lorsqu’ils sont présents dans les produits pharmaceutiques, une endotoxine de composant de paroi cellulaire bactérienne Gram négative (souvent aussi appelée lipopolysaccharide) peut provoquer une inflammation, fièvre, hypo - ou hypertension et, dans certains cas extrêmes, peut conduire à des dommages des tissus et des organes qui peuvent devenir fatale. Les montants de l’endotoxine dans les produits pharmaceutiques, par conséquent, sont strictement réglementés. Parmi les méthodes disponibles pour l’endotoxine détection et la quantification, le dosage de Limulus Amébocytes Lysate (LAL) est couramment utilisé dans le monde entier. Alors que tous les produits pharmaceutiques peuvent interférer avec le test LAL, nano-formulations représentent un défi particulier en raison de leur complexité. Le but de cet article est de fournir un guide pratique aux chercheurs inexpérimentés dans l’estimation des endotoxines en nanomatériaux et nanoparticules-formulé des médicaments. Dans les présentes, des recommandations pratiques pour l’exécution de trois formats LAL, y compris la turbidité, épreuve à développement chromogène et essais de gel-caillot sont discutées. Ces tests peuvent servir à déterminer la contamination d’endotoxines dans les médicaments basés sur la nanotechnologie, des vaccins et des adjuvants.

Introduction

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Une endotoxine est un bloc de construction de la paroi cellulaire bactérienne Gram négative1,2. Il peut activer les cellules immunitaires à très faible (picogramme) concentrations1,2. Les médiateurs pro-inflammatoires (cytokines, leucotriènes, eicosanoïdes, etc.) produites par les cellules en réponse à une endotoxine sont responsables de la fièvre, hypotension, hypertension et plus graves problèmes de santé, notamment une défaillance multiviscérale 1 , 2 , 3. la gravité des médiation immunitaire-effets secondaires provoqués par l’endotoxine dépend de sa puissance déterminée par la composition de l’endotoxine et structure et mesurée en unités d’endotoxine international (IUs ou EUs)3. Le nombre de ces unités par kilogramme de poids corporel est utilisé pour définir la dose seuil d’endotoxine pyrogène. Cette dose est que 5 EU/kg pour les médicaments administrés par toutes les voies, mais la voie intrathécale. Les médicaments dosés par mètre carré de surface corporelle, liquides intraoculaires, radiopharmaceutiques et produits administrés via intrathécale route ont une dose seuil différent pyrogène, c'est-à-dire 100 EU/m2, 0,2 UE/mL, EU 175/V (où V est la volume du produit destiné à l’administration) et 0,2 EU/kg, respectivement4. Plus de détails sur la dose seuil de pyrogène pour divers produits pharmaceutiques et dispositifs sont fournies et traitées ailleurs4,5,6.

Animaux varie grandement dans leur sensibilité aux réactions induite par l’endotoxine. Les humains, les primates non humains et les lapins sont parmi les espèces de plus extrêmement sensibles aux endotoxines3. Pour éviter les induite par l’endotoxine des effets secondaires chez les patients et éviter des conclusions inexactes de toxicité préclinique et les études d’efficacité, il est essentiel de correctement détecter et quantifier les endotoxines dans les deux formulations de grade clinique et préclinique. Plusieurs méthodes actuellement disponibles peuvent réaliser cette tâche. L’un d’eux est le test de Limulus Amébocytes Lysate (LAL), qui est couramment utilisé dans le monde entier à l’écran des produits biomédicaux pour l’éventuelle contamination d’endotoxine ainsi quant à détecter des infections bactériennes7,8,9. Le lysat est préparé à partir des amoebocytes, les cellules présentent dans le sang du limule Limulus polyphemus résidant sur la rive est du continent de l’Amérique du Nord,7. Fait intéressant, il y a quelques espèces différentes de limules (Tachypleus gigas et tridentatus Tachypleus) en Asie,10. Le lysat Tachypleus des Amébocytes (TAL) est utilisé dans plusieurs pays d’Asie pour la détection de l’endotoxine semblable à comment la LAL est utilisé dans une autre série de10. Les lysats (LAL et TAL) contiennent un groupe de protéines qui, lors de leur activation, confèrent une activité protéase. Une de ces protéines, le facteur de ce que l'on appelle C est activée au contact de l’endotoxine. C facteur activée Clive facteur B, qui à son tour devient une protéase et fend une enzyme coagulation pro afin de produire une enzyme de la coagulation. Le résultat de cette chaîne de réactions est la formation d’un gel, une augmentation de la turbidité de l’échantillon et, en présence d’un substrat chromogène, l’apparence d’un produit coloré, qui servent de base pour gel-caillot, turbidité et épreuves chromogènes, respectivement. Alors qu’il n’y a aucun format obligatoire de LAL, la Food and Drug Administration (FDA) explique les directives relatives à l’industrie, qu’en cas de divergence dans les résultats entre différents formats LAL, la décision est prise fondé sur l’essai de gel-caillot5 .

Beaucoup utilisés couramment des produits chimiques de laboratoire (p. ex.., EDTA) et essais de médicament connu produits (par exemple, la pénicilline) interfèrent avec la LAL11. L’interférence est habituellement identifiée en évaluant la récupération de l’endotoxine standard dopé à une concentration connue dans une solution contenant la substance d’essai. Si le recouvrement de spike est inférieure à 50 % ou plus de 200 %, puis le résultat de la LAL assay pour la substance d’essai donnée n’est pas valide en raison de l’inhibition ou le développement, respectivement4. Formulations à base de nanotechnologie sont souvent complexes et interfèrent avec la LAL au moyen de divers mécanismes12,13,14. Plusieurs approches ont été décrites pour surmonter l’interférence : reconstitution d’échantillon en tampons spécifiques et des agents tensio-actifs, inactivation des protéines en chauffant, la destruction des lipides à base de matériaux creux en chauffage et en complétant l’échantillon avec excès les cations divalents5,12,13,14,15. Méthodes alternatives pour les situations où l’interférence LAL ne puisse être surmonté ont également été décrits : ELISA, une cellule de journaliste HEK-TLR4 line test et spectrométrie de masse16,17,18, 19.

Dans les présentes, les procédures expérimentales pour tenue de gel-caillot, turbidité et chromogénique LAL dosages sont décrites. Ces tests sont également disponibles sur le laboratoire de caractérisation de nanotechnologie (NCL) site Web20 protocoles STE1.2 (turbidité LAL), STE1.3 (gel-caillot LAL) et STE1.4 (chromogénique LAL). Il est recommandé d’effectuer au moins deux différents formats afin de caractériser la même formulation-nano. Lorsque les résultats de la turbidité et chromogénique LAL sont en désaccord, les résultats de gel-caillot sont considérés5. Lorsque les résultats des deux formats LAL sont en désaccord, autres études utilisant un test d’activation des monocytes (MAT) ou sur lapin pyrogène (RPT) pour vérifier les LAL constatations sont effectué21. Il est important de noter que chaque méthode utilisée pour la détection d’endotoxines et évaluation de pyrogénicité a avantages et limites21,22,23,24. Reconnaissant les limites de la méthode utilisée pour caractériser une formulation donnée nanotechnologie est essentiel pour obtenir une justification scientifique pour l’utilisation de la procédure optimale pour cette nano-formulation.

Dans cette étude, doxorubicine liposomale pégylé a été utilisé comme une préparation de nanoparticules de modèle. Cette formulation a été approuvée par la FDA en 1995 et utilisée pour le traitement du cancer patients dans le monde entier25.

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Protocole

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1. préparation des échantillons de nanoparticules

  1. Préparer l’échantillon étudié dans LAL l’eau de qualité.
  2. Si le pH de l’échantillon est en dehors de la gamme de 6-8, ajuster le pH à l’aide d’hydroxyde de sodium apyrogène ou l’acide chlorhydrique.
  3. À l’aide de LAL l’eau qualité préparer plusieurs dilutions de l’échantillon de l’étude. Assurez-vous que la dilution la plus élevée n’excède pas la dilution valide maximale (MVD). Reportez-vous à la section de discussion pour plus de détails sur l’estimation de la MVD.

2. préparation des réactifs commune entre Formats LAL

  1. Stock d’hydroxyde de sodium concentré dilué l’apyrogène LAL réactif eau pour préparer une solution à une concentration de 0,1 N.
  2. Diluer l’acide chlorhydrique concentré stock apyrogène LAL réactif eau et préparer une solution à une concentration finale de 0,1 N.
  3. Préparation de la commande Standard endotoxine (CST)
    1. Reconstituer le CST selon le certificat d’analyse fournie par le fabricant.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour des remarques importantes concernant les informations fournies dans le certificat. Se référer à la Table des matières pour les détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation donnée de CST dans différents formats LAL.
  4. Préparation du réactif LAL
    1. Reconstituer le réactif LAL selon le certificat d’analyse fournie par le fabricant.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour les détails importants concernant la préparation du réactif LAL. Se référer à la Table des matières pour les détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation de réactif LAL donnée dans différent format LAL.

3. test LAL turbidité

  1. Élaboration des normes d’étalonnage
    1. À partir de 900 µL d’eau grade LAL et 100 µL du CST, préparer des dilutions intermédiaires autant que nécessaire pour permettre la préparation d’une solution étalon avec une gamme de concentrations de 0,001 à 1 UE/mL.
    2. Tout d’abord identifier tubes et ajouter 900 μL d’eau LAL-grade dans chaque tube. Puis ajouter 100 μL de 10 solutionn UE/mL pour préparer l’étalon avec concentration de 1EU/mL.
    3. Répétez les dilutions 10 fois comme décrit ci-dessus pour préparer les trois étalons inférieurs. Vérifiez que les quatre étalons variant de 0,001 à 1 UE/mL ont été préparés.
  2. Préparation des contrôles qualité
    1. Préparer un contrôle de qualité UE/mL 0,05 en combinant 50 µL de la solution de MCS UE/mL 1 950 µL d’eau LAL-grade.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails au sujet de la préparation de la commande.
  3. Préparation des contrôles d’Inhibition et d’amélioration (IEC)
    1. Préparer la CEI avec concentration de 0,05 UE/mL en combinant 25 µL de la solution de MCS UE/mL 1 et 475 µL du nanomatériau test à une dilution donnée.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails.
  4. Procédure expérimentale
    1. Laissez l’instrument pour se réchauffer en le tournant sur environ 30 min à l’avance. Réglage de la longueur d’onde de détection à 660 nm comme il convient pour la turbidité LAL.
    2. Identifiez-vous en tapant le nom d’utilisateur et mot de passe.
    3. Ouvrez le logiciel (Table des matières) en cliquant sur l’icône correspondante sur un écran d’ordinateur.
    4. Sélectionnez collecter les données sur l’écran d’accueil logiciel. Entrez les informations du groupe test ID et des données dans l’espace correspondant dans l’onglet général , sur l’écran d’accueil.
    5. Cliquez sur l’onglet matériel choisir le type d’instrument dans un menu déroulant.
    6. Réglage de la longueur d’onde de détection à 660 nm car c’est approprié pour la turbidité LAL en choisissant la méthode de turbidité LAL.
    7. Vérifiez qu’un numéro de série, les ID système et les informations de port série apparaissent sur l’écran. Cliquez sur OK. Cliquez sur OK une fois de plus pour confirmer.
    8. Entrez l’ID de l’échantillon dans le même ordre que l’échantillon est testé. Utilisez les boutons par défaut pour saisir le témoin négatif, des exemples de courbe et test standard.
    9. Préparer les tubes en double pour chaque échantillon et ajouter 200 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (test ratio 1:1) de contrôle négatif (eau), étalons, contrôle qualité, IEC et test de nanoparticules dans des tubes de verre préalablement marqué.
    10. Ajouter 50 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (ratio 1:1 de test) de LAL réactif à première éprouvette, vortex brièvement à nouveau et insert en test slot dans le carrousel de l’instrument. Si le ratio 1:1 est utilisé, le volume de réactif LAL est de 100 µL.
    11. Répéter la procédure décrite ci-dessus pour les autres échantillons. Processus d’échantillons à la fois.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails.

4. chromogénique LAL

  1. Préparation des étalons
    1. À partir de 900 µL d’eau grade LAL et 100 µL du CST, préparer des dilutions intermédiaires autant que nécessaire pour permettre la préparation d’une solution étalon avec une concentration de 1 UE/mL.
    2. À l’aide d’eau de LAL-grade 900 µL et 100 µL de l’étalon UE/mL 1, préparer un second étalon à une concentration de 0.1 UE/mL.
    3. Répétez les dilutions 10 fois comme décrit ci-dessus pour préparer deux étalons plus bas. Vérifiez que les quatre étalons variant de 0,001 à 1 UE/mL ont été préparés.
  2. Préparation des contrôles de qualité.
    1. Préparer un contrôle de qualité UE/mL 0,05 en combinant 50 µL de la solution de MCS UE/mL 1 950 µL d’eau LAL-grade.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails au sujet de la préparation de la commande.
  3. Préparation des contrôles d’Inhibition et d’amélioration (IEC)
    1. Préparer 0,05 UE/mL en combinant 25 μL de la solution de MCS UE/mL 1 à 475 μL de test nanomatériau.
      Remarque : Reportez-vous à la section « discussion » pour plus de détails.
  4. Procédure expérimentale
    1. Laissez l’instrument pour se réchauffer en le tournant sur environ 30 min à l’avance. Réglage de la longueur d’onde de détection à 405 nm comme il convient pour la turbidité LAL.
    2. Ouvrez le logiciel en cliquant sur l’icône correspondante sur un écran d’ordinateur. Identifiez-vous en tapant le nom d’utilisateur et mot de passe.
    3. Sélectionnez collecter les données sur l’écran d’accueil logiciel. Entrez test ID et des données d’informations de groupe dans l’espace correspondant dans l’onglet général , sur l’écran d’accueil.
    4. Cliquez sur l’onglet matériel choisir le type d’instrument dans un menu déroulant. Le choix de l’instrument.
    5. Vérifiez qu’un numéro de série, les ID système et les informations de port série apparaissent sur l’écran. Cliquez sur OK. Cliquez sur OK une fois de plus pour confirmer.
    6. Entrez l’ID de l’échantillon dans le même ordre que l’échantillon est testé. Les boutons par défaut permet d’entrer le témoin négatif, des exemples de courbe et test standard.
    7. Préparer les tubes en double pour chaque échantillon et ajouter 200 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (test ratio 1:1) de contrôle négatif (eau), étalons, contrôle qualité, IEC et test de nanoparticules dans des tubes de verre préalablement marqué.
    8. Ajouter 50 µL (test ratio 4:1) ou 100 µL (ratio 1:1 de test) de LAL réactif à première éprouvette, vortex brièvement à nouveau et insert en test slot dans le carrousel de l’instrument. Si le ratio 1:1 est utilisé, le volume de réactif LAL est de 100 µL.
    9. Répéter la procédure décrite ci-dessus pour les autres échantillons. Processus d’échantillons à la fois.

5. gel-caillot LAL

Remarque : Ce test identifie la présence d’endotoxines dans l’échantillon basé sur l’observation visuelle et la détection d’un caillot dans le tube de réaction. Les étapes expérimentales sont décrites ci-dessous. Utiliser une feuille de banc pour enregistrer les résultats. Cette feuille de banc n’est pas obligatoire, et les autres façons d’enregistrer les résultats d’analyse sont également acceptables. Un exemple d’une telle feuille de banc est fourni dans les documents complémentaires pour la commodité d’un lecteur. Lambda (l) est la sensibilité de l’essai de gel-caillot et 0,03 UE/mL.

  1. Étiqueter les tubes de réaction autant que nécessaire pour accueillir le nombre d’échantillons analysés. Référer à la fiche de banc pour plus de détails sur le nombre de répétitions utilisé dans l’étape 1, étape 2 et l’étape 3 du dosage.
  2. Aliquote 100 μL d’échantillon de l’eau, des contrôles ou des essais par tube.
  3. Préparer le CST telle que la concentration finale est égale à 4λ.
  4. Mélanger 100 μL de la norme susmentionnée avec 100 μL d’échantillon test ou de l’eau pour atteindre la concentration finale du CST de 2λ. Répétez trois fois plus pour atteindre lambda et moitié-lambda et un quart lambda.
  5. Assurez-vous que la température de l’eau du bain est de 37 ° C.
  6. Ajouter 100 μL de lysat par tube à essai, vortex brièvement et placez la grille avec tous les tubes dans le bain-marie pendant 1 h.
  7. Il faut inverser le tube avec un mouvement souple.
  8. Résultats records manuellement à l’aide de «+» (caillot ferme) ou «-» (pas de caillot ou de caillot lâche) sur la feuille de banc.
  9. Procéder à l’analyse selon l' USP BET 854; utiliser la feuille de banc comme documents justificatifs

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Résultats

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L’exemple de données générées après avoir testé cette formulation lors d’essais de LAL est présenté au tableau 1. Doxorubicine liposomale pégylé a interféré avec chromogénique LAL à dilution 5. Toutefois, cette interférence a été compensée par une plus grande dilution. Récupération de Spike était entre 50 et 200 % lorsque cette formulation a été testée à des dilutions 50 et 500 de turbidité et chromogénique LAL, ainsi qu’à dilution 5 turbidité LAL. Quand rajustés selon le...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les informations fournies dans le présent protocole a été décrit avant15,26 et s’appuie sur plusieurs documents de réglementation publiées par la US Food, Drug Administration (US FDA ou FDA) et United States Pharmacopoeia (USP)4 , 5 , 6 , 27et est également disponible sur le site Web NCL20 protocoles STE1.2 (turb...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude a été financée par des fonds fédéraux de l’Institut National du Cancer, National Institutes of Health, sous contrat HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les vues ou les politiques du département de Health and Human Services, ni mentionne des noms commerciaux, des produits commerciaux, ou organisations impliquent l’approbation par le gouvernement américain.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Turbidité LAL Assay
Hydroxyde de sodiumSigmaS2770Lorsque nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Acide chlorhydriqueSigmaH9892Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
LAL ReagentAssociates of Cape CodT0051Ce réactif peut être utilisé avec la turbidité test uniquement
Contrôle des endotoxines StandardAssociates of Cape CodE0005Ce réactif peut être utilisé avec des dosages de turbidité et de caillot
gel Eau de qualité LALAssociates of Cape CodWP0501Ce réactif peut être utilisé avec n’importe quel format LAL
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Utilisé pour prévenir la réponse faussement positive des bêta-glucanes
Tubes de dilution en verre jetables sans endotoxines 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Ces tubes peuvent être utilisés avec les trois tests
Tubes de réaction en verre jetables sans endotoxines 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100Ces tubes peuvent être utilisés avec des tests de turbidité et chromogènes
Pointes apyrogènes avec des volumes de 0,25 et 1,0 mLRAININPPT25, PPT10Les pointes et les pipettes peuvent adsorber des endotoxines et libérer des substances lixiviables qui interfèrent avec le dosage de la LAL. Ces pointes RAININ sont utilisées car leurs performances optimales dans le test LAL ont été vérifiées et confirmées
Tubes de microcentrifugation apyrogènes, 2,0 mLEppendorf22600044D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Pipette répétéeEppendorf4982000020D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Microcetrifugen’importe quelle marque N’importe quelle marquepeut être utilisée
Réfrigérateur, 2-8 Cn’importe quelle marque N’importe quelle marquepeut être utilisée
Vortexn’importe quelle marqueN’importe quelle marque N’importe quelle marque peut être utilisée
Congélateur, -20 Cn’importe quelle marqueN’importe quelle marque peut être utilisée
Pyros Kinetix ou Pyros Kinetix LecteurFlex Associés de Cape CodPKF96D’autres instruments peuvent être utilisés. Cependant, les réactifs LAL et les étalons d’endotoxines utilisés dans cet essai peuvent nécessiter une optimisation. Lorsque d’autres instruments sont utilisés, veuillez vous référer aux fabricants de l’instrument et du kit LAL pour obtenir des instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL ReagentAssociates of Cape CodCG1500-5Ce réactif est spécifique au test chromogène
Control Endotoxin StandardAssociates of Cape CodEC010Cette norme est différente de celle utilisée pour la turbidité et les LAL à caillots de gel ; il est optimisé pour des performances optimales dans le test chromogène
Hydroxyde de sodiumSigmaS2770Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Acide chlorhydriqueSigmaH9892Lorsque nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Eau de qualité LALAssociates of Cape CodWP0501Ce réactif peut être utilisé avec n’importe quel format LAL
Tampon GlucashieldAssociates of Cape CodGB051-25Utilisé pour prévenir les réponses faussement positives des bêta-glucanes
Tubes de dilution en verre jetables sans endotoxines 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Ces tubes peuvent être utilisés avec les trois tests
Tubes de réaction en verre jetables sans endotoxines 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100Ces tubes peuvent être utilisés avec des tests de turbidité et de
chromogènePointes apyrogènes d’un volume de 0,25 et 1,0 mlRAININPPT25, PPT10Les pointes et les pipettes peuvent adsorber l’endotoxine et libérer des substances lixiviables qui interfèrent avec le dosage LAL. Ces pointes RAININ sont utilisées car leurs performances optimales dans le test LAL ont été vérifiées et confirmées
Tubes de microcentrifugation apyrogènes, 2,0 mLEppendorf22600044D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Pipette répétéeEppendorf4982000020D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Microcetrifugen’importe quelle marque N’importe quelle marquepeut être utilisée
Réfrigérateur, 2-8 Cn’importe quelle marque N’importe quelle marquepeut être utilisée
Vortexn’importe quelle marqueN’importe quelle marque N’importe quelle marque peut être utilisée
Congélateur, -20 Cn’importe quelle marqueN’importe quelle marque peut être utilisée
Pyros Kinetix ou Pyros Kinetix LecteurFlex Associés de Cape CodPKF96D’autres instruments peuvent être utilisés. Cependant, les réactifs LAL et les étalons d’endotoxines utilisés dans cet essai peuvent nécessiter une optimisation. Lorsque d’autres instruments sont utilisés, veuillez vous référer aux fabricants de l’instrument et du kit LAL pour obtenir des instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL ReagentAssociates of Cape CodG5003Ce réactif est spécifique au test gel-caillot
Endotoxin StandardAssociates of Cape CodE0005Ce réactif peut être utilisé avec des tests de turbidité et de caillot de gel
Hydroxyde de sodiumSigmaS2770Lorsque nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Acide chlorhydriqueSigmaH9892Lorsque nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Eau de qualité LALAssociates of Cape CodWP0501Ce réactif peut être utilisé avec n’importe quel format LAL
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Utilisé pour prévenir les réponses faussement positives des bêta-glucanes
Tubes de dilution en verre jetables sans endotoxines 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Ces tubes peuvent être utilisés avec les trois tests
Tubes de réaction en verre jetables sans endotoxines 10 x 75 mmAssociates of Cape CodTS050Ces tubes sont destinés à être utilisés avec le test gel-caillot
Pointes apyrogènes sans apyrogènes avec des volumes de 0,25 et 1 mLRAININPPT25, PPT10Les pointes et les pipettes peuvent adsorber l’endotoxine et libérer des substances lixiviables qui interfèrent avec le dosage LAL. Ces pointes RAININ sont utilisées car leurs performances optimales dans le test LAL ont été vérifiées et confirmées
Tubes de microcentrifugation apyrogènes, 2,0 mLEppendorf22600044D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Pipette répétéeEppendorf4982000020D’autres alimentations équivalentes peuvent être utilisées
Microcetrifugen’importe quelle marqueN’importe quelle marque peut être utilisée
Réfrigérateur, 2-8 Cn’importe quelle marqueN’importe quelle marque peut être utilisée
Vortexn’importe quelle marqueN’importe quelle marque
Congélateur, -20 Cn’importe quelle marque N’importe quelle marquepeut être utilisée
Bain-marie, 37 Cn’importe quelle marqueN’importe quelle marque peut être utilisée, cependant, il est important soit de désactiver la circulation de l’eau, soit d’utiliser un bain-marie non circualtif, car le débit d’eau affectera la formation de caillots et entraînera des résultats faussement négatifs
de Control peut être utilisée

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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