Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Md A. Hakim; Erik J. Behringer

doi:10.3791/58832

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Article de méthode

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

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DOI :

10.3791/58832

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20 janvier 2019

Md A. Hakim¹ , Erik J. Behringer¹

¹Department of Basic Sciences, Loma Linda University

Dans cet article

Résumé

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Résumé

Artères cérébrales et leur respectif microcirculation livrent l’oxygène et des nutriments à la régulation du débit du cerveau via le sang. Les cellules endothéliales ligne la lumière des vaisseaux sanguins et les modifications de la commande de diamètre vasculaire au besoin pour répondre à la demande métabolique des neurones. Principales voies de signalisation dépendant de l’endothélium de l’Hyperpolarisation du potentiel de membrane (V_m) et l’oxyde nitrique fonctionnent généralement en parallèle de médiation une vasodilatation et d’augmenter ainsi la circulation sanguine. Bien que partie intégrante de la coordination de vasodilatation au cours de plusieurs millimètres de longueur vasculaire, les composants de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (EDH) ont été historiquement difficiles à mesurer. Ces composants d’EDH entraînent intracellulaire Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_j’ai augmente ainsi que l’activation subséquente de petit - et intermédiaires conductance Ca^{2 +}-activé K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canaux.

Nous présentons ici une illustration simplifiée de l’isolement des frais endothélium des artères cérébrales de souris ; mesures simultanées d’endothéliales [Ca^{2 +}]_iet V_m par photométrie Fura-2 et électrodes pointus intracellulaires, respectivement ; et une superfusion continue de solutions salines et des agents pharmacologiques dans des conditions physiologiques (pH 7,4, 37 ° C). Les artères cérébrales postérieures de la cercle de Willis sont supprimés sans le communiquer postérieur et les artères basilaires. Il facilite digestion enzymatique des segments postérieurs nettoyés d’artériels cérébrales et la trituration subséquente de l’adventice, nerfs périvasculaires et des cellules musculaires lisses. Qui en résulte postérieures cérébrales artérielles endothéliales « tubes » sont ensuite fixés sous un microscope et examinés à l’aide d’une caméra, tube photomultiplicateur, et un ou deux électromètres sous superfusion continue. Collectivement, cette méthode permet de mesurer simultanément variations endothéliales [Ca^{2 +}]_i et V_m dans des endroits discrets cellulaires, en plus de la diffusion de l’EDH par l’intermédiaire de jonctions jusqu'à des distances de millimètre le long de l’intact endothélium. Cette méthode est censée produire une analyse de haut-débit des fonctions endothéliales cérébrales qui sous-tendent les mécanismes de régulation du débit sanguin dans le cerveau normal et malade.

Introduction

Le débit sanguin dans le cerveau est réglementé par la coordination de la vasodilatation des artères cérébrales et les artérioles dans réseaux vasculaires¹. Cellules endothéliales tapissant de résistance cérébral artères commande changements de diamètre vasculaire au besoin afin de répondre à la demande métabolique des neurones¹^,²^,³. En particulier, au cours de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (communément appelé EDH), intracellulaire Ca^{2 +}([Ca^{2 +}]_i) et signalisation électrique dans les cellules endothéliale....