Ici, nous présentons un protocole visant à préparer les cellules individuelles de thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate afin d’étudier ces cellules à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce protocole a été utilisé pour la détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs utilisant l’écoulement cytometry.
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Article de méthode
Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux
Dans cet article
Résumé
Résumé
Notre système immunitaire se compose d’un nombre et une variété de cellules immunitaires, dont les lymphocytes T régulateurs de cellules (Treg). Les cellules Treg peuvent être divisés en deux sous-ensembles, les cellules Treg (tTreg) dérivées du thymus et accessoirement induite par les cellules Treg (pTreg). Elles sont présentes dans les différents organes de notre corps et se distingués par des marqueurs spécifiques, tels que Hélios et Neuropiline 1. Il a été signalé que les cellules tTreg sont fonctionnellement plus répressive que les cellules pTreg. Par conséquent, il est important de déterminer la proportion des cellules tTreg et pTreg dans les enquêtes sur les populations de cellules hétérogènes. Ici, nous avons recueilli glandes du thymus, ganglions lymphatiques de drainage pancréatiques et rate de normoglycémiques souris diabétiques non obèses pour distinguer les cellules de tTreg de pTreg des cellules à l’aide de cytométrie en flux. Nous avons préparé manuellement des suspensions de cellules simples de ces organes. Fluorochrome conjuguées de surface CD4, CD8, CD25 et Neuropiline 1 anticorps ont été utilisés pour colorer les cellules. Ils étaient conservés dans le réfrigérateur pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été colorées avec les anticorps de Foxp3 et Helios intracellulaires fluorochrome conjugué. Ces marqueurs ont été utilisées pour caractériser les deux sous-ensembles de cellules Treg. Ce protocole montre un moyen simple mais pratique pour préparer des cellules individuelles de thymus murin, drainage des ganglions lymphatiques et la rate pancréas et utilisez-les pour cytométrie ultérieures.
Introduction
Les lymphocytes T (Treg) régulateurs sont critiques pour l’homéostasie du système immunitaire. Les cellules Treg sont définies par l’expression des antigènes de surface CD4 et CD25 et le facteur de transcription forkhead boîte P3 (Foxp3)1,2,3. Tout d’abord, Sakaguchi et coll. ont montré que CD25 est constitutivement exprimé sur les cellules T suppresseur souris4, qui prévoit une observation pionnier pour l’identification des cellules Treg humaines. Les cellules Treg jouent un rôle central dans la tolérance immunitaire, en exerçant une capacité suppressive par l’intermédiaire de divers mécanismes, y compris une cytolyse par le biais de la sécrétion de granzymes pour induire l’apoptose, la consommation de cytokine et l’inhibition par le biais de l’expression des cytotoxiques Lymphocytes T antigène 45. En outre, ils peuvent sécréter des cytokines inhibitrices comme transformant le facteur de croissance bêta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) et IL-355. Les cellules Treg peuvent naturellement être dérivés du thymus, auquel cas ils sont désignés les cellules Treg (tTreg) dérivées du thymus, ou ils peuvent être induites dans les organes périphériques, dans ce cas sont appelés périphériquement induite par les cellules Treg (pTreg).
PTreg cellules6et Helios, un membre de la famille de facteur de transcription Ikaros, a été signalé comme un marqueur pour distinguer les cellules tTreg. Plus tard, deux autres groupes ont déclaré que Neuropiline 1 (Nrp1), un récepteur III sémaphorines, pourrait servir de marqueur de surface pour tTreg cellules sous certaines conditions,7,8. Néanmoins, Singh et coll. ont montré que les Helios est un meilleur marqueur dans ce contexte de souris naïves9.
Les sous-ensembles de cellules Treg jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du système immunitaire et dans la protection contre l’auto-immunité et l’infection. Par conséquent, il est important de déterminer le nombre et la proportion de ces populations dans les tissus lymphoïdes et non lymphoïdes. Pour y parvenir, il faut préparer des suspensions de cellules simples de ces organes. Un certain nombre de protocoles ont été décrit ou utilisé dans des études antérieures. Principalement, dissociators automatiques ont été utilisées dans des rapports publiés antérieurement10,11. L’utilisation de dissociators automatiques est pratique et gain de temps, mais c’est une procédure coûteuse. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode manuelle pour préparer des suspensions cellulaires unique des glandes du thymus murins, les ganglions lymphatiques de drainage pancréatiques (PDLNs) et les rates de normoglycémiques non-obèses diabétiques (NOD) souris et isolé des cellules individuelles de ces organes. Cette méthode a été utilisée dans nos études précédentes et nous avons trouvé que la méthode manuelle pour préparer la suspension cellulaire unique est aussi efficace que dissociator automatique méthode9,12,13,14. En outre, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour déterminer les proportions de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules et les sous-ensembles de Treg cellules tTreg et pTreg. Les cellules tTreg et pTreg ont été distingués au moyen de Helios et Nrp1 comme marqueurs de cellule tTreg. Par conséquent, nos résultats indiquent que la méthode manuelle pour préparer les cellules individuelles ne fonctionne efficacement et les suspensions préparée seule cellule permet davantage d’études utilisant l’écoulement cytometry.
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Protocole
Le comité local d’éthique animale à l’Université d’Uppsala a approuvé l’expérimentation animale.
1. récolte d’organes d’animaux
- Sacrifier les souris par dislocation cervicale.
- Placez du thymus glandes et rate en flacons de 20 mL à scintillation ou tubes coniques 15 mL contenant 5 mL de Hanks´ équilibré de solution saline (HBSS). PDLNs lieu de micro-tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de milieu RPMI 1640. Utilisez le thymus entier et rate et tous les PDLNs.
Remarque : Organes devraient être gardés sur glace tout au long de la procédure et l’enquêteur doit essayer d’être rapide lors de la préparation des suspensions de cellules simples, surtout lors de la manipulation des tissus thymique puisque les cellules immunitaires du thymus peuvent être rapidement dégradées à des températures élevées.
2. seule cellule isolement du Thymus et la rate
- Serrez soigneusement le thymus et la rate avec une paire de pincettes pour libérer les cellules immunitaires. Jeter la capsule du thymus et de la rate restante.
- Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C pour former une boulette. Jeter le surnageant.
- Pour lyser les globules rouges, les remettre en suspension la suspension cellulaire dans 5 mL de 0,2 M NH4Cl et incuber à température ambiante pendant 10 min. inverser les tubes envers doucement chaque 2 min. ajouter 5 mL de HBSS à la fin de l’incubation pour arrêter la lyse.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de HBSS. Remplissez les tubes avec HBSS.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de HBSS. Remplissez les tubes avec HBSS.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 5 mL de HBSS pour thymus et 10 mL pour la rate.
- Transférer 1 mL de la suspension de cellules thymiques et 500 µL de la suspension de cellules spléniques à 5 mL autour des tubes du bas avec des bouchons de tamis cellulaire. Appliquer la suspension cellulaire sur les bouchons de tamis cellulaire.
Remarque : Une maille en nylon de 35 µm est incorporée dans le bouchon. Environ 5 millions de cellules ont été prélevés dans chaque tube.
3. seule cellule isolement de PDLN
- Placer un grillage métallique de 250 µm stérile sur un tube conique de 15 mL dans un rack. Rincer la maille avec 1 mL de milieu RPMI.
- Transférer les ganglions lymphatiques dans la maille en métal et moudre à travers les mailles à l’aide d’une paire de pincettes. Appliquer 1 mL de milieu RPMI sur le treillis métallique afin d’éliminer les cellules dans le tube. Répéter 3 fois plus et retirer le maillage.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de RPMI. Remplissez les tubes avec RPMI.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de RPMI. Remplissez les tubes avec RPMI.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 2 mL de RPMI. Transfert 2 mL de la suspension cellulaire à 5 mL autour des tubes du bas avec des bouchons de tamis cellulaire. Appliquer la suspension cellulaire sur les bouchons de tamis cellulaire.
4. cytométrie en flux
- Centrifuger les suspensions de cellules du thymus, PDLN et la rate à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Colorer les cellules avec les anticorps de surface suivants dans 100 µL de cytométrie en souillant la mémoire tampon (buffer FACS) : 0,75 anticorps µg/100 µL conjugué FITC CD4, de 0,60 µg/100 µL CD8 APC-H7-conjugués anticorps, anticorps 0,30 µg/100 µL conjugué PE CD25, 5 µL (01:20) APC-conjugués anticorps Nrp1. Incuber les tubes sur la glace pendant 40 min.
- Ajouter 200 µL de tampon de FACS dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Répéter une fois de plus.
- Difficulté et permeabilize les cellules par resuspendant le culot cellulaire dans 500 µL de tampon de Fixation perméabilisation (PFB).
Remarque : PFB est préparé en mélangeant 1 partie de Fixation/perméabilisation concentré avec 3 parties de Fixation/perméabilisation diluant. - Garder les tubes au réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit.
Remarque : Une incubation de 1 h fonctionne également. - Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de lavage perméabilisation (PTB). Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
Remarque : PWB est préparé en diluant la perméabilisation tampon (10 x) à 01:10 dans de l’eau distillée. - Colorer les cellules avec les anticorps intracellulaires suivants dans 100 µL de PWB : 0,30 anticorps µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-conjugués, anticorps conjugué PacificBlue Helios 4 µL (01:25). Incuber les tubes sur la glace pendant 1 h.
- Ajouter 500 µL de PWB dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 500 µL de PWB. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 300 µL de tampon de FACS.
- Analyser les cellules sur un cytomètre en flux.
- Porte les cellules unique basés sur Scatter-zone latérale, hauteur et largeur et Forward Scatter-zone, hauteur et largeur. Organiser des événements 1 million pour l’analyse.
- Exporter les fichiers FCS d’expériences et les analyser à l’aide d’un logiciel d’analyseur de cytométrie en flux.
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Résultats
Pour étudier l’expression des Nrp1 et Helios sur les cellules tTreg et pTreg, nous avons préparé des cellules individuelles de glandes thymiques, PDLNs et la rate des souris NOD normoglycémiques et eux colorées avec les marqueurs de cellules Treg CD4, CD25 et Foxp3, Helios Nrp1 pour la cytométrie en flux analyse. Les résultats ont été analysés comme le montre le représentant gating stratégies (Figure 1). Nous avons constaté que la proportion de cellules Helio...
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Discussion
Dans cette étude, nous avons isolé des cellules individuelles de glandes thymiques, des PDLNs et des rates de souris NOD et examiné l’expression d’Hélios et Nrp1 CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules à l’aide de cytométrie en flux. Dans la présente étude, des souris NOD ont été utilisés, qui est un modèle murin de diabète de type 1. Dans une étude précédente, nous avons utilisé le type sauvage souches de souris CD-1 et les souris C57BL/6 pour étudier si Helios ou Nrp1 est un meille...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
La présente étude a été soutenue financièrement par le Conseil de recherche suédois, EXODIAB, la fondation suédoise de diabète, le fonds suédois pour les diabète enfant, SEB Diabetesfonden et O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Auteurs aimeraient aussi Merci Per-Ola Carlsson et Stellan Sandler pour leurs supports et leurs discussions.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| NOD souris Panure | maison | ||
| HBSS | Statens veterinä ; rmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contient un concentré de fixation/perméabilisation, un diluant de fixation/perméabilisation et un tampon de perméabilisation (10x) |
| eBioscience Tampon de coloration par cytométrie en flux | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| Anticorps monoclonal CD4 (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| Anticorps monoclonal CD25 (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen ; APC-H7 Rat anti-souris CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Souris Neuropiline-1 APC-conjugué Anticorps | R& D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Anticorps monoclonal (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Bleu Pacifique Anticorps Helios BioLegend | 137220 | ||
| Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre cellulaire Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µ ; m maille de nylon est incorporée dans le capuchon à pression à double position |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Microtube 1,5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Flacons à scintillation jetables | WHEATON | ||
| Cytométrie en flux | BD | ||
| Logiciel d’analyse par cytométrie en flux | Inivai Technologies | Flowlogic |
Références
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- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
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- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
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- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
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Réimpressions et autorisations
