Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Résumé

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E¹³ souris embryon ganglionnaire.

Résumé

Les cellules souches neurales (CNS) sont multipotentes et peut donner lieu à trois types cellulaires majeurs du système nerveux central (CNS). La culture in vitro et l’expansion des CNS fournissent une source appropriée de cellules pour les chercheurs en neurosciences étudier la fonction des neurones et des cellules gliales ainsi que leurs interactions. Il existe plusieurs techniques signalés pour isoler des cellules souches neurales du cerveau mammifère adulte ou embryonnaire. Pendant l’opération microchirurgie pour isoler des CNS de différentes régions du SNC embryonnaire, il est très important réduire les dommages au cerveau des cellules pour obtenir le taux élevé de cellules souches vivantes et extensibles. Une technique possible pour la réduction du stress au cours de l’isolement de ces cellules du cerveau d’embryon de souris est la réduction du temps chirurgical. Ici, nous démontrons une technique mise au point pour l’isolement rapide de ces cellules de l’éminence E¹³ souris embryon ganglionnaire. Procédures chirurgicales incluent récolte d’embryons de souris¹³ E de l’utérus, coupant la fontanelle frontale de l’embryon avec une pointe d’aiguille tordue, extraire le cerveau du crâne, microdissection du cerveau isolé de récolter l’éminence ganglionnaire, dissociation du tissu récolté dans le milieu du NSC pour obtenir une suspension de cellules du même et enfin électrodéposition de cellules en suspension pour générer des neurospheres.

Introduction

Des cellules souches neurales (CNS) résident dans différentes régions du cerveau adulte et de l’embryon, et ils ont tendance à générer différents types de neurones et cellules gliales¹. Les zones sous-ventriculaire dans le cerveau des mammifères adultes² et éminence ganglionnaire dans le cerveau de l’embryon sont NSC riches régions³. Dans le développement du cerveau, l’éminence ganglionnaire fournit la plupart des interneurones corticaux et particulièrement GABAergique interneurones³. Il y a aussi des méthodes moins invasives pour la production de cellules souches neurales ....

Protocole

Toutes les chirurgies et les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de l’éthique animale de l’Institut de Royan, Téhéran, Iran.

1. préparation des Instruments chirurgicaux, lavage tampon (HEPES-MEM), milieux de Culture cellulaire et plaques de Culture cellulaire

1. Stériliser les instruments chirurgicaux (ciseaux, poignée de lame de bistouri Swann-Morton et forceps) par autoclavage en fonction sur les lignes directrices de stérilisation systématique.
2. Préparer un volume suffisant de tampon HEPES-MEM (environ 100 mL est suffisant pour chaque souris gravides). Ajouter des concentrations élevées d’antibioti....

Résultats

Micro-Dissection, l’isolement de cellules et Culture Neurosphère. Ici, nous avons présenté une méthode rapide et efficace pour la souris E¹³ cerveau microchirurgie et isolement des cellules souches neurales. Cet article montre qu’il est possible d’enlever tout le cerveau d’un crâne d’embryon de souris E¹³ à travers une rupture fine à fontanelle frontale. Avec cette méthode, le cerveau subit moins de dégâts et il est possible d’isoler des cellules pro.......

Discussion

À l’aide d’une source de cellules souches neuronales est très important pour les chercheurs en neurosciences. Des cellules souches neurales pourraient être récoltés de différentes zones du cerveau de l’embryon et qu’ils peuvent générer des types spécifiques de neurones et les cellules gliales. Il existe plusieurs méthodes pour l’induction de la différenciation des cellules souches neurales de les amener à générer des neurones matures et les cellules gliales. Il y a de nombreux rapports indiquant que dans des conditions d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de 15 mL	Falcon	352097
Tubes de 50 mL	Falcon	352235
Adson Pince, 12 cm, Droite	WPI	14226
B27	Gibco	17504-44
bFGF	Sigma	F0291
albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	A2153
plat 10cm  ;	Pince	à
, 12,5 cm, Pince à épiler droite	WPI	15908
Dumont, 11 cm, Droite	WPI	500342
EGF	Sigma	E9644
Ethanol	Merck	100983  ;
Glutamate	Sigma  ;	G3291
Glutamax	Gibco	35050061
chèvre anti lapin FITC anticorps secondaire conjugué	Sigma	AP307F
sérum de chèvre	Sigma	G9023
Héparine  ;   ;	Sigma	h3149
HEPES	Sigma	83264
HEPES	Sigma	90909C
seringue d’insuline avec aiguille de calibre 25-27  ;	SUPA médical	A1SNL127
laminine	sigma  ;   ;   ;	L2020
MEM	Sigma	M2279
N2 supplément	Gibco	17502048
NB moyen	Gibco	21103-31
Acide aminé non essentiel (NEAA)	Gibco	11140050
PBS sans Ca et Mg	Gibco	20012050
Péniciline/ Streptomycine	Gibco	5140122
Poly-L-ornithine	Sigma	; P4957
lapin anti souris bêta tubuline-III anticorps	Sigma	T2200
lapin anti souris GFAP anticorps	Sigma	G4546
lapin anti souris Nestin anticorps	Sigma	N5413
Scalpel Manche #3	WPI	500236
Ciseaux courbe	WPI	14396
Ciseaux pointus droits	WPI	14192
Inhibiteur de la trypsine de soja	Roche	10109886001  ;
Fioles de culture tissulaire, T25	BD	353014
Fioles de culture tissulaire, T75	BD	353024
Tween 20	Sigma	P1379
Ciseaux Vannas,  ; 8 cm, Droits  ;	WPI	14003
&beta ;-mercaptoéthanol	Sigma	M6250

pansement Falcon 353003