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Article de méthode

Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay

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DOI :

10.3791/58891

⸱

7 janvier 2019

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Dans cet article

Résumé

Mesure de la capacité de l’efflux de cholestérol in vitro de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur comme biomarqueur d’athérosclérose. Dans la présente étude, nous optimiser et uniformiser une méthode d’efflux de cholestérol NBD fluorescente et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.

Résumé

L’athérosclérose entraîne des maladies cardiovasculaires (MCV). On ignore encore si la concentration de cholestérol-HDL (cHDL) joue un rôle causal dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, un facteur important dans les premiers stades de la formation de plaques d’athérome est capacité de l’efflux de cholestérol HDL (la capacité des particules HDL à accepter le cholestérol des macrophages) afin d’éviter la formation de cellules de mousse. Il s’agit d’une étape clé en évitant l’accumulation de cholestérol dans l’endothélium et une partie du transport du cholestérol inverse (RCT) à éliminer le cholestérol par le foie. Capacité de l’efflux de cholestérol de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur qui peut être utilisé comme biomarqueur d’athérosclérose. Traditionnellement, [3H]-cholestérol a été utilisé lors d’essais de l’efflux de cholestérol. Dans cette étude, notre objectif est d’élaborer une stratégie plus sûre et plus rapide à l’aide de fluorescent étiquetés-cholestérol (NBD) lors d’un test cellulaire de retracer le processus de captation et l’efflux de cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1. Enfin, optimiser et uniformiser la méthode de l’efflux de cholestérol NBD et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.

Introduction

Selon l’organisation mondiale de la santé, les cours principales causes de décès dans le monde sont les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux (représentant un total de 15,2 millions de décès)1. Les deux sont des maladies cardiovasculaires (MCV) qui peuvent être précédées de l’athérosclérose et la rupture des plaques d’athérome dans les vaisseaux sanguins2,3.

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire de mur du navire dans laquelle macrophages, lymphocytes T, cellules de mât et les cellules dendritiques infiltrent l’endothélium et s’accumulent dans le sang, formant éventuellement les plaques d’athérome. Les plaques d’athérosclérose présentent un lipide cristaux cœur et cholestérol, attestées par des mesures de l’échographie mode B haute résolution de la carotide intima média épaisseur4,5. Dans les macrophages, efflux de cholestérol vers des particules lipidiques accepteur est effectué par des moyens des récepteurs ATP binding cassette (ABC) ABCA1, ATP binding cassette membre du subfamily G 1 (ABCG1) et le récepteur éboueur SR-BI. Le déséquilibre des influx de cholestérol et l’efflux dans les macrophages est considéré comme un processus clé de l’athérosclérose initiation6. Efflux de cholestérol est considéré comme une étape clé dans l’élimination du cholestérol des tissus périphériques au plasma et le foie dans un processus appelé transport du cholestérol inverse (RCT). Cholestérol est transférée de macrophages principalement d’apolipoprotéine A1 (ApoA1) dans la surface des particules de lipoprotéines de haute densité (HDL). Puis le transport HDL cholestérol vers le foie pour l’excrétion et réutilisation7,8,9.

Traditionnellement, cholestérol radiomarqué de tritium (3H) a été utilisé dans l’efflux de cholestérol10. Le signal d’émission de radioisotopes est hautement sensible10; Cependant, cholestérol radiomarqué présente des handicaps évidents tels que les protocoles longs, risque d’exposition aux rayonnements ionisants et la nécessité de radioactivité spécial installations et le matériel assurer une manipulation sûre des émissions radioactives. Au contraire, la fluorescence a été avec succès incorporé dans des techniques de diagnostic en raison de sa simplicité dans la détection de signal fluorescent, la grande variété des fluorophores disponibles et sa sécurité11. Plusieurs des stérols fluorescentes marquées ont été utilisés pour étudier le métabolisme du cholestérol notamment dehydroergosterol (avec fluorescence intrinsèque), cholestérol dansyl, 4,4-difluoro-3 a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - cholestérol et 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-cholestérol). En particulier, NBD-cholestérol présente une absorption efficace dans les cellules humaines12. Deux différentes NBD étiquetés-cholestérol n’est actuellement disponible : 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) et 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-jour ouvrable suivant ; La figure 1). Cholestérol marqué avec portion de 22-NBD peut mieux à des études de l’efflux de cholestérol, tandis que 25-NBD-cholestérol est principalement utilisé dans la membrane cellulaire dynamique recherche13,14.

Lignées cellulaires généralement utilisées dans les essais de l’efflux de cholestérol in vitro sont des cellules de type monocyte comme des cellules THP-1 leucémie-dérivé humaines, murines Raw 264.7 cellules15ou J774.1. Toutes ces cellules se différencient en macrophages in vitro à l’aide de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), mais les macrophages dérivés du THP-1 (dmTHP-1) mieux reflètent et imitent les macrophages humains16.

Dans la présente étude, nous avons optimiser et uniformiser une méthode fluorescente de haut débit afin de déterminer la capacité de l’efflux de cholestérol du sérum sur dmTHP-1, à l’aide de 22-NBD-cholestérol comme une alternative à la [3H]-cholestérol. En outre, nous comparons la technique fluorescente optimisée avec l’analogue radioactif standard.

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Protocole

Pour cette étude, l’approbation du comité de l’éthique (Comitè Ètic d' recherche clinique, clinique de l’hôpital, Barcelone ; numéro d’homologation HCB/2014/0756) et le consentement écrit et informé de tous les sujets ont été obtenus.

1. NBD-cholestérol préparation

  1. Dissoudre le NBD-cholestérol (MW 494.63 ; voir Table des matières) dans l’éthanol pur pour obtenir le stock (2 mM). Pour un flacon de 10 mg, dissoudre le contenu de la fiole entière dans un volume de 10,1 mL d’éthanol pour obtenir un stock de 2 mM.
  2. Diluer le NBD-cholestérol du stock en RPMI 1640 additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 5 % la pénicilline/streptomycine (R10 moyen) pour atteindre une concentration finale de 5 μM (p. ex., obtenir 10 mL de NBD-cholestérol à concentration finale de 5 μM) par diluer 25 μL de stock NBD-cholestérol (2 mM) dans un milieu R10. Ce volume est suffisant pour une plaque à 96 puits.

2. cell Culture and Seeding (jour 2)

  1. Cellules THP-1 de culture dans un milieu R10 à 37 ° C, 5 % de CO2. Ajuster à 0,3 x 106 cellules/mL tous les 3 jours.
  2. Graine de cellules dans une plaque à 96 puits blanche avec un fond plat, verni à 0,2 x 106 cellules/puits dans le milieu R10 (100 μL / puits).
  3. Traiter les cellules avec 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA, d’un stock de 10 μM) pour 48 à 72 h, en incubation à 37 ° C, 5 % de CO2 pour différencier les THP-1 cellules en dmTHP-1.
    Remarque : Il est recommandé d’utiliser 5 μL de stock PMA (10 μM) dans 500 μl de milieu de R10. Avant cela, préparer un 10 μM stock PMA en dissolvant un flacon lyophilisé 1 g dans 10 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), aliquot et stock à-20 ° C.
  4. Sinon (suggestion) combine les étapes 2.2 et 2.3 pour meilleure homogénéisation. Préparer 10 mL de cellules THP-1 dans un tube de 15 mL, ajouter 200 μl de stock PMA (10 μM), mélanger doucement et amorcer immédiatement 100 μL / puits, sur la plaque. Incuber les cellules comme indiqué au point 2.3.

3. apolipoprotéine B appauvri sérum (constructeurs-distributeurs autorisés) préparation (jour 2 ou 3)

  1. Pour préparer une solution de polyéthylène glycol (PEG), diluer la glycine dans du PBS de 10 % (avec stérile H2O) à une concentration de 200 mM à pH 7,4. Ajouter 40 mL de glycine de 200 mM pour 10 g de PEG 8000 pour obtenir PEG 20 % (p/v). Mélanger la solution vigoureusement pour homogénéiser.
  2. Appliquer 4 pièces 20 % PEG par 10 parties de sérum/plasma sur chaque échantillon dans un tube de 1,5 mL de sérum/plasma et laisser le mélange sur la glace pour 25 min17 (p. ex., 40 μL de 20 %, ajouter 100 μL de sérum, le plasma ou le PEG solution).
  3. Centrifuger le précipité PEG-apolipoprotéine B à 13 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  4. Éliminer le précipité. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
    Remarque : Nous vous suggérons de préparer les constructeurs-distributeurs autorisés le jour 3 (frais). S’il n’est pas possible, préparer les constructeurs-distributeurs autorisés au jour 2 et gardez-le toute la nuit à 4 ° C.

4. NBD-cholestérol cellulaire chargement (jour 2)

  1. Jeter le milieu de culture du dmTHP-1 et laver les cellules deux fois avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Charger les cellules avec 5 μM NBD-cholestérol (100 μL / puits) dans un milieu R10 et incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.

5. l’incubation avec cholestérol accepteurs (jour 3)

  1. Jeter le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS.
  2. Incuber les cellules avec des constructeurs-distributeurs autorisés de 2 à 5 % ou la concentration désirée d’accepteur de lipides purifiés (HDL, ApoA, ApoE, etc) en dilution dans un milieu RPMI 1640 incolore (100 μL / puits) 4 – 6 h à 37 ° C.
    NOTE : Inclure un contrôle négatif (C-) consistant en incolore milieu RPMI 1640 sans accepteurs et un témoin positif (C +) (p. ex., constructeurs-distributeurs autorisés d’un bassin de donneurs sains) ou HDL purifiée. Note que le contrôle positif s’applique en particulier lorsque les échantillons de patients (pathologiques) sont analysés (supplémentaire Figure 1).
  3. Préparation d’un stock de 200 mL de la solution de lyse cellulaire 1 (tampon Tris de 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). Le ratio de solution 1 à 1:1 (v : v) de lyse cellulaire se mêlent l’éthanol pur pour obtenir la solution de lyse 2.

6. Capture de Signal fluorescent (jour 3)

  1. Détection de média NBD-cholestérol
    1. Retirer le milieu cellulaire des plaques et il récupérer dans une nouvelle plaque 96 puits blanche avec un fond plat opaque.
    2. Pour une détection de signal de fluorescence optimale dans les échantillons de médias, ajouter 100 μL d’éthanol pur à 100 μL de chaque échantillon moyen pour obtenir un ratio de 1:1 dans la plaque 96 puits blanc.
    3. Maintenir la plaque avec les médias traités d’autre mesure l’intensité de fluorescence (FI), à une longueur d’onde de 463⁄536 nm (excitation/émission) sur le luminomètre.
  2. Détection de NBD-cholestérol intracellulaire
    1. Laver les cellules deux fois avec du PBS.
    2. Pour obtenir le taux de cholestérol intracellulaire, lyser les cellules en incubant eux avec 100 μL de solution de lyse 2 / puits et secouer la plaque à température ambiante (RT) pendant 25 min.
    3. Pour une détection de signal de fluorescence optimale dans les échantillons de lysat cellulaire, capturer l’intensité de la fluorescence des lysats cellulaires dans le même blanc plaque à 96 puits avec fond clair plat (la même plaque dans laquelle les cellules ont été ensemencés à l’étape 2.2).
  3. 6.3 mesurer l’intensité de fluorescence (FI) dans le luminomètre tout en ajustant le paramètre de sensibilité à 50 dans le logiciel (voir Table des matières).

7. analyse des résultats

  1. Exprimer le taux d’efflux de cholestérol d’un échantillon en pourcentage calculé par la formule suivante :
    figure-protocol-1
  2. Obtenir la dernière mesure d’efflux de cholestérol (EC) en soustrayant de la CE du contrôle négatif (échantillon chargé avec NBD-cholestérol mais incubés avec incolore milieu RPMI 1640, sans accepteurs de cholestérol) de la CE du a donné des échantillons :
    figure-protocol-2

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Résultats

Le but de l’essai de l’efflux de cholestérol est de déterminer in vitro la capacité de l’efflux de cholestérol d’une donnée de sérum, le plasma ou surnageant contenant des particules HDL. La méthode consiste à charger cholestérol marqué dans une culture d’une lignée de cellules macrophages standard et induisant des contact avec l’échantillon dilué dans des milieux sans FBS avec les cellules. Enfin, les niveaux fluorescents de la NBD sont mesurés dans les médias et le lysat cellulaire. Pour optimiser les mesures, le chole...

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Discussion

Cholestérol marqué fluorescent est une stratégie prometteuse pour analyser et étudier les propriétés et le métabolisme du cholestérol naturel in vitro. Ses principaux avantages sont qu’il peut être absorbé par les cellules, permettant l’intracellulaire et étude de membrane de diffusion et peut être appliqué à des épreuves de l’efflux de cholestérol comme dans ce protocole (Figure 7). Certains stérols fluorescentes marqués permettent de cholestérol suivi in vitro y compris BODIPY-cholestérol,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs souhaitent déclarer qu’ils sont les inventeurs de la demande de brevet (EPO, 18382337.6-1118 ; 17 mai 2018) intitulé « Méthode pour déterminer l’efflux de cholestérol » basée sur cette méthode.

Remerciements

Ce travail a été partiellement soutenu par la subventions de recherche FIS (PS12/00866) d’Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espagne ; El de Fondo Europeo para Desarrollo régional (FEDER) ; Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) et Programme de CERCA / Generalitat de Catalunya. Les auteurs remercient la rétrovirologie et laboratoire d’immunopathologie virale de l’Institut d'Investigacions Biomèdiques août Pi I Sunyer (IDIBAPS). Nous remercions Escribà T., c. Rovira et C. Hurtado pour leur aide et S. Cufí de la connaissance et le bureau de transfert de technologie pour son orientation dans la protection de l’invention.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque collectrice à 96 puitsCorning IncCostar 3912Plaque blanche à 96 puits avec fond transparent opaque
Plaque de culture à 96 puitsCorning IncCostar 3610Plaque blanche à 96 puits avec fond plat et transparent
Trousse de dosage de l’efflux de cholestérol (à base de cellules)Abcamab196985commercial à haut débit à base de cellules visant à déterminer le efflux de cholestérol
incolore RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 sans pehnol-red
Logiciel d’analyse de données Gen5BioTekVersion 2.0
GlycineSigma-AldrichG8790-100GGlycine, utilisation non animale
LuminomètreBiotekSYNERGY HTLecteur de microplaques multi-détection
Solution de lyse 1Tris 50 mM, 150 mM de NaCl et H2O
Solution de lyse 2interned’éthanol pur et de lyse cellulaire 1:1 (v :v)
NBD-cholestérolThermo-FisherN114822-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3&beta ;-ol
PBSSigma-AldrichP3813tamponné au phosphate  ; solution saline
PEG 8000Sigma-Aldrich202452-250Gpolyéthylène glycol
PMASigma-Aldrich79346Phorbol 12-mérystate B-acétate.
R10RPMI1640 interne complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 5 % de pénicilline/streptomycine.
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 avec 2 mM de L-glutamine contenant 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 4,5 g/L de glucose
THP-1cellules Sigma-AldrichATCC, #TIB-202Monocyte dérivé d’une leucémie d’un bébé d’un an
Tween 80Sigma-AldrichP1754
tampon solution

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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