Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay

Résumé

Mesure de la capacité de l’efflux de cholestérol in vitro de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur comme biomarqueur d’athérosclérose. Dans la présente étude, nous optimiser et uniformiser une méthode d’efflux de cholestérol NBD fluorescente et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.

Résumé

L’athérosclérose entraîne des maladies cardiovasculaires (MCV). On ignore encore si la concentration de cholestérol-HDL (cHDL) joue un rôle causal dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, un facteur important dans les premiers stades de la formation de plaques d’athérome est capacité de l’efflux de cholestérol HDL (la capacité des particules HDL à accepter le cholestérol des macrophages) afin d’éviter la formation de cellules de mousse. Il s’agit d’une étape clé en évitant l’accumulation de cholestérol dans l’endothélium et une partie du transport du cholestérol inverse (RCT) à éliminer le cholestérol par le foie. Capacité de l’efflux de cholestérol de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur qui peut être utilisé comme biomarqueur d’athérosclérose. Traditionnellement, [³H]-cholestérol a été utilisé lors d’essais de l’efflux de cholestérol. Dans cette étude, notre objectif est d’élaborer une stratégie plus sûre et plus rapide à l’aide de fluorescent étiquetés-cholestérol (NBD) lors d’un test cellulaire de retracer le processus de captation et l’efflux de cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1. Enfin, optimiser et uniformiser la méthode de l’efflux de cholestérol NBD et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.

Introduction

Selon l’organisation mondiale de la santé, les cours principales causes de décès dans le monde sont les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux (représentant un total de 15,2 millions de décès)¹. Les deux sont des maladies cardiovasculaires (MCV) qui peuvent être précédées de l’athérosclérose et la rupture des plaques d’athérome dans les vaisseaux sanguins^2,3.

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire de mur du navire dans laquelle macrophages, lymphocytes T, cellules de mât et les cellules dendritiques infiltrent l’endothélium e....

Protocole

Pour cette étude, l’approbation du comité de l’éthique (Comitè Ètic d' recherche clinique, clinique de l’hôpital, Barcelone ; numéro d’homologation HCB/2014/0756) et le consentement écrit et informé de tous les sujets ont été obtenus.

1. NBD-cholestérol préparation

1. Dissoudre le NBD-cholestérol (MW 494.63 ; voir Table des matières) dans l’éthanol pur pour obtenir le stock (2 mM). Pour un flacon de 10 mg, dissoudre le contenu de la fiole entière dans un volume de 10,1 mL d’éthanol pour obtenir un stock de 2 mM.
2. Diluer le NBD-cholestérol du stock en RPMI 1640 additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 5 % ....

Résultats

Le but de l’essai de l’efflux de cholestérol est de déterminer in vitro la capacité de l’efflux de cholestérol d’une donnée de sérum, le plasma ou surnageant contenant des particules HDL. La méthode consiste à charger cholestérol marqué dans une culture d’une lignée de cellules macrophages standard et induisant des contact avec l’échantillon dilué dans des milieux sans FBS avec les cellules. Enfin, les niveaux fluorescents de la NBD sont mesurés dans les médias et le lysat cellulaire. Pour optimiser les mesures, le chole.......

Discussion

Cholestérol marqué fluorescent est une stratégie prometteuse pour analyser et étudier les propriétés et le métabolisme du cholestérol naturel in vitro. Ses principaux avantages sont qu’il peut être absorbé par les cellules, permettant l’intracellulaire et étude de membrane de diffusion et peut être appliqué à des épreuves de l’efflux de cholestérol comme dans ce protocole (Figure 7). Certains stérols fluorescentes marqués permettent de cholestérol suivi in vitro y compris BODIPY-cholestérol,.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque collectrice à 96 puits	Corning Inc	Costar 3912	Plaque blanche à 96 puits avec fond transparent opaque
Plaque de culture à 96 puits	Corning Inc	Costar 3610	Plaque blanche à 96 puits avec fond plat et transparent
Trousse de dosage de l’efflux de cholestérol (à base de cellules)		Abcamab196985	commercial à haut débit à base de cellules visant à déterminer le efflux de cholestérol
incolore RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R7509	RPMI 1640 sans pehnol-red
Logiciel d’analyse de données Gen5	BioTek		Version 2.0
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790-100G	Glycine, utilisation non animale
Luminomètre	Biotek	SYNERGY HT	Lecteur de microplaques multi-détection
Solution de lyse 1			Tris 50 mM, 150 mM de NaCl et H2O
Solution de lyse 2	interne		d’éthanol pur et de lyse cellulaire 1:1 (v :v)
NBD-cholestérol	Thermo-Fisher	N1148	22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3&beta ;-ol
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	tamponné au phosphate  ; solution saline
PEG 8000	Sigma-Aldrich	202452-250G	polyéthylène glycol
PMA	Sigma-Aldrich	79346	Phorbol 12-mérystate B-acétate.
R10	RPMI	1640 interne complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 5 % de pénicilline/streptomycine.
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758	RPMI 1640 avec 2 mM de L-glutamine contenant 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 4,5 g/L de glucose
THP-1	cellules Sigma-Aldrich	ATCC, #TIB-202	Monocyte dérivé d’une leucémie d’un bébé d’un an
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754

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