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Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

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DOI :

10.3791/58896

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21 février 2019

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier le mécanisme moléculaire de la translocation des protons à travers les membranes lipidiques des liposomes unique, à l’aide du cytochrome bo3 à titre d’exemple. Combinant l’électrochimie et la microscopie de fluorescence, les variations de pH dans la lumière des vésicules unique, contenant un seul ou plusieurs enzymes, peuvent être détectés et analysés individuellement.

Résumé

Enzymes de proton-pompage d’électron transfert chaînes couple rédox de translocation des protons à travers la membrane, création d’une force proton-motrice utilisée pour la production d’ATP. Le caractère amphiphile des protéines membranaires nécessite une attention particulière à leur maniement et reconstitution dans l’environnement lipidique naturel est indispensable lorsque l'on étudie les processus de transport de membrane comme proton translocation. Ici, nous détaillons une méthode qui a été utilisée pour l’étude du mécanisme de proton-pompage des enzymes d’oxydoréduction membranaires, prenant du cytochrome bo3 d' Escherichia coli par exemple. Une combinaison de microscopie par fluorescence et de l’électrochimie est utilisée pour contrôler l’état redox des quinone piscine et moniteur changements de pH dans la lumière. En raison de la résolution spatiale de la microscopie fluorescente, des centaines de liposomes peuvent être mesurés simultanément, tandis que la teneur enzymatique peut être réduite à une seule enzyme ou le transporteur par liposome. L’analyse respectifs seule enzyme peut révéler des patrons dans la dynamique fonctionnelle d’enzyme qui pourrait sinon être masquée par le comportement de l’ensemble de la population. Nous incluons une description d’un script pour l’analyse d’image automatique.

Introduction

Informations sur les mécanismes enzymatiques et cinétique sont généralement obtenues au niveau d’ensemble ou échelle macroscopique avec population enzyme par milliers à des millions de molécules, où les mesures représentent une moyenne statistique. On sait, toutefois, que des macromolécules complexes telles que les enzymes peuvent démontrer hétérogénéité dans leur comportement et mécanismes moléculaires observés au niveau de l’ensemble ne sont pas nécessairement valables pour chaque molécule. Ces écarts sur l’échelle de la molécule individuelle ont été largement confirmés par des études sur les enzymes unique avec une variété de méthodes émergent pendant les dernières deux décennies1. Notamment, la détection par fluorescence de l’activité enzymatique individuels a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité de l’activité d’enzymes,2,3 et découvrez l’effet de mémoire ce qu’on appelle (périodes d’activité d’enzymes élevés ont réussi par des périodes de faible activité et vice versa)4,5.

De nombreuses études seule enzyme exigent que les enzymes sont immobilisées sur la surface ou dans l’espace fixe dans une autre façon de rester suffisamment longtemps dans le champ de vision pour l’observation continue. Encapsulation d’enzyme dans des liposomes a été démontrée pour permettre l’immobilisation d’enzymes tout en empêchant toute incidence négative due la surface enzymes ou protéines interactions6,7. En outre, les liposomes offrent une possibilité unique pour étudier les protéines de la membrane unique dans leur naturelle lipidique bi-couche environnement8,9,10.

Une classe de protéines membranaires, transporteurs, exerce une translocation directionnelle des substances à travers la membrane de la cellule, un comportement qui ne peut être étudiée lorsque les protéines sont reconstituées dans les lipides des bicouches (p. ex., liposomes)11, 12,13. Par exemple, translocation des protons, exposée par plusieurs enzymes des chaînes de transport d’électrons procaryotes et eucaryotes, joue un rôle important dans la respiration cellulaire en créant une force proton-motrice utilisée pour la synthèse d’ATP. Dans ce cas, le proton de l’activité de pompage est couplé au transfert d’électron, bien que les modalités de ce processus souvent demeure insaisissable.

Récemment, nous avons démontré la possibilité de détection par fluorescence couple avec électrochimie pour étudier l’activité des enzymes unique de l’oxydase d’ubiquinol terminal d' Escherichia coli ( bo3du cytochrome) de pompage protonique reconstitué dans les liposomes14. Ceci a été réalisé par encapsulation d’un colorant fluorescent membrane imperméable sensibles au pH dans la lumière de liposomes, préparé à partir d’e. coli lipides polaires (Figure 1 a). La quantité de protéines a été optimisée pour que la plupart des liposomes figurant non plus aucun ou qu’une seule molécule d’enzyme reconstituée (selon la distribution de Poisson). Les deux substrats du cytochrome bo3 ont été fournis en ajoutant l’ubiquinone au mélange lipidique qui formaient les liposomes et oxygène (ambiante) en solution. Les liposomes sont ensuite faiblement adsorbés sur une électrode d’or ultra-lisse semi-transparent, recouverte d’un monocouches auto-assemblées de 6-mercaptohexanol. Enfin, l’électrode est monté sur le fond d’une cellule simple spectroélectrochimiques (Figure 1 b). Contrôle électrochimique de l’état redox de quinone piscine permet de déclencher avec souplesse ou de bloquer la réaction enzymatique à tout moment, tandis que le colorant sensibles au pH sert à surveiller les changements de pH à l’intérieur de la lumière des liposomes par suite de la translocation des protons par le enzymes. En utilisant que l’intensité de la fluorescence d’un colorant fluorescent Deuxièmement, liés aux lipides, la taille et le volume des liposomes individuelles peut être déterminée et donc la quantification de l’activité de pompage de protonique enzyme. En utilisant cette technique, nous avons notamment constaté que cytochrome bo3 molécules sont capables d’entrer dans un état de fuite spontanée qui dissipe rapidement la force motrice de proton. Le but de cet article est d’introduire la technique de mesure unique liposome en détail.

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Protocole

1. préparation d’un mélange de lipides/UQ-10/FDLL

NOTE : E. coli lipides utilisés pour la préparation des liposomes devraient être aliquotés et soigneusement mélangé avec l’ubiquinone-10 (substrat de l’enzyme) et longueur d’onde fluorescents dye-labeled lipides (pour la détermination de la taille des liposomes) avant le reconstitution.

  1. À l’aide d’une seringue en verre, transférer 200 µL de stock de chloroforme de lipides polaires extrait de Escherichia coli (25 mg/mL) dans des flacons en verre pour faire des parties aliquotes de 5 mg.
  2. Ajouter 50 µL de 1 mg/mL ubiquinone-10 (UQ-10 ; dans le chloroforme) pour les lipides pour rendre le rapport final de l’UQ-10 : lipides au 1/100 (1 % w/w).
  3. Ajouter 20 µL de 1 mg/mL (0,4 % w/w) d’un lipide de marqués au colorant fluorescent de longueur d’onde (FDLL) à la composition des lipides/UQ-10.
  4. Homogénéiser la solution de chloroforme au vortex court et faire évaporer la plus grande partie du chloroforme sous un léger courant d’azote ou argon. Éliminer les traces de chloroforme entièrement par évaporation supplémentaire sous vide pendant au moins 1 h.
    NOTE : Les aliquotes de lipides peuvent être stockés sous atmosphère inerte à-20 ° C pendant plusieurs mois.

2. reconstitution du Cytochrome bo3

Remarque : Pour la purification de cytochrome bo3 d’e. coli, suivre le protocole de Rumbley et al. 15 afin d’assurer la haute pureté d’échantillons de l’enzyme nativement-plié, ajouter chromatographie d’exclusion après la purification d’affinité décrite par Rumbley et al. 15

  1. Ajouter 312,5 µL de 40 mM MOPS-KOH/60 mM K2donc4, pH 7,4, une partie aliquote de lipides/UQ-10/FDLL sec mélanger (5 mg, étape 1.4) et mélanger avec vortex jusqu'à ce que le film lipidique est entièrement remis en suspension, suivie de 2 min de traitement dans un bain à ultrasons.
  2. Ajouter 125 µL de 25 mM 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulphonic acide (STPH), un colorant fluorescent sensibles au pH qui doit être encapsulé dans les liposomes.
  3. Ajouter 137,5 µL de 250 mM n-octyl-β-D-glucopyranoside (PSF) agent tensio-actif, mélanger à l’aide de vortex et ultrasons dans un bain d’eau à ultrasons pendant 10 min pour s’assurer que tous les lipides sont solubilisés dans les micelles de surfactant. Transférer la dispersion dans un tube en plastique de 1,5 mL.
    NOTE : Suspension trouble des lipides devienne transparente après la solubilisation avec agent tensio-actif.
  4. Ajouter la quantité requise de cytochrome bo3 (voir la remarque ci-dessous) et ajouter de l’eau ultrapure pour rendre un volume total de 50 µL (cytochrome bo3 solution avec l’eau). Incuber à 4 ° C pendant 10 min sur un mélangeur à rouleaux.
    NOTE : Montant typique pour les conditions de la seule enzyme est 0,1 – 0,2 % (p/p protéines-à-lipides, c'est-à-dire. 5 à 10 µg de protéines), même si elle peut être augmentée jusqu'à 1 à 2 % (50 à 100 µg de protéines), si l’objectif est de n'observer que l’activité électrochimique (voir ci-dessous). Comme témoin négatif, liposomes sans cytochrome bo3 peuvent être préparés.
  5. Peser 2 x 50 mg et 2 x 100 mg de microbilles de polystyrène dans quatre 1,5 mL-bouchons et fermez avec le film de paraffine pour éviter le dessèchement.
    NOTE : Avant utilisation, microbilles de polystyrène doivent être lavés avec du méthanol, de l’eau et stocké dans l’eau selon le manuel du fabricant.
    Remarque : Si on utilise un mélange de l’eau/faisant, microbilles de polystyrène peuvent commodément être transférées au chapeau avec une micropipette avec une pointe large. L’eau peut alors être retiré les microbilles à l’aide d’une micropipette pointe fine.
  6. Ajouter le 1st50 mg de microbilles de polystyrène dans le mélange de reconstitution (étape 2.4) en mettant le cap avec des microbilles de polystyrène sur le tube de 1,5 mL-plastique avec dispersion et en effectuant un essorage court pendant quelques secondes. Incuber à 4 ° C sur un mélangeur à rouleaux de microbilles de polystyrène d’adsorber le surfactant pendant 30 min.
    1. Répéter les ajouts de microbilles en polystyrène et des incubations comme suit : ajouter 50 mg de microbilles pour 60 min d’incubation ; ajouter 100 mg de microbilles pour 60 min d’incubation ; et ajouter 100 mg de microbilles pour 120 min d’incubation.
      Remarque : La solution ci-dessus les microbilles sédentarisés devient translucide au cours de l’étape 2.6 comme protéoliposomes sont forment.
  7. Séparer les microbilles de polystyrène à l’aide d’une micropipette pointe fine de la solution protéoliposomes. Diluer la dispersion 90 ml de 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2SO4, pH 7,4 (MOPS tampon) et le transfert dans un tube d’ultracentrifugeuse Ti45.
  8. Ultracentrifugeuse la dispersion à l’aide de Type 45 Ti rotor à 125 000 x g (à rmax) pendant 1 h granuler protéoliposomes.
    NOTE : Tubes de centrifugeuse plus petites peuvent être utilisés même si la dilution en volume grand tampon contribue à réduire la concentration de la STPH non capsulées dans la suspension définitive.
  9. Jeter le surnageant, rincer les pellets avec 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2donc4, pH 7,4 tampon (sans resuspendant le culot). Après avoir jeté le tampon de lavage, une nouvelle suspension protéoliposomes dans 500 µL de tampon de VADROUILLES en pipettant également, il en arrière avec une micropipette pointe fine. Puis transférez dans un tube en plastique de 1,5 mL.
  10. Centrifuger la suspension pendant 5 min à 12 000 g pour enlever les débris. Transvaser le surnageant (protéoliposomes reconstitués) dans un nouveau flacon.
  11. Stocker la dispersion protéoliposomes reconstitués à 4 ° C durant la nuit et d’utiliser en 2 jours.

3. fabrication d’électrodes en or semi-transparente

Remarque : La surface d’or lisse est obtenue par une méthode de décapage de modèle d’une couche de 30 nm d’épaisseur d’or 99,99 % d’une plaquette de silicium atomiquement lisse. La faible épaisseur de la couche d’or est important car il doit être semi transparent permettant l’observation de la fluorescence. Détails d’or évaporation (dépôt en phase vapeur physique, PVD) peut se trouver ailleurs16 et seul modèle-décapage est abordé ici. Alternativement, ultra-lisse or jetons peuvent être achetés ailleurs (voir Table des matières).

  1. Coller le verre jusqu'à 9 lamelles (0,17 mm d’épaisseur) sur la surface or évaporée avec bi-composant époxy de fluorescence faible. Guérir la colle à 80 ° C pendant 4 h.
  2. Juste avant la modification par un monocouches auto-assemblées (étape 4), détacher les lamelles de verre des plaquettes de silicium avec une lame. En raison de la minceur des feuillets couverture, faites attention en détachant les lamelles pour pas casser ou briser les lames de verre.

4. modification de la Surface d’or avec des monocouches auto-assemblées (SAM)

  1. Préparer 5 mL de solution d’eau de 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
  2. Trempez fraîchement détachés lamelles or-enduit (étape 3.1) dans 6MH solution et laisser une nuit entre 20 et 25 ° C (> 16 h) pour former le SAM.
    NOTE : Les solutions de thiols ont une odeur désagréable, donc un récipient fermé doit être utilisé lors de l’incubation de la lamelle couvre-objet or-enduit.
  3. Le lendemain, retirer la lamelle couvre-objet or-enduit de la solution de 6MH, laver brièvement avec l’eau ou du méthanol, puis avec de l’isopropanol. Sèche sous un débit de gaz douce.

5. électrochimique tests dactivité Protéoliposomes

Remarque : L’activité électrochimique d’enzyme est d’abord vérifiée sur une couche de liposomes étroitement emballés (étape 5) et les couvertures de vésicule inférieures sont utilisés dans des vésicules unique expérience pour mesurer les variations de pH dans la lumière des liposomes (étape 6).

  1. Assembler la lamelle or-enduit dans une cellule électrochimique-spectro (voir Figure 1). Prendre contact à l’or avec un fil plat extérieur d’une zone définie par un joint torique en caoutchouc.
  2. Ajouter 2 mL de la solution tampon d’électrolyte et placez la référence et les électrodes auxiliaires dans la cellule.
    NOTE : Tel que discuté dans la section Discussion, références électrodes sans chlorure sont préférables pour empêcher la formation Au (I) Cl au cours de l’électrochimie. Ici, un Hg/Hg2SO4 (Sam. K2SO4) sert à l’électrode de référence et de potentiels sont donnés par rapport à l’électrode hydrogène Standard (SHE) à l’aide de 0,658 V vs SHE pour le Hg/Hg2SO4 (sat. K2SO4).
  3. Exécutez spectroscopie d’impédance électrochimique (0,1 Hz à 100 kHz) au potentiel (OCP) potentiel de cellules ouvertes afin d’évaluer la qualité de SAM. Convertir des valeurs d’impédance à l’admission et de diviser par 2πω pour tracer un terrain de Cole-Cole, où ω est la fréquence (voir ce qui suit fait référence à16,17,18 pour plus d’informations sur la conversion et l’interprétation impédance spectres).
    NOTE : SAMs Compact et denses de 6MH devraient donner sa fin à demi-cercle tracé de Cole-Cole et donnent des valeurs de capacité dans la gamme de 2,5 à 3,0 µF/cm2 (Figure 2 a). Si on obtient une déviation significative de demi-cercle forme ou des valeurs de capacité d’out-of-range, changer l’électrode.
  4. Exécuter les voltampérogrammes cycliques vides (CVs) avec scan taux 100 et 10 mV/s dans la région de potentiel -0,3 – 0,8 V. Un CV typique est montré sur (Figure 2 b, ligne pointillée).
    Remarque : Cela devrait démontrer presque pur comportement capacitif et une absence de courant faradique significatif, même dans des conditions ambiantes d’oxygène utilisée ici.
  5. Ajouter protéoliposomes (concentration finale lipides 0,5 mg/mL, 1-2 % (p/p) rapport du cytochrome bo3 de lipides) à la cellule électrochimique et mélanger légèrement avec une pipette. Attendez que l’adsorption des protéoliposomes sur la surface de l’électrode est fini (30-60 minutes à température ambiante).
    Remarque : Les voltampérogrammes cycliques (CVs) à 10 mV/s peut être exécuté lors de l’adsorption de protéoliposomes de suivre le processus. L’adsorption est terminée lorsque CVs consécutives arrêter changer. On trouvera des informations sur les techniques de CV dans les manuels suivants. 19 , 20
  6. Laver la cellule en changeant la solution tampon au moins 10 fois, mais éviter de laisser la surface de l’électrode complètement sec.
  7. La spectroscopie d’impédance électrochimique à OCP (Figure 2 a, ligne bleue) pour confirmer que le SAM sur l’électrode d’or reste inchangé et CVs avec scan tarifs 10 à 100 mV/s pour observer l’oxydation catalytique ubiquinol (et réduction de l’oxygène) par le cytochrome Bo 3 aux potentiels de l’apparition de réduction électrochimique quinone sur 0 V vs SHE) (Figure 2 b).

6. détection enzymatique proton pompage par microscopie de Fluorescence

  1. Modifier l’électrode d’or comme dans l’étape 5, mais en utilisant 100 x moins protéoliposomes par rapport à l’étape 5.5 (c.-à-d., 5 µg/mL). Pour les études de la seule enzyme, réduire le cytochrome bo3 rapport lipides à 0,1 à 0,2 % (p/p).
    NOTE : Liposomes adsorbe faiblement sur la surface de l’électrode qui permet seule vésicule suivi par microscopie de fluorescence. Dans ces conditions de single-enzyme, la quantité d’enzyme immobilisée sur la surface de l’électrode est insuffisante pour l’observation d’un courant catalytique.
  2. Placez la cellule électrochimique sur l’objectif de l’huile (60 X) d’un microscope à fluorescence inversé avec une goutte d’huile à immersion. À l’aide de filtres appropriés pour fluorescence FDLL, se concentrer sur la surface de l’électrode. Liposomes unique doivent apparaître comme des points lumineux à la limite de diffraction de l’objectif de microscope /. Prendre une image de fluorescence FDLL.
  3. Basculer vers l’un des jeux de filtres de fluorescence STPH le microscope pour vérifier que la fluorescence STPH est clairement visible et reconnaissable de l’arrière-plan (dans le temps d’exposition choisi, reportez-vous à l’étape 6.4). Augmenter l’intensité de la lumière, si ce n’est pas le cas.
  4. Programmer le logiciel de microscope pour effectuer une acquisition d’images chronométré par une alternance de deux jeux de filtres HPTS (menu Applications | Acquisition de ND de Define/Run). Définir le délai entre l’acquisition d’image au minimum. Dans cette expérience, utiliser une exposition de s 1 et 0,3 s delay, (en raison du mouvement de la tourelle).
    NOTE : Le rapport entre les intensités de fluorescence à ces deux canaux sera plus tard transformé en pH à l’intérieur les liposomes à chaque instant. La durée de l’acquisition peut varier selon le taux de changement de pH attendus ; 5 min est utilisé dans cet article.
  5. Ajustez les réglages de la potentiostat pour modifier le potentiel lors de l’acquisition de l’image. Par exemple, dans cette expérience, utiliser la séquence suivante : 0 – 60 s: aucun potentiel n’appliqué (c.-à-d. OCP) ; 60-s : 180 -0,2 V (vs SHE) ; 180-300 s : 0,4 V (vs SHE). Dans ce cas, seul le potentiel appliqué à la deuxième phase (-0,2 V vs SHE) est suffisant pour réduire efficacement la piscine de la quinone.
  6. Exécutez simultanément l’acquisition d’images chronométré (microscope) et la séquence potentielle (potentiostat) en démarrant manuellement les deux mesures en même temps.
    Remarque : L’expérience peut être répétée sur la même électrode plusieurs fois en déplaçant la platine du microscope vers une autre zone sur la surface. Le délai entre l’acquisition doit être au moins 5-10 min pour s’assurer de l’équilibration du pH complète des liposomes sur la surface. Différentes durées et patrons potentiels peuvent être appliqués selon le besoin, bien que le temps d’imagerie est limitée en raison de Photoblanchiment de STPH lors de l’acquisition.

7. l’analyse des Images de Fluorescence

Remarque : Une expérience typique produit une série d’images avec un pas de temps (p. ex., 2.6 s) pour chacun des deux canaux, c.-à-d. (durée * 2 / 2.6) images. Un exemple de cette image la valeur enregistrée au cours d’une expérience seule enzyme sont accessibles via la recherche données Leeds référentiel21. Un traitement d’image se compose de plusieurs étapes à l’aide de Fidji (ImageJ) et haut niveau analyse mathématique, programmation des logiciels de langue (désormais appelée comme logiciel de script, consultez la Table des matières pour plus de détails).

  1. Fidji permet de séparer le fichier de laps de temps, aligner les images et enregistrer en tant que canaux séparés et des délais.
    1. Fichier de laps de temps ouvert à l’aide de l’importateur Bioformats fournie dans les îles Fidji (commande macro : exécuter (« Bio-Formats importateur »)).
    2. Utilisez le plugin StackReg pour aligner chaque image à la première pour tenir compte des mouvements de scène possible ou dérive thermique s’est produite lors de l’acquisition (commande macro : exécuter ("StackReg", "transformation = Translation")).
    3. Enregistrer des fichiers image non compressée séparés pour chaque canal et chaque pas de temps au format TIFF dans un seul dossier.
    4. Extrait les métadonnées de fichiers de laps de temps des horodatages exacte pour chaque image et les enregistrer comme un fichier CSV dans le même dossier que les images. Vous pouvez également extraire des horodatages en utilisant le logiciel d’acquisition et enregistrer manuellement dans un fichier CSV à l’aide d’un tableur.
      Remarque : Le dossier avec les images et les horodatages est maintenant prêt à être analysé par le logiciel de script. 7.1.1 les étapes. – 7.1.4. peut être automatisée à l’aide d’un script de Fidji (un script écrit en Python pour le traitement par lots des fichiers de laps de temps est fourni, utilisez «Ctrl-Maj-N» (sous Windows), puis fichier | Ouvert pour charger le script).
  2. Utiliser un logiciel de script pour le traitement automatisé des images. Charger le code fourni dans le logiciel, cliquez sur exécuter à la fin. Lorsque vous êtes invité, sélectionnez le dossier contenant les images de l’étape 7.1.
    Remarque : Un script pour l’analyse est fourni en tant que script direct mlx-format, avec des commentaires exhaustifs, à identifier les liposomes unique, fixez-les sur fonction 2D gaussiennes, filtrez-les et quantifier les valeurs de pH à chaque moment. Les sous-étapes suivantes sont exécutées automatiquement par le script.
    1. Charger toutes les images de délais d’exécution pour une expérience unique dans la mémoire.
    2. Moyenne de toutes les images pour un seul canal (sélectionnez le canal avec l’intensité de fluorescence plus haut) et l’image mise en moyenne permet d’identifier tous les taux maximaux qui peut-être correspondre aux liposomes unique.
    3. Ajuster les maximums définis sur l’image mise en moyenne pour la 2D-gaussienne fonctionnent et sauvegarder l’a entraîné ajuster les paramètres pour chaque liposome (voir la Figure 4 a par exemple liposome équipée).
    4. Filtrer les taux maximaux selon les critères attendus des liposomes unique, comme la taille, la circularité et intensité. Rejeter les liposomes qui sont mal équipés en raison de la faible signal/bruit, étroitement voisins liposome ou d’être trop près du bord de l’image.
    5. Charger l’horodatage du fichier externe et adapter chaque liposome filtré à la fonction gaussienne 2D sur chaque image de laps de temps séparément.
      Remarque : L’utilisation de la programmation parallèle et multi-core CPU peut améliorer considérablement la vitesse de calcul à ce stade.
    6. Filtrer les liposomes, toujours selon des critères similaires comme au point 7.2.4 mais appliquée dans chaque période de temps.
    7. Sur chaque pas de temps, définir le ratio d’intensité de fluorescence d’un liposome comme étant le rapport des volumes entourées équipée fonction 2D-gaussien à deux canaux. Calculer les valeurs de pH du rapport des intensités déterminées par les deux canaux de STPH et à l’aide d’une courbe d’étalonnage (étape 8). Tracer les courbes de pH-temps qui en résulte pour les liposomes et observer leur pH change lorsque le potentiel est appliqué.

8. effectuer une courbe d’étalonnage de la Fluorescence de STPH

Remarque : Pour convertir rapport de fluorescence STPH au pH intravésiculaire, une courbe d’étalonnage doit être tout d’abord établie qui prendrait en compte les conditions particulières d’expériences comme facteur de transmission or, filtres de qualité, etc.. Cette étape doit être effectuée qu’une fois ou deux fois et les données d’étalonnage peuvent être utilisées tant que les paramètres d’installation et de mesure restent les mêmes à l’étape 6.

  1. Préparer une électrode avec les liposomes faiblement adsorbés (sans cytochrome bo3 comme décrit aux étapes 5 et 6.1).
  2. Ajouter 2 µL de solution de gramicidine 0,1 mg/mL dans de l’éthanol à 2 mL de tampon pour créer la concentration de 100 ng/mL.
  3. Capturer les deux images de fluorescence pour les deux canaux de STPH.
  4. Changer le pH de la cellule par l’addition de petites parties aliquotes de 1 M HCl ou 1 M H2SO4. Mesurer le pH de la mémoire tampon avec un pH-mètre standard et capturer les deux images de fluorescence pour les deux canaux de STPH.
  5. Répétez les étapes 8,4 pour des pH allant de 6 à 9.
  6. À l’aide de l’algorithme de 7,2, s’adapter, filtrer et calculer le ratio moyen de fluorescence HPTS de liposomes individuels à chaque pH. Prenez le ratio STPH moyen tous les liposomes.
  7. Ajustement de la dépendance qui en résulte de pH-rapport à l’équation suivante :
    figure-protocol-1, où pKun, Run et Rbsont des paramètres d’ajustement.
  8. Utilisez pKun, Run et Rbpour convertir le ratio HPTS de liposomes individuels à l’étape 7.2.7. aux valeurs de pH.

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Résultats

La qualité de l’or-modified lamelle couvre-objet (l’électrode) avec une SAM de 6MH est vérifiée avant chaque expérience avec spectroscopie d’impédance électrochimique. Figure 2 a montre représentatifs parcelles de Cole-Cole mesurées par spectroscopie d’impédance électrochimique, avant et après que les liposomes sont adsorbés. Si la qualité de SAM suffit, spectroscopie d’impédance doit démontrer un comportement capacitif presque pur, résultant en un tracé de C...

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Discussion

La méthode décrite est apte à étudier la proton pompage de protéines membranaires respiratoire qui peuvent être reconstituées dans des liposomes et sont en mesure d’échanger des électrons avec la piscine de la quinone. L’activité de pompage de proton peut être contrôlé au niveau de single-enzymatique à l’aide de colorants sensibles au pH (ratiométrique) encapsulés dans le lumen de liposome (Figure 1 a).

La méthode repose sur la capacité de l’ubiquinone (ou autres ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent le BBSRC (BB/P005454/1) pour un soutien financier. NH a été financé par le programme de jeunes chercheurs VILLUM Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
6-Mercapto-1-hexanol (6MH)Sigma45108897%
8-hydroxypyrène-1,3,6-acide trisulfonique (HPTS)BioChemika56360
Support en aluminium (cellule électrochimique)Sur30x30x7 mm ; diamètre intérieur : 26 mm ; diamètre du trou : 15 mm
Électrodefil de platine
ChloroformeVWR Produits chimiques83627
E.coli lipides polairesAvanti100600C25 mg/mL dans du chloroforme
EpoxyEPO-TEK301-2FLépoxy à faible fluorescence
Fiji (ImageJ 1.52d)Plugins requis : StackReg et TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Cube de filtre (« ATTO633 »)Chroma Technology CorporationEx : 620/60 nm ; MS : 660 NM ; Em : 700/75 nm
Cube de filtre (« HPTS1 »)Chroma Technology CorporationEx : 470/20 nm ; MS : 500 nm ; Em : 535/48 nm
Cube de filtre (« HPTS2 »)Chroma Technology CorporationEx : 410/300 nm ; MS : 500 nm ; Em : 535/48 nm
Cube de filtre (« Texas Red »)Chroma Technology CorporationEx : 560/55 nm ; MS : 595 NM ; Em : 645/75 nm
Lipides marqués par colorant fluorescent (FDLL)ThermoFisher ScientificT1395MPTexasRed-DHPC a été utilisé dans ce travail (&lambda ; EXC 595 NM ; &lambda ; em 615 nm)
Lipides marqués par colorant fluorescent (FDLL) (alternative)ATTO-TECAD 633-161ATTO633-DOPE peut être utilisé comme alternative (&lambda ; Exc 630 NM ; &lambda ; em 651 nm)
Colonne de filtration sur gelGE Healthcare28-9893-33HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, pour une purification supplémentaire des protéines
Lamelles en verreVWR International631-0172No 1.5
Seringue en verreHamilton1725 RNR250 µ ; L
Flacons en verreScientific Glass Laboratories LtdT101/V1Capacité de 1,75 mL
GoldGoodFellow99,99 %
GramacidinSigmaG5002
Électrode de référence au sulfate de mercureRadiomètre (Hash)E21M012
MicrocentrifugeuseMicroscope EppendorfMinispin NL040
AppareilEclipse Ti
AndorZyla 5.5 sCMOS
LampeNikonIntensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2Logiciel d’acquisition de microscopeNikon
n-Octyl &beta ;-D-glucopyranosideMelford LaboratoriesB2007
Nova 1.10MetrohmLogiciel de contrôle du potentiostat
ObjectifNikonPlan Apo &lambda ; 60x/1.4 huile
OriginPro 2017OriginLabLogiciel de traçage
Joint torique (cellule électrochimique)OrinokoDiamètre intérieur : 16 mm ; section transversale : 1,5 mm
Tubes en plastiqueEppendorf3810X1,5 mL
Microbilles de polystyrèneBio-RAD152-3920Biobilles, 20-50 mesh
PotentiostatMetrohm AutolabPGSTAT 128N
PotentiostatCH InstrumentsCHI604C
Logiciel de scriptMatlabR2017aBoîtes à outils requises : 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Boîte à outils d’optimisation’Plaquettes
de siliciumIDB Technologies LTDSi-C2 (N< 100>P)Ø ; 25 mm, 525 um d’épaisseur
Cellule téflon (cellule électrochimique)SurDiamètre extérieur : 26 mm ; diamètre intérieur : 13,5 mm
Surfaces en or ultra-plates dénudées de branchesPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSGSurfaces alternatives en or ultra-plates prêtes à l’emploi (épaisseur inférieure à 100 nm sur demande)
Pointes de micropipette finesSarstedt70.1190.100ou similaire Gelloader Tips 200 &Micro ; L
Ubiquinone-10SigmaC-9538
UltracentrifugeuseBeckman-CoulterL-80XPavec rotor Ti 45
Bain à ultrasonsFisher ScientificFB15063
mesure auxiliaire photo microscope Nikon microscope mesure

Références

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Mots-clés

Enzymes de pompage de protonslectrochimieMicroscopie de fluorescenceCytochrome bo3Reconstitution en prot oliposomesColorant sensible au pH HPTSAnalyse par microscopie fluorescenteSpectroscopie d imp dance lectrochimiquetudes sur enzyme uniqueEnvironnement de bicouche lipidique

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