Intra-épiploïques Islet Transplantation utilisant h-épiploïques remplissage de matrice îlot (hOMING)

La thérapie cellulaire est un sujet d’actualité, puisqu’il vise à guérir les maladies basés sur la médecine régénérative. Thérapies cellulaires d’assistée par matériel biologique ont été étudiés de plus en plus ces dernières années, surtout parce que l’implantation de cellules souvent nécessite un support pour le transfert des cellules de la boîte de pétri au destinataire. Biomatériau échafaudages sont porteurs de cellules potentiellement intéressants qui remplissent plusieurs rôles¹. Une entreprise compétente doit protéger les cellules contre les contraintes mécaniques et fournir des conditions de croissance favorables, tels que les facteurs essentiels de croissance, l’excrétion des déchets métabolique, échange de substances nutritives et d’oxygène².

Parmi les différents types de biomatériaux utilisés en thérapie cellulaire, hydrogels présentent de nombreux avantages. Elles sont biocompatibles, biodégradable, facile à manipuler et faciliter la diffusion de l’oxygène³. En outre, la technologie actuelle permet l’utilisation d’hydrogels pour aider les cellules survivent et greffer avec, par exemple, une supplémentation en facteurs de croissance ou de la matrice extracellulaire protéines⁴.

Hydrogel supports contenant les cellules souches peuvent être injectés comme traitements, d’os par exemple, régénération⁵ et du système nerveux, maladies⁶. L’implantation des cellules métaboliquement actives est nécessaire. Validation in vitro de l’approche est possible, outils et techniques pour la validation in vivo restent à être affinée.

Transplantation de cellules et hydrogel facilement réalisables par voie sous-cutanée quand se déroulent les tests de biocompatibilité. Toutefois, lorsque les cellules greffées sont censées réglementer les facteurs systémiques par leur action métabolique, cette localisation sous-cutanée n’est pas optimale, essentiellement en termes de drainage veineux⁷. Il n’y a donc aucun outil actuel pour rapidement, en toute sécurité et efficacement évaluer les effets bénéfiques d’un hydrogel. Basé sur l’exemple de la transplantation d’îlots, qui exige que les hormones libérée dans la circulation sanguine de la prothèse en réponse à la glycémie, nous avons développé une nouvelle méthode pour l’implantation de cellule/hydrogel in vivo.

La première étape consistait à identifier un site accepteur de transplantation, qui peut accepter un hydrogel avec les cellules. L’épiploon offre un grand espace pour l’implantation, est très plastique et sa vascularisation dense, combinée avec le réglage intrapéritonéal est intéressante pour l’étude des cellules ayant une activité métabolique élevée⁸. Ensuite, il nous fallait mettre en place une technique chirurgicale permettant le transfert des cellules et l’hydrogel dans l’épiploon. Inspiré par le lipofilling utilisé en chirurgie plastique⁹, nous avons développé l’îlot de matrice h-épiploïques (autoguidage) approche de remplissage. Îlots incorporés en hydrogel sont injectés à l’intérieur du tissu épiploïques. La technique vise également à fournir greffe maximale en utilisant plusieurs dépôts de la cellule et hydrogel en mélange dans le tissu épiploïques, où le grand nombre de vaisseaux sanguins aussi améliore l’oxygénation de la greffe.

Dans la présente étude, nous décrivons une technique simple et innovante pour l’implantation de l’îlot entre les feuilles épiploïques, à l’intérieur du tissu graisseux plus proche des vaisseaux sanguins. Il s’agit de la chirurgie micro-invasive, qui puisse être accomplie sous laparoscopie, avec l’injection d’îlots contenus dans un hydrogel dans les tissus adipeux. Cette technique est facilement applicable à toutes les combinaisons d’hydrogel et les cellules qui doivent être testés dans un dans un environnement fonctionnel métaboliquement.

Toutes les expériences animales ont été effectuées selon les directives du National Institutes of Health, avec le numéro d’autorisation : AL/60/67/02/13.

1. préparation destinataire

1. Chimiquement induit diabète chez les bénéficiaires.
   1. Injecter 75 mg/kg de streptozotocine (STZ, en tampon stérile de citrate de 0,1 M, pH 4) par voie intrapéritonéale à des rats¹⁰.
      Remarque : Pour les études de transplantation, ont servi 6 semaines Lewis souche rats, pesant 150 à 190 g.
   2. Vérifier l’état de diabète en mesures glycémiques quotidiennes durant les quatre premiers jours. Injection d’insuline d’action prolongée 6 U/jour par voie sous-cutanée lorsque des rats pièce glycémie plus de 2 g/L pour prévenir les complications du diabète et perte de poids, jusqu'à l’implantation de granulés de l’insuline.
   3. Inclure des rats dans la cohorte lorsque sont deux mesures de la glycémie de queue veineuse > 4 à 5 g/L pour 2 jours consécutifs et le niveau de C-peptide est < 200 pM. Mesurer la glycémie avec un glucomètre et C-peptidemia par un dosage immuno-enzymatique (ELISA).
   4. Boulettes de l’insuline sous la peau de l’implant (voir 1.2).
      Remarque : Chronique d’insulinothérapie permet meilleure régulation de la glycémie et évite les complications liées au diabète (qui exacerbent le stress oxydatif sur le site de transplantation)¹¹. En outre, la thérapie conserve l’état diabétique avec une courbe de croissance normale (sans perte de poids habituel observée chez un animal diabétique). Cela peut entraîner une plus grosse garniture épiploïques, qui est idéal pour mener à bien la transplantation.
2. Implantation de l’insuline pellets
   1. Anesthésier le rat en utilisant l’anesthésie de gaz (3 % isoflurane dans 500 mL/min O₂) et placer le rat en position couchée.
   2. Vérifier état d’anesthésie en vérifiant l’absence de réflexe (pincement de la patte). Nettoyer le cou à l’aide de la polyvidone iodée et raser la zone à l’aide d’une lame de rasoir. Appliquez de nouveau polyvidone iodée et laissez-le reposer pendant 3 min.
   3. 1,5 place insuline granulés (3 unités (U) / rat 200 g) dans une solution d’iode de povidone dilué 1:5 pour stériliser les pellets. Percer la peau du cou à l’aide d’un trocart de 16 G et insérer le culot en utilisant le guide meublé et le stylet. Récupérer le guide et le stylet et piquez un point unique. Polyvidone iodée permet de nettoyer le point.
      Remarque : Aucune gestion de la douleur post-opératoire n’était nécessaire car l’intervention était comparable à une injection sous-cutanée (SC).
   4. Laissez le rat récupérer de l’anesthésie et de veiller à ce que les rats aient accès à l’alimentation pour éviter l’hypoglycémie.
   5. Mesurer l’efficacité du pellet en mesurant la diminution de la glycémie après l’implantation.
   6. Vérifier l’efficacité de pellet en surveillant le niveau de glycémie chaque semaine pendant 1 mois.
   7. Inclure des rats dans la cohorte lorsqu’une mesure de queue veine C peptide sanguin est maintenue à moins de 200 pM 1 mois après l’implantation de granulés de l’insuline.
      Remarque : Vérifier les niveaux de C-peptide est obligatoire pour évaluer les animaux au départ avant la transplantation et confirmer leur état diabétique. Se produit une faible régénération de C-peptide toujours au cours du suivi. Le C-peptidemia le plus bas est révélatrice de la régénération le plus bas.

2. domiciliation : Intra-épiploïques matrice îlot remplissage

1. Préparation d’îlot-matrice de mélange.
   1. Préparer le support d’îlot visqueux dans une hotte à flux laminaire. Dissoudre la poudre d’alginate dans du PBS stérile à une concentration de 1,5 %. Stérilisez la préparation par passage à travers un filtre de 0,22 µm. Préparer 400 µL par destinataire.
      Remarque : N’importe quel genre d’hydrogel avec une viscosité appropriée pour l’injection avec une aiguille de 21 G peut être utilisé.
   2. Isoler les îlots des rats sains de Lewis (200-250 g) comme décrit précédemment¹².
   3. Compter nombre d’îlots en équivalents de l’îlot (IEQ) (un IEQ est considéré comme équivalent à un îlot pancréatique avec un diamètre de 150 µm)¹³.
   4. Dans une hotte à flux laminaire, préparer des aliquots de 7660-îlot équivalent (IEQ) dans un tube de 1,5 mL.
   5. Laver les parties aliquotes îlots avec 500 µL de milieu CMRL (Connaught Medical Research Laboratories) exempt de sérum de veau fœtal.
   6. Îlots de granule par centrifugation (2 min à 500 x g et 4 ° C). Jeter le surnageant.
   7. Ajouter 150 µL du transporteur de l’alginate hydrogel sur les îlots, mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas et placez le mélange sur la glace.
   8. Préparez une aiguille atraumatique à 21 G et une seringue de 1 mL sans volume mort en chargeant 150 µL d’alginate de vide dans la seringue.
   9. Remplir la seringue avec le mélange d’îlots et d’alginate (150 µL, volume total 300 µL). Conserver la seringue sur la glace.
2. Intervention chirurgicale
   1. Stériliser les instruments chirurgicaux à l’aide de stérilisation à froid (2 % Stéranios pendant 20 min).
   2. Anesthésier le rat en utilisant l’anesthésie isoflurane et placez le rat en position couchée.
   3. Raser la zone du cou à l’aide d’une lame de rasoir et stériliser l’espace avec la povidone iodée. L’iode, laissez reposer pendant 3 min.
   4. Faire une incision à l’aide d’un scalpel et enlever les plombs de le 1,5 insuline avec une pincette. Fermer la peau à l’aide d’un ou deux points de couture unique. Ne retirez pas le rat de l’anesthésie.
      Remarque : Après 1 mois, le plomb peut être friable comme certains tissus fibreux peuvent s’enrouler comme granules ; utiliser des ciseaux à disséquer correctement il.
   5. Placez le rat en décubitus dorsal. Se raser et de stérilisation (à la polyvidone iodée) la zone péritonéale. L’iode, laissez reposer pendant 3 min.
   6. Créer une laparotomie 1,5 cm juste sous le sternum à l’aide d’un scalpel. Placez une gaze stérile humide autour du secteur incisé.
   7. Identifier l’épiploon qui est les coussinets adipeux localisé à côté de l’estomac. Forceps permet d’attraper l’épiploon soigneusement, tirez doucement dans la cavité péritonéale et l’étaler sur la gaze.
      Remarque : Le tissu épiploïques s’étend de la rate au duodénum et l’attache à son point médian à l’estomac. L’épiploon normale des rats diabétiques recevant un traitement par insuline est environ 2 cm² alors étalées sur la gaze.
   8. Hydrater le tissu épiploïques bien à l’aide de 2 mL de sérum physiologique stérile préchauffé 37 ° C. Petites pinces courbes permet de manipuler les tissus et pénétrer le bord épiploïques avec l’aiguille entre les couches épiploïques. Insérer l’aiguille entièrement.
   9. Commencez lentement, l’injection de la préparation de l’îlot et déplacer délicatement l’aiguille vers l’arrière pour injecter les îlots en plusieurs endroits (sous forme de lignes). Avant de retirer l’aiguille, faire en sorte que l’hydrogel a cessé de sortir l’aiguille pour éviter la perte des îlots dispersés.
   10. Recommencer cette manipulation si nécessaire d’injecter la totalité du contenu de la seringue à l’aide de différents points d’entrée pour distribuer les îlots dans le tissu épiploïques.
       Remarque : Chez les rats, les quatre ou cinq injections sont généralement nécessaires.
   11. Vérifiez que les îlots ne sont pas groupés dans la seringue à la fin des injections.
       Remarque : Si certains îlots sont encore visibles, qu'il est possible de retirer l’aiguille de la seringue, remplissez la seringue directement avec 100 µL d’hydrogel vide et reconnectez l’aiguille. Une deuxième série d’injection peut être faite pour débusquer les îlots restants.
   12. Réutiliser du sérum physiologique stérile pour hydrater le tissu épiploïques et le mur de la laparotomie. Forceps permet de remplacer soigneusement épiploon dans la cavité abdominale.
   13. Injecter 2 mL de sérum physiologique stérile préchauffé dans la cavité abdominale pour réhydrater le rat.
   14. Fermer la paroi musculaire à l’aide d’une suture fil continu. Puis piquer la couche cutanée dont le seul point point (point par point).
   15. Injecter par voie sous-cutanée meloxicam (1,5 mg/kg) comme analgésique pendant 5 jours une fois par jour.
   16. Place le rat dans une cage sur un coussin chauffant jusqu'à la guérison de l’anesthésie. Répétez l’opération pour tous les rats destinataires.
   17. Mesurer la glycémie après une greffe de tous les jours. Si la glycémie est > 2 g/L, 6 U d’insuline d’action prolongée injecter par voie sous-cutanée une fois par jour.
   18. Évaluer la fonction du greffon en glycémie, c-peptidemia en surveillant plus 1 ou 2 mois.
       Remarque : En cas de transplantation réussie, la glycémie devrait se stabiliser dans les 2-5 jours après la transplantation, et des rats peuvent être enlevés de l’insuline.

3. épiploïques greffon Explantation

Remarque : Cette procédure permettra à la confirmation de la fonction du greffon bon. Après prélèvement d’un greffon fonctionnel, rat devrait revenir à un état diabétique. Cette opération s’effectue après 1 ou 2 mois de suivi métabolique.

1. Anesthésier le rat avec l’anesthésie de gaz et le placer dans la position en décubitus dorsal.
2. Raser la zone péritonéale et stériliser à l’aide de povidone iodée pendant 3 min.
3. Créer une laparotomie 1,5 cm juste sous le sternum à l’aide d’un scalpel. Placer les compresses humides tout autour du incisés.
4. Identifier l’épiploon, qui se trouve à côté de l’estomac. Forceps permet d’étaler soigneusement sur la gaze.
5. Utiliser des ciseaux à exciser l’épiploon. Début de la partie qui adhère sur la queue du pancréas (à côté de la rate). Si le saignement se produit, utiliser une gaze stérile sèche pour l’arrêter.
6. Continuer l’excision le long de la partie attachée à l’estomac et récupérer l’épiploon.
   Remarque : À cet endroit, les artères gastro (Figure 1) peuvent provoquer une grande quantité de saignement si elles sont accidentellement coupés. Artère incisions sont inévitables pour récupérer la prothèse, mais saignements peuvent être gérées à l’aide de pinces et gaze. Si une coupure accidentelle se produit, comprimer fermement avec une gaze sèche et maintenir la compression pendant au moins 1 minute. Le saignement devrait s’arrêter. Si ce n’est pas le cas, utiliser des clips ou utiliser un bistouri électrique pour cautériser les vaisseaux.

Figure 1 : distribution de l’artère épiploïques. Pour l’explantation greffon épiploon, la zone critique, composée des artères gastro est représentée en bleu. Au cours de la résection de la présente partie du tissu épiploïques, attention doit être versée à la section de l’artère droite gastro. Compression, ligature ou cautérisation peut servir à limiter un saignement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

7. Vérifiez si des saignements persiste. Sinon, injecter 2 mL de solution saline préchauffée, fermer le rat et traiter comme décrit précédemment.
    Animaux explantés retourne à un état diabétique. L’injection d’insuline (6 U/SC/jour) est alors obligatoire afin d’assurer le bien-être des animaux.
8. Euthanasier le rat 10 à 12 jours après l’extraction à l’aide d’une surdose de pentobarbital (182,2 mg/kg).

4. histologique analyse : Hématoxyline et éosine coloration

1. Fixer l’omenta récupérée à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et incorporer à la paraffine.
2. Couper des sections 4 µm d’épaisseur et d’appliquer la coloration hématoxyline et éosine pour évaluation morphologique de la transplantation.

5. analyse statistique

1. Déterminer la signification statistique à l’aide de logiciel d’analyse statistique et les mesures répétées analyse de variance (ANOVA) avec test de différence de signification honnête de Tukey comme un test post-hoc. Représenter les valeurs de p comme : *p < 0,05 ; p < 0,01 ; p < 0,001.

La méthode autoguidage permet l’évitement d’implantation intravasculaire et l’isolement des îlots dans un organe. Il faut un temps maximum de 8-10 min pour la procédure d’implantation îlot entier, y compris l’anesthésie, qui un scénario comparable à une transplantation hépatique classique.

Afin d’étudier la façon dont les îlots sont distribués à l’intérieur du tissu épiploïques, perles de dextran ont été transplantés à l’aide de la méthode de guidage (Figure 2). Un jour après l’implantation, des rats ont été sacrifiés et omentaux tissus récupérés pour analyse histologique. L’hématoxyline et éosine coloration a révélé une distribution uniforme des perles dans le tissu (Figure 2en bas à droite). Très souvent, les perles étaient proches des vaisseaux sanguins et étaient bien implantés dans le tissu adipeux. Immédiatement après l’implantation, une réaction inflammatoire se produit autour de la perle, résultant dans le réarrangement de tissu d’imbriquer les îlots dans le tissu.

Figure 2 : Description de radioralliement distribution technique et de la perle au travers du tissu épiploïques un jour après l’implantation. (A) Illustration de la technique de guidage. Après l’exposition d’orgue (A, gauche), le mélange de l’islet-hydrogel (remplacé ici par des billes de couleur bleue dextran pour meilleure visualisation) a été soigneusement injecté dans le tissu à l’aide d’une aiguille atraumatique (un, au milieu). Implanté dans le tissu de perles sont visible (A droite). (B) l’hématoxyline et éosine coloration d’épiploon explantées 1 jour après l’injection de perle. Perles sont trouvent dans le tissu avec une distribution uniforme. Echelle = 100 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour valider cette technique, nous avons effectué des études isogéniques utilisant des rats Lewis (n = 8). Des rats diabétiques recevant des greffes d’îlots (équivalent de l’îlot de 7660, IEQ) par kg de poids corporel rat à l’aide de domiciliation ont été suivies pour la glycémie et C-peptidemia pendant deux mois. Glycémie était contrôlée par l’implantation de la pastille de l’insuline (qu’attestant de la première baisse de glycémie observée dans le Figure 3 a). Fonction du greffon s’est traduite par la glycémie d’environ 2 g/L et C-peptidemia > 500 h. Avant la transplantation, les rats étaient diabétiques (glycémie > 5 g/L et C-peptidemia < 200 pM). Après la transplantation et la récupération de granulés de l’insuline, la normalisation et maintien de la glycémie a été observée juste 3 jours après transplantation d’autoguidage et a été maintenue jusqu’au prélèvement de greffon (p < 0,05 par rapport à la transplantation des niveaux). Après explantation épiploïques, glycémie a de nouveau augmenté au niveau pré transplantation, attestant de la fonctionnalité d’îlots qui ont été transplantés par autoguidage (Figure 3 a). Le patron de C-peptidemia était exactement le contraire, avec de faibles à des niveaux indétectables avant la greffe, suivie d’une augmentation et le maintien à ce niveau accru tout au long de l’étude (p < 0,05) et, après l’explantation épiploïques, un diminuer avant transplantation niveaux (Figure 3 b). Analyse de l’épiploon explanté par histologie a révélé des îlots fortement re-vascularisés, probables en raison de leur proximité aux vaisseaux sanguins (Figure 3).

Figure 3 : suivi métabolique de deux mois des rats recevant évaluation hOMING et greffon. Glycémie (A) mesure et évaluation (B) C-peptide après hOMING utilisant l’alginate comme un transporteur de l’îlot (Tx : Transplantation et la récupération de l’insuline de pellet ; Explantation : Explantation de l’épiploon). Greffes sont fonctionnels, comme le montre le maintien de la normoglycémie après récupération de granulés de l’insuline et augmentent C-peptidemia après l’implantation de l’îlot. Les zones ombragées grises représentent les valeurs minimales et maximales à chaque instant. (C) l’hématoxyline et éosine souillure d’une section épiploïques après transplantation d’îlots à l’aide de la méthode de radioralliement. Îlots sont bien intégrées dans le tissu de deux mois après l’implantation sans n’importe quel tissu fibrotique environnante. Les navires ont grandi autour et à l’intérieur des îlots, comme indiqué par les flèches et donc complètement rétablir le fonctionnement de l’îlot. Morphologie des îlots semble aussi bien conservée. Barreaux de l’échelle = 50 µm. (n = 8) (*p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001 déterminée à l’aide de mesures répétées analyse de variance (ANOVA) avec test de différence de signification honnête de Tukey comme un test post-hoc). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.