Nous présentons un test de fluorescence pour démontrer que Lucifer Yellow (LY) est un marqueur robuste pour déterminer la perméabilité paracellulaire apparente des monocouches de cellules hCMEC/D3, un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique humaine. Nous avons utilisé cet exemple pour déterminer la cinétique d'une formation de monocouches confluentes dans les cellules cultivées de hCMEC/D3.
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Article de méthode
Lucifer Yellow - Un marqueur de perméabilité paracellulaire robuste dans un modèle cellulaire de la barrière de sang-cerveau humain
Dans cet article
Résumé
Résumé
La barrière hémato-encéphalique BBB se compose de cellules endothéliales qui forment une barrière entre la circulation systémique et le cerveau pour empêcher l'échange d'ions non essentiels et de substances toxiques. Les jonctions serrées (TJ) scellent efficacement l'espace paracellulaire dans les monocouches, ce qui donne lieu à une barrière intacte. Cette étude décrit un analyse de fluorescence basée sur LY qui peut êtreutilisé pour déterminer son coefficient de perméabilité apparente (application P ) et à son tour peut être utilisé pour déterminer la cinétique de la formation de monocouches confluents et la jonction serrée résultante l'intégrité de la barrière dans les monocouches hCMEC/D3. Nous démontrons en outre une utilité additionnelle de cet analyse pour déterminer l'intégrité fonctionnelle de TJ dans les cellules transfected. Nos données de l'analyse de l'application LY P montrent que les cellules hCMEC/D3 ensemant dans une configuration de transwell limitent efficacement le transport paracellulaire LY 7 jours-post culture. En tant qu'utilité supplémentaire de l'analyse présentée, nous démontrons également que la transfection de nanoparticules d'ADN ne modifie pas le transport paracellulaire de LY dans les monocouches de hCMEC/D3.
Introduction
La barrière hémato-encéphalique (BBB) est la barrière protectrice limitant l'afflux de composants plasmatiques dans le tissu cérébral et se compose de cellules endothéliales du cerveau ainsi que de cellules de soutien telles que les péritéytes. Le rôle principal de BBB est de servir de barrière qui scelle l'espace entre le sang périphérique et le système nerveux central (SNC) pour maintenir l'hémostase du microenvironnement neuronal1,2. Les cellules endothéliales capillaires du cerveau scellent efficacement la voie paracellulaire par la formation de jonctions intercellulaires serrées (TJs)1
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Protocole
1.Général hCMEC/D3 culture cellulaire
- Réanimation de cellules congelées
REMARQUE : Tous les entretiens et expériences de culture cellulaire ont été exécutés à l'intérieur d'une hotte stérile de biosécurité. Les supports culturels, les suppléments et les réactifs ont été achetés comme produits stériles ou stérilisés par filtration à l'aide d'un filtre à membrane de 0,22 m pour prévenir la contamination microbienne.- Ajouter 8,5 ml de solution de collagène (0,15 mg/ml) dans un flacon de culture tissulaire (75 cm2 zone de croissance; désormais appelé T75) et le placer dans un incubateur (37 oC, 5 % CO2) pendant 1....
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Résultats
Tout d'abord, nous avons déterminé l'effet du temps de culture sur la perméabilité de LY pour déterminer les cinétique apparentes de la formation de TJ. Les valeurs moyennes de l'application LY P du jour 1 à 10 après l'ensemencement sont indiquées dans la figure 2a. Le jour 1, l'application P moyenne était de 4,25 x 10-4 cm/min et a légèrement chuté à 3,32 x 10-4 cm/min le jour 2. La valeur moyenne de l'a.......
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Discussion
Un rôle clé du BBB est d'empêcher l'échange d'ions non essentiels et de substances toxiques entre la circulation systémique et le cerveau pour maintenir l'hémostase du microenvironnement neural. Une des caractéristiques du BBB est la capacité des cellules endothéliales capillaires à former des jonctions serrées (TJs) qui scellent efficacement la voie paracellulaire du transport. Nous avons démontré un essai d'application de LY P comme méthode quantitative pour déterminer la cinétique apparente de la formation .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants du soutien financier du New Investigator Award 2017 de l'American Association of Pharmacy, d'un prix Hunkele Dreaded Disease de l'Université Duquesne et des fonds de démarrage de l'École de pharmacie pour le laboratoire Manickam. Nous tenons à remercier le laboratoire Leak (Université Duquesne) pour l'aide à l'ouest de l'adjonction et l'utilisation de leur imageur Odyssey 16 bits. Nous aimerions également inclure une note spéciale d'appréciation pour Kandarp Dave (laboratoire Manickam) pour l'aide avec le ballonnement occidental.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lignée cellulaire hCMEC/D3 | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | lignée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines ; |
| gWizLuc | Aldevron ; | 5000-5001 | ADN plasmidique codant pour le gène de la luciférase |
| lucifer jaune CH sel de dilithium ; | Inserts Invitrogen | 155267 | |
| Transwell avec membranes en polyéthylène téréphtalate (PET) | Falcon | 353095 | |
| Flacon de culture tissulaire ; | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24 puits à fond plat ; | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Noir 96 Puits Immuno Plaques ; | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Cellule endothéliale basal medium-2(EBM-2) ; |
| solution saline tamponnée au phosphate 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagène de type I ; | Discovery Labware, Inc. | Kit de | |
| dosage des protéines 354236 Pierce BCA ; | Thermo Scientific | 23227 | |
| Réactif de lyse de culture cellulaire 5X ; | Promega | E1531 | |
| Coccinelle Luciférine, Sel de Potassium ; | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 ; | Dispositifs | Lecteur de plaques de fluorescence | |
| Trypan Blue Solution, 0,4 % | |||
| ZO-1 | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anticorps anti-GAPDH | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugué AffiniPure Donkey Anti-souris LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12 puits, fond plat | Olympus Plastics | 25-106 | |
| Tampon RIPA (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey Imageur CLX | LI-COR Biosciences | pour le balayage des membranes de western blot |
Références
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
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Réimpressions et autorisations
