Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Summary

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Abstract

La présence, l’absence ou niveaux de protéines synaptiques spécifiques peuvent influencer considérablement la transmission synaptique. En plus d’élucider la fonction d’une protéine, il faut également déterminer sa diffusion. Nous décrivons ici un protocole utilisant l’immunofluorescence, microscopie confocale et l’analyse assistée par ordinateur pour déterminer la distribution de la protéine synaptique Mover (également appelé TPRGL ou SVAP30). On compare la distribution de Mover à celui de la vésicule synaptique protéine synaptophysine, déterminant ainsi la distribution de Mover de manière quantitative par rapport à l’abondance des vésicules synaptiques. Notamment, cette méthode pourrait potentiellement être mises en œuvre pour permettre une comparaison de la distribution des protéines à l’aide d’anticorps différents ou microscopes ou à travers différentes études. Notre méthode contourne la variabilité inhérente des salissures par immunofluorescence en cédant un rapport plutôt que des niveaux de fluorescence absolue. En outre, la méthode que nous décrivons permet au chercheur d’analyser la distribution d’une protéine à différents niveaux : des tranches de cerveau entier de régions du cerveau dans différentes sous-régions dans la zone d’un cerveau, telles que les différentes couches de l’hippocampe ou sensorielles cortex. Mover est une protéine spécifique vertébré associé de vésicules synaptiques. Avec cette méthode, nous montrons que le déménageur est hétérogène dans les zones du cerveau, avec des concentrations élevées dans le pallidum ventral, les noyaux septums et l’amygdale et aussi dans les zones du cerveau unique, telles que les différentes couches de l’hippocampe.

Introduction

Communication entre les neurones se passe à des sites de contact spécialisées appelées synapses. Synapses contiennent une multitude de différentes protéines qui orchestrent la transmission synaptique. Certaines de ces protéines présentent une distribution hétérogène dans le système nerveux et ne sont pas présents dans chaque synapse¹. Un exemple d’une telle protéine est Munc13, qui est impliqué dans le processus d’amorçage de vésicules synaptiques. Il existe différentes isoformes de Munc13, qui sont hétérogène dans tout le cerveau², et la présence ou l’absence des isoformes spécifiques peut influer sur la plasticité syna....

Protocol

Ce protocole n’implique pas d’expériences sur des animaux vivants. Expériences portant sur l’euthanasie des animaux pour prélever des échantillons de cerveau ont été approuvées par les autorités locales de protection animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sous le numéro T 10/30.

Remarque : Pour ce protocole, 3 souris C57BL/6 mâles adultes ont été utilisées.

1. préparation de l’échantillon

1. Préparer le fixateur et tamponné au phosphate 0,1 M (PB ; voir tableau 1).
2. Difficulté de l’animal par la perfusion de transcardial comme décrit en Gage et al.

Results

Représentant de modèles de différents marqueurs de coloration peut être vu dans la Figure 1. Le modèle varie en fonction de la répartition de la protéine. Exemples de cinq niveaux rostro-caudal sont indiqués dans les colonnes (A)-(E). Une souillure de DAPI représentatif est montrée dans la première rangée : DAPI adhère à l’ADN d’une cellule et donc les noyaux sont colorés. Il en résulte un motif ponctué. Les régions présentan.......

Discussion

La méthode présentée ici vise à quantifier la distribution d’une protéine d’intérêt par rapport à l’abondance d’une protéine marqueur avec une aire de répartition connue. Immunofluorescence souillant peut montrer une forte variabilité des intensités entre les différentes tranches de coloration. La méthode de quantification décrite ici contourne ce problème en déterminant la proportion de la protéine d’intérêt à la moyenne dans l’ensemble de l’hémisphère. Par conséquent, différentes intensités de coloration dans les tranc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes réactionnels de 1,5 mL	Eppendorf	30120094
tubes réactionnels de 50 mL	Greiner Bio-One	227261
multipuits 24 puits	Fisher Scientific	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 087721H
pipette en plastique (jetable)	Sarstedt	861,176
1000 mL	pipette Rainin	;
pipette de 2 ml	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	Lames	3340001
Menzel	Fisher Scientific	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 10144633CF
Stéréoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Microscope confocal
microtome de congélation	Leica
PBS (10X)	Roche	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
PFA	Sigma	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
saccharose	neoFroxx	1104KG001
Tissu Tek	Sakura  ;	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
sérum de chèvre normal	Merck Millipore	S26-100ML
sérum d’âne normal	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
anti-Mover de lapin	Synaptic Systems	RRID : AB_10804285
cobaye anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID : AB_1210382
âne anti-lapin AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID : AB_2492288
chèvre anti-souris AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID : AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
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