Article de méthode

Utilisation de microréseaux pour interroger l'impact microenvironnemental sur les phénotypes cellulaires dans le cancer

DOI :

10.3791/58957

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21 mai 2019

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1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

Dans cet article

Résumé

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Le but de la méthode présentée ici est de montrer comment les microréseaux microenvironnements (MEMA) peuvent être fabriqués et utilisés pour interroger l'impact de milliers de microenvironnements combinatoires simples sur le phénotype des cellules cultivées.

Résumé

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Comprendre l'impact du microenvironnement sur le phénotype des cellules est un problème difficile en raison du mélange complexe de facteurs de croissance solubles et de protéines associées à la matrice dans le microenvironnement in vivo. En outre, les réactifs facilement disponibles pour la modélisation des microenvironnements in vitro utilisent généralement des mélanges complexes de protéines qui sont incomplètement définis et souffrent de la variabilité de lot à lot. La plate-forme microenvironnement microréseau (MEMA) permet d'évaluer des milliers de combinaisons simples de protéines microenvironnement pour leur impact sur les phénotypes cellulaires en un seul test. Les MEMA sont préparés dans des plaques de puits, ce qui permet l'ajout de ligands individuels pour séparer les puits contenant des protéines de matrice extracellulaire (ECM). La combinaison du ligand soluble avec chaque ECM imprimé forme une combinaison unique. Un analyse meMA typique contient plus de 2 500 microenvironnements combinatoires uniques auxquels les cellules sont exposées en un seul analyse. Comme cas d'essai, la ligne de cellules de cancer du sein MCF7 a été plaquée sur la plate-forme de MEMA. L'analyse de cet analyse a identifié des facteurs qui améliorent et inhibent la croissance et la prolifération de ces cellules. La plate-forme MEMA est très flexible et peut être étendue pour une utilisation avec d'autres questions biologiques au-delà de la recherche sur le cancer.

Introduction

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La culture des lignées de cellules cancéreuses sur le plastique dans les monocouches bidimensionnelles (2D) demeure l'un des principaux chevaux de bataille pour les chercheurs sur le cancer. Cependant, le microenvironnement est de plus en plus reconnu pour sa capacité à avoir un impact sur les phénotypes cellulaires. Dans le cancer, le microenvironnement de tumeur est connu pour influencer les comportements cellulaires multiples, y compris la croissance, la survie, l'invasion, et la réponse à la thérapie1,2. Les cultures traditionnelles des cellules monocouches n'ont généralement pas d'influences microenvironn....

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Protocole

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REMARQUE: Un aperçu de l'ensemble du processus MEMA, y compris le temps estimé, est décrit dans le diagramme de débit indiqué à la figure 1. Ce protocole détaille la fabrication des MEMA dans des plaques de 8 puits. Le protocole peut être adapté pour d'autres plaques ou diapositives.

1. Préparation de tampons de protéines, de diluants et de taches

  1. Équilibrez les flacons d'ECM, de ligands et de cytokines à température ambiante (RT) et brièvement centrifugeuse. Ajouter le volume approprié de la mémoire tampon RT appropriée indiquée sur la feuille de données du produit. Suivez la recomma....

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Résultats

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Afin de simplifier les impacts microenvironnementaux sur la croissance et la prolifération des cellules et d'identifier les conditions qui ont favorisé ou inhibé la croissance et la prolifération cellulaires, la lignée cellulaire du cancer du sein MCF7 a été enseve sur un ensemble de huit MEMA de huit puits tels que décrits dans le protocole. Cet analyse a exposé les cellules à 48 ECM différents et 57 ligands différents, pour un total de 2736 conditions micro-environnementales combinatoires. Après 71 h dans la culture, l.......

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Discussion

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L'importance de la « dimensionnalité » et du contexte a été un facteur motivant dans le développement de systèmes de culture in vitro comme outils dans la caractérisation des cellules cancéreuses par leur interaction avec le microenvironnement11, et la capacité de l'in vitro les systèmes de culture pour imiter l'environnement in vivo est une force motrice derrière la quête pour améliorer ces systèmes de culture. Les systèmes in vitro, cependant, restent des outils importants de la recherche sur le.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Ce travail a été appuyé par la subvention HG008100 (J.W.G., L.M.H.et J.E.K) de la Bibliothèque des signatures cellulaires de réseau (LINCS) du Fonds commun des NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aushon 2470Système robotique Aushon BioSystemsArrayer utilisé dans le protocole
Nikon HCASystèmed’imagerie à haut contenu conçu autour de Nikon Eclipse Ti Microscope inversé
BioTek Precision XS Manipulateur de liquidesBioTekRobot de manipulation de liquides
Solution tampon de chlorhydrate TrizmaSigmaT2069
EDTAInvitrogen15575-038
GlycérolSigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
Tween 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
384 puits Plaque de microarray, puits cylindriqueThermo Fisherab1055
Nunc 8 puitsplat Thermo Fisher267062
Paraformaldéhyde 16 % solutionMicroscopie électronique Science15710
BSAFisherBP-1600
Azoture de sodiumSigmaS2002
Sondes moléculairesmasque cellulaireH32713
Click-iTEdUSondes moléculairesAlexa C10357
DAPIPromo KinePK-CA70740043
ALCAMR & D Systems656-ALECM
Cadhérine-20 (CDH20)R & D Systems5604-CAECM
Cadhérine-6 (CDH6)R & D Systems2715-CAECM
Cadhérine-8 (CDH8)R & D Systems188-C8ECM
CD44R & D Systems3660-CDECM
CEACAM6R & D Systems3934-CMECM
Collagène ICultrex3442-050-01ECM
Collagène Type IIMilliporeCC052ECM
Collagène Type IIIMilliporeCC054
ECM Collagène Type IVSigmaC5533ECM
Collagène Type VMilliporeCC077ECM
COL23A1R & D Systems4165-CLECM
Desmoglein 2R & D Systems947-DMECM
E-cadhérine (CDH1)R & D Systems648-ECECM
ECM1R & D Systems3937-ECECM
FibronectineR & D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D SystemsGLR002ECM
HyA-50KR & D SystemsGLR001ECM
ICAM-1R & D Systems720-ICECM
LamininSigmaL6274ECM
Laminin-5Abcamab42326ECM
LumicanR & D Systems2846-LUECM
M-Cad (CDH15)R & D Systems4096-MCECM
Nidogen-1R & D Systems2570-NDECM
Ostéoadhéine/OSADR & D Systems2884-ADECM
Ostéopontine (SPP)R & D Systems1433-OPECM
P-Cadherin (CDH3)R & D Systems861-PCECM
PECAM1R & D SystemsADP6ECM
Tenascin CR & D Systems3358-TCECM
VCAM1R & D SystemsADP5ECM
VitronectinR & D Systems2308-VNECM
BiglycaneR & D Systems2667-CMECM
DecorinR & D Systems143-DEECM
PeriostinR & D Systems3548-F2ECM
SPARC/ostéonectineR & D Systems941-SPECM
Thrombospondine-1/2R & D Systems3074-THECM
BrevicanR & D Systems4009-BCECM
ElastinBioMatrix5052ECM
FibrillineLynn Sakai Lab OHSUN/AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025Ligand
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005Ligand
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010Ligand
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200Ligand
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OSLigand
BMP6RnD_Systems_Own507-BP-020Ligand
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005Ligand
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010Ligand
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050ligand
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005Ligand
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010Ligand
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286Ligand
LEPRnD_Systems_Own398-LP-01MLigand
FGF2Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UGLigand
FGF6RnD_Systems_Own238-F6Ligand
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005Ligand
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025Ligand
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010Ligand
WNT10AGenemed_Own90009Ligand
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050Ligand
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100Ligand
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010Ligand
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010Ligand
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010Ligand
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020Ligand
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050Ligand
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050Ligand
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010Ligand
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050Ligand
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010Ligand
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005Ligand
TNFRnD_ Systems_Own210-TA-020Ligand
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025Ligand
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010Ligand
PDGFABRnD_Systems_Own222-ABLigand
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100Ligand
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050Ligand
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010Ligand
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010Ligand
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010Ligand
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010Ligand
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010Ligand
NRG1RnD_Systems_Own378-SMLigand
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025Ligand
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025Ligand
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010Ligand
BioTek utilisé dans le protocole de fluor

Références

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  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Med....

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Mots-clés

Microenvironment MicroarrayExtracellular Matrix ProteinsLigand TreatmentCell Proliferation AssayFluorescent ImagingCellProfiler AnalysisEdU IncorporationBreast Cancer CellsMicroenvironmental FactorsAutomated Imaging

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