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REMARQUE: Un aperçu de l'ensemble du processus MEMA, y compris le temps estimé, est décrit dans le diagramme de débit indiqué à la figure 1. Ce protocole détaille la fabrication des MEMA dans des plaques de 8 puits. Le protocole peut être adapté pour d'autres plaques ou diapositives.
1. Préparation de tampons de protéines, de diluants et de taches
- Équilibrez les flacons d'ECM, de ligands et de cytokines à température ambiante (RT) et brièvement centrifugeuse. Ajouter le volume approprié de la mémoire tampon RT appropriée indiquée sur la feuille de données du produit. Suivez la recommandation du fabricant concernant les concentrations de stocks.
REMARQUE: Une liste complète des ligands et des ECM avec leur stock et leurs concentrations finales sont fournies dans le tableau 1 et le tableau 2. Les ligands et les ECM sont généralement utilisés à la plus forte concentration de la gamme recommandée par le fabricant qui provoque un effet biologique dans les essais de culture standard de 2 jours. Manipulez les protéines en douceur et dans des armoires de biosécurité sous un débit laminaire afin d'éviter la contamination.
- Incuber les flacons avec un basculement doux à RT pendant 1 h. Ne pas vortex protéines car cela peut les amener à dénaturer.
- Protéines Aliquot pour le stockage à long terme de sorte que tous les aliquots sont une seule utilisation seulement pour éviter la dégradation avec des cycles répétés de gel / dégel. Conserver les protéines lyophilisées à -80 oC (sauf indication contraire) jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires. Veillez à recueillir toutes les métadonnées pour référence future, telles que : (i) nom de protéine, (ii) date préparée, (iii) numéro de lot/lot, (iv) fournisseur, (v) numéro de catalogue, (vi) concentration, (vii) volume, et (viii) préparateur.
- Préparer un tampon diluant contenant 20 % (v/v) de glycérol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 et filtrer la stérilisation. Gardez ce tampon stérile et entreposez-le à RT.
- Préparer un tampon de coloration contenant 2 % (w/v) BSA, 1 mM MgCl2et 0,02 % NaN3 en salin tamponné par phosphate (PBS). Filtrer et conserver à 4 oC.
2. Préparation d'une plaque source ECM
- Enlever les stocks de protéines ECM aliquoted à imprimer et décongeler sur la glace. Enregistrez tous les numéros de lot pour le suivi des métadonnées.
- Flick tubes de protéines décongelées doucement pour assurer une résuspension appropriée et spin vers le bas dans une centrifugeuse.
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Faire des mélanges d'impression ECM (EPM) et un fiducial fluorescent qui sera utilisé par un robot de manipulation liquide qui créera les plaques aléatoires de 384 puits.
REMARQUE : Les plaques de source de 384 puits seront utilisées par une imprimante à broches tactiles pour créer les tableaux imprimés dans 8 plaques de puits.
- Étiqueter les tubes microcentrifuges de 1,5 mL pour chaque EPM et le fiducial.
- Préparer chaque EPM en combinant 125 l de tampon diluant (voir l'étape 1.4) avec le volume approprié de stock ECM et porter le mélange jusqu'à un volume total de 250 'L avec PBS. Les concentrations finales dans chaque tube EPM seront 1x protéine ECM, 5 mM EDTA, 10% de glycérol et 100 mM Tris.
- Préparer un fiducial fluorescent en le dissolvant dans le tampon approprié spécifié par le fabricant et transférer 250 L sur un tube fiducial étiqueté.
3. Création de la plaque source à l'aide d'un manutentionnaire liquide
- Concevoir une disposition de plaque de 384 puits qui randomise les positions des ECM et est optimisée pour la tête d'épingle d'imprimante de tableau utilisée. Concevoir le placement du fiducial de sorte qu'il sera imprimé dans la rangée 1, colonne 1 position de chaque puits pour aider à l'orientation du tableau.
REMARQUE: Au total, 14 à 15 répliques de chaque ECM sont utilisées pour garantir des données robustes. Inclure des répliques supplémentaires de collagène ou d'un autre ECM qui donne une fixation robuste pour l'évaluation de l'uniformité de la liaison. La disposition peut avoir besoin d'utiliser plusieurs plaques de 384 puits en fonction du nombre d'ECMd d'intérêt.
- Transférer les tubes EPM à un gestionnaire liquide, en maintenant les tubes à 4 oC soit avec un support à tube refroidi ou à l'aide d'un robot de manutention liquide situé dans une chambre froide.
- À l'aide du logiciel du gestionnaire de liquide, exécutez un programme pour transférer 15 L de chaque EPM et le fiducial aux puits prédésignés dans la plaque source de 384 puits.
- Pipet PBS dans tous les puits inutilisés pour augmenter l'humidité et se prémunir contre la dessiccation pendant le processus d'impression.
REMARQUE: Voir Figure 2 pour un exemple d'un ensemble de plaques de source de 384 puits qui est optimisé pour une tête de 4 x 7 broches et comprend un bloc de collagène I et PBS.
- Sceller la plaque et conserver à 4 oC jusqu'au moment de l'impression.
4. Impression meMA à l'aide d'un robot d'impression Array
REMARQUE: La partie suivante du protocole décrit spécifiquement la préparation et l'utilisation de MEMA pour étudier l'impact de différentes protéines microenvironnement sur la croissance et la prolifération des cellules MCF7. Cependant, le protocole peut facilement être adapté pour utiliser différents ligands, ECMs, et les cellules pour étudier d'autres lignées cellulaires et les points de terminaison d'intérêt.
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À l'aide d'une imprimante à broches tactiles, imprimez des EPM et des taches fiduciales dans 8 plaques de puits. Imprimez plusieurs répliques de chaque condition ECM pour assurer la reproductibilité.
REMARQUE : D'autres formats de plaques ou diapositives peuvent être utilisés pour l'impression, mais l'optimisation tampon peut être nécessaire pour atteindre une formation optimale de taches.
- Imprimez les EMC pour le MEMA à l'aide de broches de 350 m de diamètre disposées en configuration de tête d'impression 4 x 7. Imprimez les tableaux dans les plaques de 8 puits en 20 colonnes par 35 rangées, pour un total de 700 places. De plus grands tableaux sont possibles dans ces plaques, mais viennent avec un compromis des effets de bord accrus dans la liaison cellulaire et la coloration.
- Après l'impression, conserver les assiettes dans un dessiccateur pendant au moins 3 jours avant l'utilisation.
5. Création de plaques de traitement Ligand
- Concevoir une disposition de la plaque de 96 puits, y compris les ligands d'intérêt. Pour faciliter le traitement de nombreuses plaques MEMA à la fois, concevoir cette plaque avec l'espacement qui permet l'utilisation d'une tuyauterie multicanal avec 4 pointes espacées pour transférer des liquides entre les puits de 8-bien MEMaAs et une plaque de 96 puits.
REMARQUE: Dans ce protocole, l'ensemble complet des ligands énumérés dans le tableau 2 sont utilisés.
- Décongeler les ligands sur la glace. Faites glisser brièvement et faites tourner chaque tube.
- Diluer les ligands à un stock de travail 200x en utilisant le tampon recommandé par le fabricant (généralement PBS).
- Pipet 10 'L de chaque stock de ligand 200x dans le puits correspondant dans la plaque de 96 puits.
- Sceller et ranger les assiettes à -20 oC.
REMARQUE: Faire des plaques de traitement ligand par lots, en capturant toutes les métadonnées pour l'analyse en aval.
6. Cellules de culture sur meMAs
- Bloquer les MEMA pendant 20 min avec 2 ml par puits de tampon de blocage non encrassé contenant 1 % d'agent de blocage non encrassé (Tableau des matériaux) dans de l'eau double distillée (ddH2O).
- Aspirer le tampon de blocage et triple rinçage avec PBS. Pour éviter la dessiccation, laisser le volume final de PBS dans les puits jusqu'à ce qu'il soit prêt pour le placage cellulaire.
REMARQUE: Il est extrêmement utile d'avoir deux employés de banc pour les étapes de culture cellulaire sur les MEMA. Un employé de banc peut effectuer des étapes d'aspiration, tandis que le deuxième effectue des étapes d'addition. Il est recommandé d'utiliser une tuyauterie multicanal de 1 ml avec des pointes espacées pour correspondre à la plaque de 8 puits pour la pipetière et un Y-splitter avec deux pipettes Pasteur pour aspirer plusieurs puits à la fois.
- Seed 2 x 105 cellules MCF7 par puits dans 2 ml du milieu moyen modifié de Dulbecco Eagle (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SGF).
REMARQUE: Avant une expérience MEMA complète, effectuez une expérience de titration cellulaire pour optimiser le nombre de cellules de telle sorte que les taches MEMA ont un nombre élevé de cellules (mais ne sont pas confluents) à la fin de la durée expérimentale désirée.
- Après 2 à 18 h d'adhérence, aspirez à moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu à croissance réduite (DMEM avec 0,1 % de FBS).
REMARQUE: On peut utiliser à ce moment-là des conditions réduites de sérum (p. ex., 0,1 % de SGF) ou des conditions appauvries par les facteurs de croissance pour isoler l'impact stimulant de certains ligands.
- Décongeler une plaque de traitement ligand sur la glace. Plaque décongelée centrifugeuse à 200 x g pendant 1 min.
- Transférer 200 l de milieu de chaque puits dans la plaque de culture au puits approprié dans la plaque de traitement. Pipet de haut en bas pour mélanger le volume ligand avec le milieu et transférer ce mélange vers le puits approprié dans la plaque MEMA.
- Légèrement bercer à la main et remettre les plaques MEMA à l'incubateur. Culture pour la durée de l'expérience en présence de la combinaison ligand/ECM à 37 oC et 5 % CO2.
REMARQUE: Une expérience MEMA typique dure 72 h; les expériences de plus longue durée peuvent nécessiter le remplacement du moyen et le retraitement avec du ligand.
- Pulsez les puits MEMA à 71 h avec 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) pour une concentration finale de 10 M. Incubate dans des conditions expérimentales avec EdU pour 1 h à 37 oC et 5% CO2.
REMARQUE: D'autres traitements de cellules vivantes peuvent également être utilisés à ce moment.
7. Fixation et souillage des MEMA
- Après 72 h et tous les traitements cellulaires vivants, aspirater les puits. Fixer les MEMA en 2 ml par puits de 2 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 15 min à RT.
- Aspirez PFA. Perméabilize avec 2 ml par puits de 0,1% de surfactant nonionic pendant 15 min.
- Aspirer le surfactant nonionic et laver avec 2 ml par puits de PBS. Aspirez PBS. Laver avec 2 ml de PBS avec 0,05% polysorbate 20 (PBS-T).
REMARQUE: La surface du MEMA est hydrophobe, et le fait de ne pas se laver avec du PBS-T avant que la tache et l'incubation des anticorps n'entraînent la formation de vides dans les puits pendant les étapes d'incubation et donnent lieu à des artefacts de coloration.
- Aspirez PBS-T. Ajouter des réactifs de réaction de détection EdU. Incuber pendant 1 h à RT, basculer et protéger de la lumière. Après 1 h d'incubation, étancher la réaction avec le tampon d'étancher commercial fourni.
REMARQUE: La détection de l'EdU et les étapes de coloration/anticorps peuvent être effectuées en 1,5 ml par puits afin de réduire les coûts.
- Aspirez le tampon d'étance et lavez-le avec du PBS-T avant d'incuber avec des taches ou des anticorps.
- Incuber des puits MEMA avec des anticorps contre l'histone H3K9me3 (1:1 000) et de la fibrilline (1:400) dans un tampon de coloration contenant 2 % (w/v) d'albumine de sérum bovin (BSA), 1 mM MgCl2 et 0,02 % NaN3 pendant la nuit à 4 oC.
REMARQUE: Effectuez des titrations d'anticorps pour déterminer les concentrations optimales avant de les utiliser sur un ensemble COMPLET de MEMA.
- Après l'incubation primaire des anticorps ou des taches, lavez les puits 2x avec du PBS et une fois avec le PBS-T.
- Ajoutez des anticorps secondaires (igG anti-souris à ânes et IgG anti-lapin d'âne, tous deux 1:300) et 0,5 g/mL 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Incuber pour 1 h à RT dans l'obscurité.
- Laver les puits 2x avec 2 ml par puits de PBS, en les laissant dans les 2 derniers mL PBS.
- Passez à l'imagerie ou entreposez les MEMA tachés pour une imagerie ultérieure en PBS à 4 oC, à l'abri de la lumière.
8. Imagerie des MEMA
- Image MEMA sur un système d'imagerie automatisé avec des canaux de détection fluorescents appropriés.
- Sortie des données d'image résultantes vers un système de gestion d'image. Segmenter les cellules et calculer les niveaux d'intensité à l'aide de CellProfiler8.
9. Analyse des données
REMARQUE: L'analyse des données consiste en la normalisation, la correction des variations et la synthèse des données dérivées de CellProfiler brutes. Dans ce cas, l'environnement R avec code personnalisé est utilisé pour effectuer toutes les étapes. Cependant, tout environnement statistique ou logiciel peut être utilisé pour effectuer les actions équivalentes. Un exemple du code personnalisé open source pour l'environnement R pour analyse est disponible à: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Prétraiter et normaliser les données d'image segmentées.
- Déterminer le nombre de cellules ponctuelles à l'aide des noyaux tachés DAPI.
- Auto-porte EdU intensité pour étiqueter les cellules comme EdU. Mesurer la prolifération à l'aide de la proportion de cellules EdUà chaque endroit.
- Résumé médian des taches cytoplasmiques et des mesures de morphologie nucléaire au niveau de la tache.
- Effectuer la suppression de la normalisation des variations indésirables (RUV) sur les données afin d'améliorer la qualité des données9.
REMARQUE: Cette approche est appliquée à chaque signal d'intensité et de morphologie indépendamment comme une matrice avec des tableaux utilisant les lignes et les taches comme les colonnes comme décrit précédemment9.
- Appliquer la normalisation bivariée de loess aux résidus normalisés de RUV en utilisant la ligne de réseau et la colonne de réseau comme variables indépendantes pour corriger les effets spatiaux ou liés à l'intensité.
- Une fois la normalisation terminée, la médiane résume les répliques pour chaque état microenvironnement pour les rapports et les analyses plus poussées.