Nous présentons ici un protocole pour un dosage de communication intercellulaire de jonction gap roman conçu pour le criblage à haut débit de gap junction-modulation produits chimiques pour la découverte et l’évaluation toxicologique.
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Article de méthode
Un essai de Communication intercellulaire-jonction iodure-jaune Fluorescent Protein-Gap
Dans cet article
Résumé
Résumé
Jonctions lacunaires (JL) sont des canaux de la membrane cellulaire qui permettent la diffusion des molécules plus petite que 1 kDa entre des cellules adjacentes. Car ils ont des rôles physiologiques et pathologiques, on besoin de haut débit (HTS) de dépistage tests pour identifier les modulateurs GJ lors d’essais de toxicologie et découverte de drogue. Un dosage de jonction intercellulaire communication (I-YFP-CIJL) roman iodure-jaune fluorescent protein-gap répond à ce besoin. C’est un essai sur les cellules dont les cellules accepteur et donateurs qui ont été conçues pour exprimer stablement une variante de la protéine fluorescente jaune (YFP), dont la fluorescence est sensiblement piégée par iodure ou SLC26A4, un transporteur d’iodure, respectivement. Lorsque l’iodure est ajouté à une culture mixte des deux types cellulaires, ils entrer dans les cellules du donneur via le transporteur SLC26A4 et diffusent vers les cellules adjacentes accepteur via GJs où ils étancher la fluorescence de la YFP. YFP fluorescence est mesurée bien par bien en mode cinétique. Le taux d’extinction YFP reflète l’activité GJ. Le test est fiable et assez rapide à utiliser pour HTS Le protocole de l’essai j’ai-YFP-CIJL à l’aide des LN215 des cellules, cellules de gliome humain, est décrite.
Introduction
Jonctions lacunaires (JL) agissent comme des canaux intercellulaires pour permettre la diffusion de petites molécules de < 1 kDa comme nutriments, métabolites et molécules de signalisation entre des cellules adjacentes. Les éléments jonctionnelles comprennent un hémicanaux ou connexon dans chaque cellule et chaque connexon constitue six connexines (CX)1. JL et CX ont été utilisés dans les essais de toxicologie des carcinogènes comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), qui sont des inhibiteurs GJ2,3,4. CIJL perturbée a été associée par gé....
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Protocole
1. génération de lentivirus exprimant YFPQL et SLC26A4
- La croissance de cellules humaines embryonnaires de rein HEK293T à 80 % confluency sur les plaques de culture de 100 mm. Modifié Eagle (DMEM de Dulbecco) additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine est le milieu de culture utilisé dans tout le protocole pour maintenir HEK293T et autres cellules mentionnées ci-dessous.
- Plaques 6 puits culture manteau en ajoutant 2 mL de 0,005 % d’une solution stérile poly-L-lysine (PLL) dans chaque puits pendant 10 min. aspirer la solution PLL et rincer la surface deux fois avec 2 mL d’eau stérile.
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Résultats
Vingt-neuf plaques de 96 puits de culture ont été utilisées pour écran 2 320 produits chimiques afin d’identifier de nouveaux modulateurs CIJL essai CIJL YFP-j’ai de la LN215-YFPQL et LN215-j’ai− cellules. Les résultats obtenus avec une plaque représentante sont présentés dans la Figure 2. Le pourcentage de la fluorescence de la YFP dans chaque puits s’affiche comme un ligne graphique en Figure 2A
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Discussion
Le test j’ai-YFP-CIJL peut être utilisé pour HTS parce qu’il est robuste, rapide et peu coûteux. Un dosage HTS est considéré comme robuste si la Z'-facteur est supérieure à 0,525. Voir Zhang et coll. pour obtenir une description de l’analyse statistique utilisée pour évaluer l’adéquation des HTS essais25. Lorsque des cellules LN215 ont été utilisées, le Z'-facteur était > 0,5 sans aucune optimisation de dosage. Si les autres types de cellules sont utilisées dans le test et .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par le programme de recherche sciences fondamentales grâce à la fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de l’éducation (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 et 2018R1A6A1A03023718).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque à 96 puits | SPL | 30096 | |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | réactif de transfection |
| chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Lecteur de microplaques ; | BMG LabTech ; | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G ; | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Solution de poly-L-lysine | sigma | P4707 | |
| Chlorure de potassium (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 ; | Addgene | ;#12260 | |
| Dichlorhydrate de puromycine | sigma | P8833 | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sigma | S5886 | Solution C, solution I |
| Hyroxyde de sodium (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Iodure de sodium (NaI) | Sigma | 383112 | Solution I |
Références
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. M....
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Réimpressions et autorisations
