Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration

8K vues

⸱

DOI :

10.3791/58978

⸱

8 février 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-Sen University, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

Un simple test ATP-instruments de mesure et vivre/morts méthode de coloration ont été utilisés pour quantifier et visualiser les Neisseria gonorrhoeae survie après traitement par ceftriaxone. Ce protocole peut être étendu pour examiner les effets antimicrobiens de n’importe quel antibiotique et peut être utilisé pour définir la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques dans les biofilms bactériens.

Résumé

L’émergence de résistants aux antibiotiques Neisseria gonorrhoeae (GC) est une menace pour la santé dans le monde entier et souligne la nécessité d’identifier les personnes qui ne respectent pas de traitement. Cette bactérie Gram-négative provoque la gonorrhée exclusivement chez l’homme. Au cours de l’infection, il est apte à former des agrégats ou des biofilms. L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est utilisé pour déterminer la susceptibilité aux antibiotiques et de définir un traitement approprié. Toutefois, le mécanisme de l’éradication in vivo et sa relation avec les résultats de laboratoire ne sont pas connus. A développé une méthode qui examine comment l’agrégation GC affecte la sensibilité aux antibiotique et montre la relation entre la taille des granulats et sensibilité aux antibiotique. Lors de l’agrégat de GC, ils sont plus résistants aux antibiotiques mise à mort, avec des bactéries dans le centre survivant ceftriaxone traitement mieux que ceux de la périphérie. Les données indiquent que l’agrégation de N. gonorrhoeae peut réduire sa sensibilité à la ceftriaxone, qui se traduit pas en utilisant les méthodes MIC standard agar axée sur la plaque. La méthode utilisée dans cette étude permettra aux chercheurs de tester la sensibilité bactérienne conditions cliniquement pertinentes.

Introduction

La gonorrhée est qu'une commune transmises sexuellement (MTS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), une bactérie Gram-négative de diplococcal, est l’agent causal de cette maladie. Symptômes de l’infection génitale peuvent entraîner des douleurs pendant la miction, douleurs génitales généralisée et urétral. L’infection est souvent asymptomatique2,3,4,5, et cela permet à la longue colonisation. Ces infections non traitées sont un sujet de préoccupation majeur pour la santé, car ils sont susceptibles de faciliter la transmission de l’organisme et cela peut conduire à des complications telles que la maladie inflammatoire pelvienne (MIP) et diffusé l’infection gonococcique (DGI)6. La gonorrhée résistante aux antibiotiques est une crise de santé publique majeur et une augmentation de fardeau socio-économique7. Traitement régime changement d’un seul antibiotique à la bithérapie, qui combine l’azithromycine ou la doxycycline avec ceftriaxone8a entraîné une sensibilité réduite aux céphalosporines. L’échec accru de ceftriaxone et l’azithromycine9,10, en combinaison avec des infections asymptomatiques, met en évidence la nécessité de comprendre les échecs de traitement de la gonorrhée.

L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI), y compris les tests de diffusion de dilution et disque agar, a été utilisé comme le test médical standard pour l’identification de la résistance à un antibiotique. Néanmoins, il est difficile de savoir si le critère de la MIC exprime l’antibiorésistance bactérienne in vivo. La formation de biofilms bactériens contribue à la survie de bactéries en présence de concentrations bactéricides d’antibiotique : l’essai de MIC est incapable de détecter cet effet11. Parce que le GC peut former des biofilms sur les surfaces muqueuses12, nous émettons l’hypothèse de cet antibiotique susceptibilité au sein des agrégats serait différente de celle observée dans les GC. En outre, des études ont montré que trois phase protéine associée à l’opacité de molécules de surface variable, Pili, (Opa) et lipooligosaccharides (LOS), qui régissent les interactions entre bactérie, conduire à différents agrégats de taille13, 14 , 15. la contribution de ces composants à la résistance aux antibiotique n’a pas été examinée faute de méthodes appropriées.

Actuellement, il y a plusieurs méthodes pour mesurer l’élimination du biofilm. La méthode quantitative plus largement utilisée est en mesurant les changements dans la biomasse à l’aide de violet de gentiane16de coloration. Toutefois, la méthode requiert la manipulation expérimentale importante, qui peut potentiellement générer des erreurs dans l’expérience répétitions17. La méthode de coloration de vivre/morts utilisée ici permet la visualisation des bactéries vivantes et mortes et leur distribution dans le biofilm. Cependant, la structure des biofilms peut poser comme une barrière physique qui réduit la pénétration de la teinture. Par conséquent, afin de quantifier les bactéries vivent/morts au sein d’un groupe, la coloration est limitée à petits biofilms ou son précurseur-microcolonies ou agrégations. Autres méthodes, y compris les essais de diffusion gélose dilution et disque, ne sont pas en mesure de mesurer les effets d’agrégation. Afin d’examiner la sensibilité GC au sein de l’agrégation après exposition aux antibiotique, une méthode idéale aurait besoin d’avoir les deux un test quantitatif qui permet de mesurer vivent des bactéries et visualiser leur distribution.

La procédure décrite ici combine une mesure de l’utilisation d’ATP et une coloration live/morts de dosage à quantitativement et examiner visuellement la susceptibilité de GC au sein des agrégats en présence d’antibiotiques.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. entretien général des souches de GC

  1. Les souches de N. gonorrhoeae -ensemencer sur une gélose GCK avec 1 % Kellogg complète18 (tableau 1, tableau 2) provenant des stocks du congélateur et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 16 à 18 h. utilisation MS11 exprimant phase variable Opa (MS11Opa +), aucune Opa (MS11ΔOpa), ou a LOS tronqué (MS11ΔLgtE).
  2. Prélever soigneusement des pili négatif (colonie sans bordure sombre) ou colonies positives (colonie avec bordure sombre) de chaque souche issu de morphologie de colonie19 en utilisant un microscope à lumière dissection et ensemencer sur une nouvelle plaque GCK.
  3. Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 16-18 h avant utilisation.

2. dosage viabilité des agrégations de GC

  1. Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Écouvillon GC de la plaque et remettre en suspension les GC dans le bouillon préchauffé (GCP, tableau 3) additionné de 4,2 % NaHCO3 et 1 % Kellogg solutions18. Utiliser la spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm (une OD de650 1 = ~ 1 x 109 UFC/mL) afin de déterminer la concentration de bactéries en suspension.
  2. Ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 108 UFC/mL.
  3. Ajouter 99 µL de suspension GC ajustée dans des puits d’une plaque à 96 puits.
  4. Incuber la plaque pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour permettre les bactéries à s’agréger.
  5. Ajouter 1 µL de série ceftriaxone dilué (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) dans chaque puits. Laisser certains puits non traités pour servir en tant que contrôles.
  6. Incuber les plaques pendant 24 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  7. Laisser agir la suspension 3 fois dans chaque puits de 5 s à 144 W et 20 kHz.
  8. Ajouter 100 µL de réactif de lueur d’utilisation ATP disponible commercialement dans chaque puits, pipette haut-bas pour 3 fois et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2pendant 15 minutes.
  9. Soigneusement transférer 150 µL du mélange de chaque puits dans un nouveau puits dans une microplaque 96 puits noir et éviter d’introduire des bulles.
  10. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 560 nm en utilisant le lecteur de plaque.
  11. Calculer le taux de survie par le rapport entre la lecture obtenue après traitement série ceftriaxone à la lecture des puits non traitées.

3. analyse microscopique fluorescence du Live/Dead des agrégats de GC

  1. Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Kellogg suppléments écouvillon GC de la plaque et GC resuspendre dans pré chauffé de GCP media plus de 1 %.
  2. Déterminer le nombre de bactéries par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm et ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 107 UFC/mL.
  3. Ajouter 198 µL de suspension de la GC dans des chambres de 8 puits lamelle-bas.
  4. Incuber la chambre pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour permettre la formation de l’agrégation.
  5. Ajouter 2 µL de ceftriaxone (100 µg/mL ou diverses dilutions) dans chaque puits au sein de chaque état d’agrégation. Incuber pendant le temps désiré à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  6. Ajouter 0,6 µL du mélange de solution coloration live/morts dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  7. Acquisition d’images de série Z à l’aide d’un microscope confocal (un microscope équivalent peut être utilisé).
  8. Analyser les images à l’aide de logiciels ImageJ pour la mesure de la taille des agrégats de GC et le ratio d’intensité de fluorescence (FIR) de vivre-à-mort de coloration dans chaque agrégat.

4. analyse de l’image

  1. Estimation de la taille des agrégats bactériens.
    1. Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.
    2. Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation dans l’image.
    3. Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.
    4. Obtenir le nombre dans une nouvelle fenêtre sous la colonne de la zone .
  2. Quantification du ratio de vivre-à-mort d’agrégations
    1. Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.
    2. Cliquez analyser | Mesures de la valeur dans la barre de menus de ImageJ.
    3. Vérifier la densité intégrée dans le menu contextuel, puis cliquez sur OK.
    4. Cliquez sur l’Image de | Couleur | Outil de canaux dans la barre de menus et sélectionnez couleurs.
    5. Enregistrer canal 1 comme la fluorescence pour les bactéries vivantes de coloration.
    6. Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation.
    7. Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.
    8. Obtenir le numéro de colonne IntDen .
    9. Contrôle canal 2 comme la fluorescence pour la coloration mort bactérienne. Répétez les étapes 4.2.6-4.2.8.
    10. Obtenir le rapport de vivre-à-mort en divisant le nombre de l’étape 4.2.8 par nombre de l’étape 4.2.9.
  3. Analyse statistique
    1. Ouvrez GraphPad Prism et entrer les chiffres obtenus à partir de ImageJ la colonne souhaitée.
    2. Cliquez sur analyser , puis sélectionnez tests t sous les analyses de colonne.
    3. Cochez la colonne souhaitée pour la comparaison et cliquez sur OK.
    4. Obtenir la P-Value au titre de la fenêtre d’analyse .
    5. Sélectionnez la Régression linéaire selon analyses XY de l’étape 4.3.3
    6. Obtenir le R-carré et la P-valeur sous la fenêtre d’analyse.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Deux méthodes ont été employées : un essai d’utilisation ATP et un test de coloration de vivre/morts. Les résultats peuvent être combinés ou utilisés individuellement pour examiner la survie bactérienne au sein des agrégats après un traitement antibiotique. Le test d’utilisation ATP a été démontré pour mesurer des bactéries viables avec précision dans le S. aureus biofilms20,21. Ici, MS11Opa + Lip + souche a permis d’exam...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les bactéries peuvent former des biofilms au cours de l’infection du corps humain. Traditionnel MIC test peut-être ne pas refléter la concentration nécessaire pour éradiquer les biofilms bactériens. Pour tester les effets antimicrobiens sur un biofilm, méthodes basées sur la biomasse biofilm ainsi qu’UFC de placage peuvent être erronées en raison de l’impact de la structure des biofilms. Par exemple, la méthode de placage ne fonctionne que si le biofilm peut être perturbé. Par conséquent, l’UFC a obtenu peut être inférie...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Health D.E.C. et W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., et E.N. appuyés en partie/participer au programme « La première année l’Innovation & recherche expérience » financé par l’Université du Maryland. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans l’étude de conception, collecte de données et l’analyse, de décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous reconnaissons l’UMD CBMG Imaging Core pour toutes les expériences de microscopie.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100x supplément
AgarUnited States BiologicalA0930
BacTiter Assay  ;PromegaG8232
CeftriaxoneTCIC2226
Difco GC base moyenne  ;BD228950
Nitrate ferrique, non hydratéSigma-Aldrich254223-10G
GlucoseThermo Fisher ScientificBP350-1
L-glutamine Poudre cristallineFisher ScientificBP379-100
BacLight colorant vivant/mortInvitrogenL7012
MS11 soucheaimablement fournie par le Dr Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Recherche
Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)Fisher ScientificP290-500
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)Fisher ScientificBP329-1
Pepton-protéose  ;BD Biosciences211693
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher ScientificS671-10
Amidon solubleSigma-AldrichS9765
Pyrophosphate de thiamineSigma-AldrichC8754-5G
Équipement
Boîtes de PétriVWR25384-302
8 puits lamelle-chambre de fond  ;Thermo Fisher Scientific155411
plaques de culture tissulaire à 96 puitsCorning, Falcon3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Classe II, A2 Hotte à flux laminaire)Nuaire32776
CO2 IncubateurFisher Scientific  ; Modèle 3530
Microscope confocal équipé d’une chambre d’imagerie en directLeicaSP5X
Corning  ; Microplaque en polystyrène noir 96 puits  ;Corning3904
Illuminateur Glomax  ;PromegaE6521
Pointes de pipette (0,1-10 & micro ; L)Thermo Fisher Scientific02-717-133
Pointes de pipette (1000 µ ; L)VWR83007-382
Pointes de pipette (200 µ ; L)VWR53509-007
Spectrophotomètre Ultrospec 2000 UVPharmacia Biotech80-2106-00
Tubes coniques stériles 15 mlVWR21008-216
Tubes microcentrifuges stériles (1.7 mL)Sorenson BioScience16070
Applicateurs stériles à embout polyesterFisher Scientific23-400-122
SonicateurKontesEquivelent à 9110001
Kellogg’s de Neisseria gonorrhoeae

Références

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Test de sensibilit aux antibiotiquesEssai d utilisation de l ATPTraitement la ceftriaxoneAnalyse de la taille des agr gatsAgr gation bact rienneMicroscopie confocaleProtocole de sonicationMesure de la densit optique
Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.