Mutagenèse dirigée pour In Vitro et In Vivo des expériences illustrées avec Interactions ARN chez Escherichia Coli

Résumé

Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ce protocole décrit comment faire mutagénèse dirigée avec un 2-step et approche, qui s’applique à n’importe quel fragment d’ADN d’intérêt basée sur les 3 étapes amplification génique (PCR).

Résumé

Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’ADN d’étudier l’interaction entre les petites molécules d’acide ribonucléique (sRNA) non codantes et cibles ARN de messager (ARNm). En outre, mutagénèse dirigée est utilisé pour mapper des sites de liaison protéine spécifique à l’ARN. Une introduction de PCR basé étapes 2 et 3 étapes de mutations est décrite. L’approche est pertinente aux études sur les interactions ARN-ARN et protéine-ARN. En bref, la technique s’appuie sur la conception des amorces avec le mutation(s) désiré et 2 ou 3 étapes de la PCR synthétiser un produit PCR avec la mutation. Le produit PCR est ensuite utilisé pour le clonage. Nous décrivons ici comment effectuer la mutagenèse dirigée, avec les deux celle de 2 et 3 pas à introduire des mutations la sRNA, AMC et l’ARNm, Cdgs, d’enquêter sur les ARN-ARN et interactions ARN-protéine. Nous appliquons cette technique pour étudier les interactions de RNA ; Cependant, cette technique est applicable à toutes les études de mutagenèse (interactions ADN-protéines, acides aminés remplacement/suppression/ajout). Il est possible d’introduire n’importe quel genre de mutation à l’exception des bases non naturelle, mais la technique n’est applicable que si un produit PCR peut être utilisé pour une application en aval (par exemple, le clonage et le modèle pour plus de PCR).

Introduction

ADN est souvent appelée le plan d’action d’une cellule vivante puisque toutes les structures de la cellule sont encodés dans la séquence de son ADN. La réplication exacte et les mécanismes de réparation de l’ADN s’assurer que seules de très faibles taux de mutations se produisent, qui est essentiel pour maintenir les fonctions correctes des gènes codés. Modifications de la séquence d’ADN peuvent affecter les fonctions successives à différents niveaux de départ avec l’ADN (reconnaissance de facteurs de transcription et les enzymes de restriction), puis RNA (complémentarité des paires de bases et des altérations de la structure secondaire) ou autres protéines (amino sub....

Protocole

1. sélection de vector

1. Choisir un vecteur pour effectuer des expériences en aval avec. Tout vecteur est applicable pour cette méthode PCR-étapes 2 et 3.
2. Basé sur le choix du vecteur, choisissez des enzymes de restriction appropriées pour le clonage.

2. amorces pour site de mutagénèse dirigée

1. Choisir entre la stratégie PCR étape 2 ou 3 étapes (2-step est seulement pour les mutations < 200 bp des deux extrémités de l’ADN d’intérêt). Pour l’ACP 2-étape, passez à l’étape 2.2 et pour le PCR de 3 étapes, passez à l’étape 2.3.
2. Conception amorces pour la PCR 2-step.
   1. Plan d’apprêt 1 et 3 pour amp....

Résultats

Pour étudier les interactions de RNA concernant la régulation post-transcriptionnelle des Cdgs, une configuration de double vecteur a été choisie : d’exprimer la Cdgs ARNm et l’autre pour exprimer le petits ARN non codants, McaS. Cdgs a été clonée dans pBAD33, qui est un plasmide de milieu-copie inductible arabinose avec résistance de chloramphénicol et McaS a été clonée dans mini R1 pNDM220, qui est un plasmide inductible de faibles copies d’isopropyl β-D-1-thi.......

Discussion

Mutagenèse dirigée a un large éventail d’applications différentes, et ici, les résultats représentatifs d’un in-vivo et une expérience in vitro ont été inclus comme exemples de la façon de tirer des conclusions biologiques à l’aide de la technique. Mutagenèse dirigée a longtemps été la méthode de référence pour les études d’interactions RNA. La force de la technique réside dans la combinaison de l’introduction de mutations pertinentes avec des dosages en aval et expériences (p. ex., la tache occidentale ou EMSA) pour tir.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-GroEL produit chez le lapin	Merck	G6532	Anticorps primaire
Azure c200	Azure	NA	Station d’imagerie gel
Oligo d’ADN personnalisé	Merck	VC00021
DeNovix DS-11	DeNovix	NA	Spectrophotomètre pour les mesures d’acides nucléiques
Colorant de chargement de gel d’ADN (6X)	Thermo Scientific	R0611
Solution de bromure d’éthidium 1 %	Carl Roth	2218.1
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi	Gerard Biotech	TO12	Tubes de dialyse pour électro-élution
MEGAscript T7 Kit de transcription	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT	Cell Bio-Rad	1704406	Système d’électrophorèse horizontale
Anticorps monoclonal ANTI-FLAG M2 produit chez la souris	Merck	F3165	Anticorps primaire
Immunoglobulines de souris	Dako Cytomation	P0447	HRP Anticorps secondaire conjuqué
NucleoSpin miARN	Macherey Nagel	740971	Purification de l’ARN
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Protein Gels	Thermo Scientific	NP0323BOX	Bis-Tris pour la séparation des protéines
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF	New England Biolabs	M0531S	DNA polymérase
PowerPac HC Alimentation à courant élevé	Bio-Rad	1645052
Rabbit Immunoglobulines	Dako Cytomation	P0448	HRP conjuqué anticorps secondaire
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	Outil logiciel d’analyse de graphes et de données
T100 Thermocycler	Bio-Rad	1861096	PCR T4
ADN ligase	New England Biolabs	M0202	Ligase
T4 Polynucléotide kinase	New England Biolabs	M0201S
Tampon TAE (Tris-acétate-EDTA) (50X)	Thermo Scientific	B49