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Article de méthode

Immobilisation des individus vivants Caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau

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DOI :

10.3791/59008

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19 mars 2019

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Dans cet article

Résumé

Une série de méthodes d’immobilisation a été créée pour permettre l’irradiation ciblée des vivants Caenorhabditis elegans individus utilisant un microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-thin récemment développés puce avec rétention d’eau. Cette nouvelle immobilisation sur puce est aussi convenable pour l’imagerie des observations. Le traitement détaillé et exemples d’application de la puce sont expliqués.

Résumé

Rayonnement est employé couramment pour des applications biologiques et pour l’élevage de faisceau d’ions, et parmi ces méthodes, l’irradiation microfaisceaux représente un puissant moyen d’identifier les sites sensible dans les organismes vivants. Cet article décrit une série de méthodes d’immobilisation sur puce développées pour l’irradiation de microfaisceaux ciblé des individus vivants de Caenorhabditis elegans. Notamment, le traitement des puces microfluidiques polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous avons développés précédemment pour immobiliser c. elegans individus sans avoir besoin d’anesthésie est expliquée en détail. Cette puce, dénommée une feuille de ver, est résiliente pour permettre les canaux microfluidiques à décompresser, et l’élasticité permet aux animaux d’être enveloppés doucement. En outre, en raison de la capacité d’adsorption indépendant du PDMS, animaux peut être scellé dans les canaux en couvrant la surface de la feuille de ver avec un film mince couverture, dans lequel les animaux n'est pas poussé dans les canaux pour enceinte. En tournant le couvercle du film plus, nous pouvons facilement recueillir les animaux. En outre, la feuille de ver montre la rétention d’eau et permet aux individus de c. elegans de faire l’objet d’une observation microscopique pendant de longues périodes dans des conditions live. En outre, la feuille est seulement 300 µm d’épaisseur, ce qui permet des ions lourds tels que les ions de carbone pour passer à travers la feuille renfermant les animaux, permettant ainsi à détecter les particules d’ion et la dose de rayonnement appliquée à mesurer avec précision. Parce que les films de couverture utilisé pour enfermant les animaux est très importante pour l’immobilisation à long terme avec succès, nous avons procédé la sélection des films adaptés de la couverture et a montré un recommandée chez certains films. Comme un exemple d’application de la puce, nous avons introduit l’observation d’imagerie des activités musculaires des animaux entourant le canal microfluidique de la feuille de ver, ainsi que l’irradiation de microfaisceaux. Ces exemples indiquent que les feuilles de ver ont considérablement élargi les possibilités d’expériences biologiques.

Introduction

Rayonnement, y compris les rayons x, rayons gamma et faisceau d’ions lourds, est employé couramment pour des applications biologiques telles que dans le diagnostic du cancer et le traitement et à la reproduction de faisceau d’ions. Nombreuses études et développements techniques se concentrent actuellement sur les effets des radiations1,2,3. Irradiation par Microfaisceaux est un moyen efficace d’identifier les sites sensible dans la vie des organismes4. Takasaki Advanced rayonnement recherche Institut des instituts nationaux pour Quantum et radiologiques Science et technologie (TVQ-Takasaki) a mis au point une technologie pour irradier les cellules individuelles sous observation microscopique à l’aide d’ions lourds micromadriers5et a établi des méthodes pour permettre l’irradiation microfaisceaux ciblé de plusieurs animaux de modèle, tels que le nématode Caenorhabditis elegans4,6, vers à soie7et Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Irradiation de microfaisceaux ciblée du nématode c. elegans permet la précipitation efficace des régions spécifiques, tels que l’anneau nerveux dans la région céphalique, contribuant ainsi à identifier les rôles de ces systèmes dans des processus comme la locomotion.

Une méthode pour l’immobilisation sur puce de c. elegans individus sans la nécessité d’une anesthésie a été développée pour permettre à microfaisceaux irradiation4. En outre, pour améliorer les puces microfluidiques utilisés dans la précédente étude4, nous avons développé récemment mouillable, ion-pénétrable, polydiméthylsiloxane (PDMS) puces microfluidiques, appelées feuilles de ver (voir Table des matières), pour immobilisation de c. elegans personnes9. Il s’agit de feuilles souples ultra minces (épaisseur = 300 µm ; largeur = 15 mm ; longueur = 15 mm) avec plusieurs des canaux microfluidiques droites (20 ou 25) (profondeur = 70 µm ; largeur = 60 µm ou 50 µm ; longueur = 8 mm) à la surface (Figure 1A-D). Les canaux microfluidiques sont ouvertes et que plusieurs animaux puissent être enfermés en eux simultanément (Figure 1E). Les feuilles sont résilients pour permettre les canaux microfluidiques être augmenté (de ~ 10 %, Figure 1F), et l’élasticité permet aux animaux d’être enveloppés doucement. En outre, en raison de la capacité d’adsorption indépendant du PDMS, animaux peut être scellé dans les canaux en couvrant la surface de la feuille de ver avec un film mince couverture, dans lequel les animaux n'est pas poussé dans les canaux pour enceinte. En tournant le couvercle du film plus, nous pouvons facilement recueillir les animaux.

Les canaux ne pas blesser les vers quand ils sont être enfermés ou lorsqu’ils sont recueillis. En outre, les feuilles sont fabriqués à partir de PDMS, qui est essentiellement hydrophobe, mais la rétention d’eau peut être réalisée en conférant une hydrophilicité à la matière. La rétention d’eau et l’épaisseur sont des caractéristiques favorables des feuilles de ver. La capacité de rétention d’eau, empêche la déshydratation des animaux après immobilisation prolongée et permet des observations à long terme à réaliser.

En outre, comme décrit plus haut9, les feuilles sont seulement 300 µm d’épaisseur, permettant de traverser la feuille contenant les animaux des ions lourds tels que les ions de carbone (avec une fourchette d’environ 1 mm dans l’eau). Ceci permet les particules d’ions pour être détectée et la dose de rayonnement appliquée à mesurer avec précision. En outre, les feuilles de ver peuvent être réutilisés et sont donc économiques. Avec la méthode d’injection classiques, les animaux inclus sont parfois morts et ils ne peuvent être pris hors de la manche ; leurs œufs peuvent aussi obstruer les canaux. Cela rend la puce inutilisable. Puces sont donc fondamentalement jetables et la rentabilité ratio est pauvre.

Dans le présent document, nous décrivons en détail une série de méthodes pour l’immobilisation sur puce de direct c. elegans particuliers en utilisant des feuilles de ver. Par le biais de tests de locomotion des animaux 3 h après l’immobilisation sur puce, nous avons évalué le film de protection adapté. En outre, nous avons montré les exemples d’immobilisation sur puce pour les observations d’imagerie et irradiation microfaisceaux.

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Protocole

1. les souches et l’entretien

  1. Sélectionnez une souche adaptée de c. elegans et Escherichia coli (nourriture) selon le but de l’expérience.
    Remarque : Dans le présent document, sauvage N210c. elegans (Figure 2A) est utilisé généralement et HBR4 :goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 est seulement employé pour test d’imagerie. E. coli OP50 a été utilisé comme nourriture pour le c. elegans. Certains mutants avec la forme du corps anormaux, tels que le mutant unc-119(e2498) III avec une forme spirale (Figure 2B), peuvent également être enfermés dans des canaux microfluidiques droite (Figure 2C).
  2. Maintenir c. elegans à 20 ° C, sur 6 cm de pétri contenant 10 mL de milieu nématode (NGM) parsemée d’incubés pendant la nuit (37 ° C) e. coli comme décrit plus haut10. Si possible, synchronisez les stades de développement de c. elegans dès le stade embryonnaire.
  3. Utiliser des animaux adultes bien nourris, environ 3-4 jours après l’éclosion d’une largeur d’environ 50 à 60 µm, qui se prête particulièrement bien à la taille des canaux microfluidiques dans les fiches de ver.

2. sélection de la solution tampon pour l’immobilisation sur puce

  1. Pour les feuilles de ver mouillable, utiliser toute solution tampon selon le but des expériences.
    Remarque : Des solutions tampon adéquat pour l’immobilisation sur puce sur PDMS microfluidique puces ont été définis précédemment9 et les solutions tampons suivants se sont révélées n’ont aucun effet sur la motilité des animaux après immobilisation : tampon basale S solution (5,85 g de NaCl, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol), 50 mL de phosphate de potassium 1 M pH 6.0, H2O à 1 L ; stérilisé à l’autoclave)10 contenant une grande quantité de NaCl, M9 du tampon phosphate (5 g de NaCl , 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 mL de 1 M MgSO4, H2O à 1 L ; stérilisé à l’autoclave)10, solution de tampon de lavage (5 mL de phosphate pH 6,0 M 1, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 0,5 g pf gélatine, H2O à 1 L ; stérilisé à l’autoclave)12 contenant la gélatine et de l’eau ultrapure9. Solution tampon de lavage est généralement utilisée dans le présent document, et solution tampon basale S est seulement employée pour évaluer l’immobilisation sur puce en utilisant des films de couverture différente dans la section 3.
  2. Pour les puces microfluidiques conventionnel sans mouillabilité, utiliser une solution de tampon de lavage, qui fournit le moyen le plus efficace de maintenir l’humidité dans les canaux microfluidiques de la puce et empêche ainsi le séchage de c. elegans individus ( indépendamment de la mouillabilité des puces microfluidiques).

3. sélection de film de protection adapté pour l’immobilisation sur puce

  1. Préparer des films de couverture différente comme suit. Basé sur la facilité de manipulation, coupée ce qui suit transparentes, films de couverture biocompatible à une taille appropriée (c.-à-d., largeur de 10-15 mm et longueur de 30-50 mm) : 130-170 µm épaisse lamelle couvre-objet, 125 µm épaisse polyester (PET) film et ~ 130 µm épaisseur polystyrène (PS) film.
  2. Effectuer l’immobilisation sur puce de 3 h en utilisant des films de couverture différente comme suit. Fondée sur des mesures 4.1 à 4.6, encadrent ≥10 lavés animaux adultes (3,5 jours après l’éclosion) dans la feuille de ver à l’aide de chaque film de couverture, respectivement et laisser pendant 3 h.
  3. À des fins de comparaison, laisser 3 h de libre circulation comme suit. ≥ 10 place lavés animaux adultes sur un plateau de 3,5 cm contenant 3 mL NGM frais, couvrir avec un couvercle et laisser pendant 3 h.
  4. Recueillir les animaux immédiatement après 3 h d’immobilisation sur puce selon mesures 5.1-5.3. Retirer le couvercle de la feuille de ver et ajouter une goutte de solution tampon à chaque animal. Ramasser les animaux nager dans la goutte à l’aide d’un sélecteur de platina et transférez-les sur un plat de 3,5 cm contenant 3 mL NGM frais sans nourriture (essai de plaque).
  5. Recueillir des animaux après 3 h de libre circulation. Ajouter une goutte de solution tampon à chaque animal. Ramasser les animaux nager dans la goutte sur la plaque NGM et transférer sur une plaque d’essai à l’aide d’un sélecteur de platina.
  6. Évaluer les effets de film de couverture sur la motilité (essai de locomotion).
    1. Au moins 5 min après le transfert à la plaque de test, comte ' courbes (défini comme le nombre de plis dans la région antérieure à intervalles de 20 s) manuellement sous un microscope13du corps.
    2. Effectuer des essais de locomotion cinq fois indépendamment pour chaque film de couverture.
      Remarque : Dans les expériences montrés les résultats représentatifs, 10 animaux ont été évaluées pour chaque expérience dans laquelle plusieurs animaux était jointes en même temps, comparativement à seulement cinq animaux comptés dans la précédente étude13.
    3. Calculer le nombre moyen des replis du corps pour les 10 animaux dans chaque groupe de chaque expérience. Puis la moyenne des valeurs de cinq expériences indépendantes pour évaluer les effets de l’immobilisation sur puce. Analyser les données statistiquement à l’aide d’un test d’analyse de variance (ANOVA) dans un logiciel de feuille de calcul à des niveaux de signification de 0,01 à 0,05.
      NOTE : Basé sur ces expériences, un film de couverture PS avec perméabilité élevée d’oxygène a été jugé approprié (voir les résultats représentatifs). Ces films de PS sont inclus avec les feuilles de ver. Film PET, qui a une perméabilité faible teneur en oxygène, n’a pas été jugé approprié parce que les animaux ont tendance à étouffer si couvert avec elle au cours de l’immobilisation à long terme sur les feuilles de ver. Il est également important que le film de couverture ne casse pas lors d’une série de procédures ; couvercles de verre étaient donc aussi inadaptés (voir les résultats représentatifs).

4. on-chip immobilisation

NOTE : Gants stériles jetables devraient être portés pour éviter de contaminer les feuilles de ver.

  1. Placer une feuille transparente mince tels qu’un film de couverture PS ou en verre qui n’a aucun autofluorescence, comme un film de couverture inférieur, sur le bureau expérimental ou le stade microscopique. Placez une feuille de ver doucement sur le film de couverture inférieur à l’aide de pinces plates.
    Remarque : Outre les feuilles de ver avec 60 canaux microfluidiques µm à l’échelle (adapté pour les adultes 3-4 jours après l’éclosion), feuilles avec 50 chaînes µm à l’échelle (adaptés pour les jeunes adultes 3 jours après l’éclosion et mutants avec petit corps au stade adulte) peuvent également être utilisées. Sélectionnez une feuille appropriée selon la taille des animaux à être utilisé.
  2. Pour collecter les animaux, ramasser un adulte individuel c. elegans de la plaque de culture sous un stéréomicroscope à l’aide d’un sélecteur de platina. Répétez l’opération si plusieurs animaux est nécessaires.
  3. Laver les animaux pour retirer les aliments (bactéries).
    1. Placer au moins trois gouttelettes (5 µL gouttes) de solution tampon sur la surface d’un 6 cm non traitées (hydrofuge) de pétri.
    2. Transférer les animaux à une goutte à l’aide d’un sélecteur de platina et leur permettre d’enlever n’importe quel aliment à la nage. Laver deux fois dans deux gouttes de séparé et puis rincer les animaux dans une autre goutte.
      Remarque : Il est nécessaire de pratiquer cette procédure pour pouvoir s’en acquitter rapidement avant d’effectuer toutes les expériences.
  4. Déposer 2-3 µL de solution de tampon sur la surface d’une feuille de ver. Ramasser les animaux lavés de la goutte sur la boîte de Pétri et transférez-les vers la goutte sur la feuille de ver.
  5. Enfermer les animaux dans des canaux microfluidiques comme suit. Placer un film de couverture du PS sur la feuille de ver, utilisez des pinces plates et appuyez doucement sur les canaux d’un bout de la feuille à l’autre pour conserver l’humidité (comme décrit plus haut4,9).
    NOTE : Animaux est aléatoirement placés dans les canaux. Gouttelettes contenant les animaux sont répartis sur la feuille de ver en couvrant la feuille, résultant en gouttelettes étant largement étendus sur plusieurs canaux. Chaque animal peut être enfermé dans l’un de ces canaux. Le point important concernant l’utilisation de la feuille de ver pour l’immobilisation sur puce est que plusieurs canaux sont disponibles sur une large zone.
  6. Immédiatement après l’enfermant les animaux dans les canaux microfluidiques, confirmer qu’ils sont vivants, en recherchant les mouvements de la tête sous un microscope (p. ex., 1 x ou 2 x grossissement).
  7. Enregistrer la position de l’animal, en même temps comme exerçant étape 4.6 et noter ce qui suit sur une feuille dédié (supplémentaire 1 fichier) : numéro du canal dans lequel l’animal est enfermé ; position de chaque animal dans le canal (gauche/centre/droite) ; et la direction de la tête.
  8. Dessiner une flèche pour marquer la position de chaque animal dans le canal, avec le sens de la flèche correspondant à la tête de l’animal.
    Remarque : Les canaux numéros (p. ex., 1, 5, 10, 15, 20, 25) sont gravés sur la surface de la feuille de ver près des bords gauche et droit des canaux microfluidiques (Figure 1B). Ces informations sur la feuille dédiée permet aux animaux de se trouver rapidement, rendant le processus plus efficace et contribue également à prévenir les fuites de rayonnement au cours des étapes ultérieures.

5. la collecte d’animaux à partir d’une feuille de ver

  1. Immédiatement après l’immobilisation, enlevez le film de couverture de la feuille de ver, utilisez des pinces plates.
  2. Baisse de 10-15 µL de solution de tampon sur les canaux microfluidiques enfermant les animaux et observer les animaux commence à nager dans les gouttelettes sous un stéréomicroscope.
    NOTE : Les animaux commençant nage dans la nouvelle goutte sur leur propre sans aucune pression supplémentaire, d’aide ou pousser. Insertion d’un tampon au-dessus d’eux est suffisant pour les faire nager sur la chaîne. Un animal peut être incapable de nager dans une gouttelette si il a été très endommagé par irradiation à l’étape 7,9 ou par le procédé d’immobilisation en étapes 4.2 à 4.5, bien que cela soit rare. En outre, si l’animal reste attaché à la film de couverture lorsqu’il est supprimé, ajoutez les gouttes tombent sur le film de couverture au lieu de dans les canaux.
  3. Ramasser les animaux nager dans la goutte à l’aide d’un sélecteur de platina et placez-les sur une plaque de test.

6. application des feuilles de ver pour observations d’imagerie

NOTE : Les feuilles de ver peuvent être employée couramment dans l’observation au microscope. La puce peut retenir l’eau et n’affecte pas la motilité des elegans de Caenorhabditis individus après 3 h d’immobilisation sur puce9. En outre, la puce elle-même n’a aucun autofluorescence, le rendant approprié pour l’usage dans les tests d’imagerie de fluorescence. Un exemple d’application pour l’analyse d’imagerie de fluorescence est donné ci-dessous.

  1. Sélectionnez un microscope à fluorescence et monter un appareil photo numérique ou un caméscope numérique sur le microscope à capturer des images ou des vidéos, respectivement (Figure 3A).
    Remarque : La distance de travail (WD) du microscope est supérieure à 0,2 mm selon spécification du porte-objectif (voir la Figure 3B, C). La spécification du système de microscopie fluorescence utilisé dans cet article s’affiche dans la Table des matières. Toutefois, la spécification n’est pas limitée à notre exemple car il dépend de l’objectif de l’observation ou / et utilisateurs.
  2. Sélectionner n’importe quelle contrainte fluorescent de c. elegans et conserver tel que décrit à l’article 1.
    Remarque : Si il est nécessaire d’observer la contraction musculaire de la paroi corporelle (voir résultats représentatifs), utiliser des jeunes adultes HBR411c. elegans, dans laquelle un gène rapporteur est utilisé pour exprimer l’indicateur de calcium GCaMP3.35 dans toutes les cellules de muscle de paroi corporelle. Il est important d’utiliser de jeunes adultes (≤3 jours après l’éclosion) qui sont plus minces que la largeur des canaux microfluidiques (50 ou 60 µm) de la feuille de ver. Le faible degré d’habilitation signifie que les animaux peuvent se courber légèrement, ce qui permet d’observer la contraction musculaire et l’extension pendant l’analyse, à l’aide d’un indicateur d’ions calcium.
  3. Réaliser des enclos d’animaux conformément à la procédure d’immobilisation à l’article 4.
  4. Observer des taches fluorescentes des animaux (p. ex., vert fluorescent protéine marquée (souches) à l’aide d’un microscope à fluorescence et capturer des images à l’aide d’une caméra montée sur le microscope.
    Remarque : Suivez les méthodes préétablies14,15,16, depuis les méthodes d’observation microscope (y compris l’observation de la fluorescence) et dépend de la spécification du système microscope le but de l’observation.
  5. Propagation des ondes image ions calcium à l’aide d’acquisition vidéo pour observer des activités dynamiques, tels que la contraction musculaire paroi corporelle et l’extension dans les vers HBR4 (vidéo 1).

7. application des feuilles de ver pour l’irradiation des microfaisceaux

Remarque : La collimation microfaisceaux irradiation système5 peut utiliser plusieurs particules d’ions lourds accélérés du cyclotron champ azimutale divers installé dans les accélérateurs de Ion Takasaki aux fonctionnalités demande de Radiation Advanced (DIADÈME) de TVQ-Takasaki (Figure 4A). Il existe une étape automatique pour l’irradiation sous la sortie de la poutre (Figure 4B). Voici la procédure pour l’irradiation des microfaisceaux d’ions lourds c. elegans en utilisant ce système.

  1. Localiser la ver feuille contenant plusieurs animaux sur un cadre en aluminium sur mesure pour l’installation d’irradiation microfaisceaux et réglez-le sur la scène automatique pour l’irradiation (Figure 4C).
  2. Recueillir l’échantillon de l’irradiation (c.-à-d., animaux enfermé dans une feuille de ver sur un châssis), à immédiatement sous sortie (~ 2 mm) le faisceau basé sur l’image du moniteur d’un microscope situé sous la scène automatique (Figure 4D).
  3. Après positionnement vertical, placer chaque animal à la cible avec l’irradiation de microfaisceaux en utilisant le logiciel sur mesure pour l’irradiation ciblée des animaux et des cultures de cellules. Pour localiser chaque animal enfermé dans le canal de la microfluidique, référez-vous à la fiche dédiée décrite dans étape 4,7 et 4,8 (voir supplémentaire fichier 1) et confirmer le numéro du canal près des bords gauche et droit des canaux.
  4. Contrôler les étapes automatique dans le X et Y directions pour positionner les animaux juste sous le faisceau de sortie en utilisant un système de télécommande et une souris laser opéré avec le logiciel de l’irradiation.
  5. Environ tune la zone d’irradiation en regardant la projection du microscope situé sous la scène automatique de l’échantillon et en déplaçant le curseur vers la position d’irradiation de l’animal d’être la cible.
  6. Après positionnement approximatif, sortir et fermer la chambre d’irradiation et de passer à la salle de contrôle adjacents pour éviter d’irradier les opérateurs.
  7. Ensemble, le nombre de particules d’ions pour une procédure d’irradiation, correspondant à l’irradiation d’une région spécifique de l’animal, à l’aide de la console, associé à un système d’ion-compteur.
    Remarque : Il s’agit d’un scintillateur plastique et un multiplicateur de photoélectrons dans le système d’irradiation microfaisceaux collimation.
  8. De la salle de commande d’irradiation, ajustez la position des animaux basé sur l’image du moniteur du microscope situé sous la scène automatique, qui est la même image projetée sur l’écran dans la chambre d’irradiation (Figure 4E).
  9. Cibler l’irradiation microfaisceaux en cliquant sur le bouton de l’irradiation du logiciel pour l’irradiation.
    Remarque : Dans l’exemple illustré à la Figure 4F, nous ciblons le pharynx dans la région céphalique et irradier avec le nombre approprié d’ions de carbone microfaisceaux. Parce que le nombre de particules d’ions traversant l’échantillon compte en utilisant un système d’ion-compteur lié à la console et le logiciel de l’irradiation, l’irradiation est arrêtée après la livraison du nombre désiré de particules ioniques.
  10. Localisez chaque animal indiqué sur la fiche dédiée et effectuer une irradiation ciblée pour chaque animal. Répétez les étapes 7,8 et 7,9 jusqu'à ce que tous les animaux ont été irradiés.
  11. Immédiatement après l’irradiation, entrer dans la salle de l’irradiation et abaissez la scène de l’irradiation automatique. Déposer l’échantillon sur le cadre sur mesure situé sur la scène automatique.
  12. Recueillir les animaux comme décrit aux points 5.1 à 5,3.
  13. Réaliser des analyses comportementales et/ou moléculaires nécessaires pour évaluer les effets de l’irradiation ciblée, selon le but de l’étude.
    Remarque : Le test de locomotion décrit à l’étape 3.6 est une méthode efficace pour évaluer les effets de l’irradiation sur la motilité4,9.

8. traitement des feuilles de ver pour utilisation répétée

Remarque : Les feuilles de ver peuvent être utilisés de façon répétée au moins 10 fois9 sans effets négatifs sur les animaux si nettoyé et stérilisé correctement après usage comme suit.

  1. Nettoyage
    1. Placez la feuille de ver utilisé sur une boîte de pétri de 6 cm et déposez environ 100 µL d’eau ultrapure stérile sur la feuille entière.
    2. Paddle gantées doigts laver la saleté comme poussière, nourriture bactérienne et des œufs de l’eau sur la surface de la feuille à l’aide pondus dans les canaux.
    3. Essuyer l’humidité hors du ver-soigneusement à l’aide de lingettes jetables.
  2. Stérilisation
    1. Injecter environ 5 mL d’éthanol à 70 % dans la boîte de pétri contenant la feuille de ver et pagayer sur la surface de la feuille à l’aide de doigts gantés à laver de la saleté.
  3. Séchage
    1. Supprimer les puces de la boîte de pétri remplie avec l’éthanol à 70 % et laisser pour sécher naturellement.
  4. Stockage
    1. Après le séchage, placer la feuille de ver sur une boîte de Petri stérile et couvrez-le. Feuilles peuvent également être stockés sur une boîte de Petri stérile rempli d’éthanol à 70 %.
      Remarque : Il est préférable de jeter les films de couverture après usage, mais s’ils veulent être réutilisés, nettoyez-les comme pour la feuille de ver. Toutefois, si les plis se développent sur le film de couverture après utilisation il n’adhèrera n’est plus à la puce, entraînant la déshydratation des animaux, et il devrait donc être remplacé.

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Résultats

Active c. elegans individus pourraient être immobilisés avec succès en utilisant un PDMS ultra-mince, mouillable, puce microfluidique (feuille de ver). Nous avons étudié la pertinence des films de couverture différente pour l’étanchéité de la feuille de ver, comme décrit dans le protocole 3 de l’article. Pour évaluer les effets d’étanchéité des films de la couverture, nous avons déterminé la motilité des animaux 3 h après immobilisation sur puce en utilisant le couvercle en verre...

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Discussion

Immobilisation sur puce de c. elegans dans des conditions live à l’aide d’une puce de microfluidique PDMS mouillable permet l’irradiation microfaisceaux ciblée efficace de plusieurs animaux. La facilité de manutention et de fonctionnalités pour éviter le dessèchement font de ce système pour des applications non seulement dans l’irradiation des microfaisceaux, mais aussi dans plusieurs essais comportements. Ces feuilles de ver ont déjà été commercialisés et peuvent être facilement obtenus. Puces microfluidique cl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Dr Atsushi Higashitani pour aimables conseils concernant le traitement de c. elegans et DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota et Yasuhiko Kobayashi pour discussions précieuses. Les auteurs tiennent à remercier le centre phytogénétique Caenorhabditis pour la fourniture de souches de c. elegans et e. coli. Nous remercions l’équipe du cyclotron de TIARA à Takasaki-TVQ pour leur aimable collaboration avec les expériences d’irradiation. Nous remercions le Dr Susan Furness pour l’édition d’un projet de ce manuscrit. Cette étude a été financée en partie par KAKENHI (Grant numéros JP15K11921 et JP18K18839) de la JSPS à M.S.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
C. elegans souche de type sauvageCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-UnisN2de type sauvage C. elegans souche généralement utilisée dans cette étude
C. elegans unc-119(e2498) III mutante soucheCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-UnisCB4845C. elegans utilisée uniquement comme exemple de mutants avec une forme corporelle anormale  ;
C. elegans HBR4Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-UnisHBR4Le génotype de cette souche transgénique C. elegans est HBR4 :goeIs3[pmyo-3 ::GCamP3.35 :: unc-54&ndash ; 3' utr, unc-119(+)]V. Cette souche n’a été utilisée que pour l’observation par imagerie.
E. coli strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-UnisOP50E. coli souche utilisée comme aliment pour C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)Biocosm, Inc., Hyogo, JaponBCM17-0001Puce microfluidique avec 25 50/60-µ droites ; m canaux de largeur utilisés dans toutes les expériences et observations de cet article  ;
Worm Sheet 60Biocosm, Inc., Hyogo, JaponBCM18-0001Puce microfluidique avec 20 60 droites µ ; Canaux de largeur M. Ceci est sitable pour les adultes 3 à 5 jours après l’éclosion à 20 °C.
Worm Sheet 50Biocosm, Inc., Hyogo, JaponBCM18-0002Puce microfluidique avec 20 50 µ droits ; Canaux de largeur M. Ceci est sitable pour les jeunes adultes ~3 jours après l’éclosion à 20° ;C.  ;
VERRE MICRO COVERMATSUNAMI GLASS IND. LTD.C030401Verre de couverture (épaisseur : 130-170 & micro ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3
Polystyrene FilmBiocosm, Inc., Hyogo, JaponBCM18-0001/ BCM18-0002Articles groupés de feuilles de vers. PS filim (épaisseur : ~130 & micro ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3.
Film polyester Lumirror TORAYINDUSTRIES, INC., Tokyo, JaponLumirror T60 (t 125 & micro ; m)PET filim (épaisseur : 125 µ ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3
IWAKI 60 mm/parabole non traitéeAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japon).1010-060Antenne non traitée utilisée pour l’induction de C. elegans dans le Protocole 1
IWAKI 35 mm/antenne non traitéeAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japon).1010-035Antenne non traitée utilisée dans les essais de locomotion dans le protocole 3
Milli-QMerck, FranceEau ultrapure
Kimwipe S-200Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japon62020120 mm x 215 mm ; 200 feuilles/ boîte
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation, CA, USA)59-AWPPlatina picker spécialisé pour la prise C. elegans
Système de stéréomicroscope de rechercheOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponMicriscope SZX16utilisé dans toutes les expériences et observations dans cet article
Support de mise au point motorisé pour SZX16OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponSZX2-ILLBIl a été utilisé pour l’observation en fond clair dans le protocole 3-8.
Objectif Lentille (& fois ; 1)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponSDFPLAPO1× ; PFNA : 0,15 ; L.D. : 60 mm. Ce prêt a été utilisé pour l’observation en fond clair dans le Protocole 3-8.
Objectif Lentille (& fois ; 2)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponSDFPLAPO2XPFCNA : 0,3 ; L.D. : 20 mm. Ce  ; Lends a été utilisé pour l’imagerie des observations.
Source lumineuse au mercureOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponU-LH100HGLe large spectre d’émission permet de mener une gamme d’expériences d’imagerie de fluorescence en utilisant tous les fluorophores courants.
Unité de filtre fluorescent SZX16 (haute performance pour YFP)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponSZX2-FYFPHQEx : 490-500 nm ; Em : 510 à 560. Cela a été utilisé pour l’observation par imagerie de la souche HBR4.
Appareil photo numérique haute vitesse EXILIMCASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, JaponEX-F1 Les figures 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C et la vidéo 1 ont été obtenues à l’aide de cet appareil photo numérique.
Office 2013Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, États-Unis LogicielExcel utilisé pour les analyses statistiques

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