Method Article

Production de pseudo particules pour étudier les coronavirus hautement pathogènes dans un cadre de niveau 2 de Biosafety

DOI:

10.3791/59010

⸱

March 1st, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine, Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences, Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center, University of Massachusetts Medical School

In This Article

Summary

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Nous présentons ici un protocole visant à générer des particules pseudo dans un cadre de BSL-2 intégrant la protéine spike du syndrome respiratoire de virus hautement pathogènes Moyen-Orient et coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère. Ces particules pseudo contiennent un gène de rapporteur luciférase permettant la quantification de l’entrée du virus dans les cellules de l’hôte cible.

Abstract

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Le protocole vise à produire des coronavirus (CoV) protéine de fusion épi (S) lignée de cellules de pseudo particules avec murine leukemia virus (MLV) core et la luciférase reporter, à l’aide d’une procédure simple de transfection de l’HEK-293 t largement disponibles. Une fois formé et libérés par les cellules de producteur, ces pseudovirions incorporent un gène de rapporteur luciférase. Puisqu’ils contiennent seulement le coronavirus hétérologue spike protéine sur leur surface, les particules se comportent comme leurs homologues de coronavirus native pour les étapes de l’entrée. À ce titre, ils sont excellents substituts des virions natives pour étudier l’entrée virale dans les cellules hôtes. Entrée réussie et infection dans les cellules cibles, le rapporteur de la luciférase est intégré dans le génome de la cellule hôte et s’exprime. À l’aide d’un simple de luciferase, cellules transduits peuvent être facilement quantifiés. Un avantage important de la procédure est qu’elle peut être réalisée en biosécurité niveau 2 installations (BSL-2) au lieu de niveau de biosécurité 3 installations requises pour le travail avec des coronavirus hautement pathogènes comme le Moyen-Orient syndrome respiratoire coronavirus (MERS-CoV) et coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS). Un autre avantage vient de sa polyvalence, car elle peut être appliquée aux protéines de l’enveloppe appartenant aux trois catégories de protéines de fusion virale, telle que la classe j’ai hémagglutinine (HA) de la grippe et glycoprotéine de virus Ebola (GP), le virus de forêt de Semliki II de classe E1 protéine, ou la glycoprotéine de virus G classe III stomatite vésiculeuse. Une limitation de la méthodologie est qu’il peut seulement récapituler étapes d’entrée virus médiées par la protéine de l’enveloppe étant l’objet d’une enquête. Pour l’étude des autres étapes du cycle de vie viral, les autres méthodes sont nécessaires. Parmi les nombreuses applications d’en que ces particules défectif peuvent être utilisés enquête de susceptibilité de cellule hôte et tropisme et tester les effets des inhibiteurs d’entrée de virus à disséquer les voies d’entrée virale utilisées.

Introduction

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Entrée de cellule hôte constitue les étapes initiales du cycle de vie infectieux viral. Pour les virus enveloppés, il s’agit de la liaison à un récepteur de cellule hôte unique ou plusieurs récepteurs, suivies de la fusion des membranes cellulaires et virales. Ces fonctions essentielles sont réalisées par l’enveloppe virale glycoprotéines1,2. La glycoprotéine d’enveloppe de coronavirus est appelée la protéine de l’épi (S) et est membre de la classe j’ai virales fusion protéines2,3,4,5,6. Étudier des glycoprotéines d’enveloppe virale est essentielle pour comprendre plusieurs caractéristiques importantes d’un virus donné, tels que : entrée de cellule de l’initiation du cycle de vie, son hôte et tropisme cellulaire, transmission interespèces, pathogénèse virale, ainsi que hôte voies. Des particules virales pseudo, aussi nommées pseudovirions, sont des outils puissants qui permettent de facilement étudier la fonction des protéines de fusion virale. Particules de pseudo ou pseudovirions sont des virions chimériques qui sont constitués d’un substitut virale avec une protéine de l’enveloppe virale hétérologue à leur surface. Le protocole vise principalement à montrer comment obtenir des coronavirus spike pseudo particules qui reposent sur un noyau de virus (MLV) leucémie murine et contiennent un gène de rapporteur luciférase. Par exemple, la méthode pour produire des particules de pseudo avec les protéines de l’épi du coronavirus du syndrome respiratoire (TCM) Moyen-Orient et hautement pathogène syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) sont présentés. Le protocole décrit la procédure de transfection impliquée, comment pour infecter les cibles sensibles des cellules et de quantification de l’infectiosité de l’analyse de luciferase.

Les marches de l’entrée des pseudovirions étant régies par le coronavirus S à leur surface, ils entrent dans cellules de façon similaire à homologues natives. À ce titre, ils sont excellents substituts des essais fonctionnels de l’infectivité. Pseudo particules proviennent généralement de virus modèle parental tels les rétrovirus (MLV7,8,10,d'9,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 et le virus d’immunodéficience humaine lentivirus — VIH23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) ou rhabdoviruses (virus de la stomatite vésiculeuse — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). lorsqu’il est utilisé en pseudotypage, les génomes des virus parental sont modifiées afin d’enlever les gènes essentiels, qui les rendent défectueux pour accomplir un cycle de réplication complet. Cette fonctionnalité leur permet d’être utilisé dans les installations de niveau intermédiaire biosafety (BSL-2) et est un avantage important par rapport à l’aide des virus hautement pathogènes indigènes qui nécessitent des installations de sécurité biologique plus élevées (niveau de biosécurité 3, BSL-4, qui ne sont pas aussi facilement disponibles) lorsque des études d’entrée de virus. Ici, les protéines S du risque groupe 3 agents pathogènes-SRAS et MERS-CoV sont utilisés comme exemples des protéines de l’enveloppe virale étant intégrées à MLV pseudo particules, générant des pseudovirions-SRAS S et S MERS-CoV (SRAS-Spp et MERS-Spp, respectivement). Ces pseudovirions ont été utilisées avec succès dans les études portant sur des événements d’entrée de ces virus48,49,50,51. Un autre avantage est que la technique décrite ici n’est pas limitée aux protéines coronavirus S pseudotypage : il est très flexible et peut être utilisé pour intégrer des représentants des trois catégories de protéines de fusion virale. On peut citer hémagglutinine de grippe (HA, classe I)52, glycoprotéines du virus Ebola (GP classe I), E1 protéine du virus de la forêt de Semliki alphavirus (SFV, classe II) et glycoprotéine VSV (G, classe III)53. En outre, plus d’une sorte de glycoprotéine virale peut être co intégrée à une particule de pseudo, comme dans le cas de la grippe HA et NA - pseudo particules51.

Basé sur le travail effectué par Bartosch et coll.20, ce protocole décrit la génération de MLV pseudo particules avec une stratégie de trois-plasmide co transfection avec le largement disponible et très compétent à la transfection HEK-293 t cell line 54. le premier plasmide encode le MLV principaux gènes gag et pol mais il lui manque le gène env MLV enveloppe. Le deuxième plasmide est un vecteur de transfert qui encode un gène rapporteur luciférase de firefly, un signal d’emballage Ψ-RNA MLV, ainsi que 5'-3'-accompagnement MLV longue répétition terminale (LTR) régions et. Le plasmide troisième code la protéine de fusion d’intérêt, dans ce cas soit la protéine S-SRAS ou MERS-CoV S. En co de transfection des trois plasmides à l’aide d’un réactif de transfection, les ARN et les protéines virales obtenir a exprimé dans les cellules transfectées permettant la génération de pseudo particules. Depuis MLV est utilisé comme épine dorsale pseudovirion, c’est le cas à la membrane plasmique : RNAs contenant la luciférase gène reporter et le signal de l’emballage s’encapsulé en particules naissants qui incorporent également exprimés par les membranes plasmiques des coronavirus spike protéines. Les particules qui bourgeonnent à partir de cellules contiennent la protéine coronavirus S à leur surface et sont récoltés pour utilisation lors d’essais de l’infectivité. Parce que les particules pseudo harbor la protéine coronavirus S et pas la protéine d’enveloppe MLV, lorsqu’il est utilisé pour infecter les cellules, ils se comportent comme leurs homologues de coronavirus native pour les étapes de l’entrée. L’ARN viral contenant le rapporteur de la luciférase et litres d’accompagnement est alors libéré dans la cellule et les activités de la polymérase rétroviraux permettent sa transcription inverse dans l’ADN et l’intégration dans le génome de la cellule hôte. Quantification de l’infectivité des particules virales de pseudo dans les cellules infectées est ensuite exécutée avec une analyse d’activité de la luciférase simple. Parce que la séquence d’ADN qui est intégrée dans le génome de la cellule hôte ne contient que le gène de la luciférase et aucun des gènes de protéine-codage MLV ou coronavirus, ils sont intrinsèquement plus sûrs à utiliser que les virus indigènes aptes à la réplication.

En plus d’être des substituts plus sûrs et hautement adaptable pour permettre l’incorporation de divers genres de glycoprotéines d’enveloppe, les pseudo particules décrites ici sont également très polyvalents et peuvent être utilisés pour étudier plusieurs aspects de l’entrée du virus. Ceci inclut mais n’est pas limité à : test de susceptibilité cellule hôte à l’infection par le virus, analyse les voies d’entrée cellulaire utilise un virus enveloppé, étudie les effets des inhibiteurs pharmacologiques et des projections de drogue, effectuant des anticorps de neutralisation essais, caractérisant l’entrée cellule hôte des virus enveloppés qui ne peuvent pas être cultivées et générant des vecteurs viraux pour la livraison de gène, stable cellulaire expression des gènes d’intérêt, ou de silençage génique.

Protocol

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1. cellule semis pour la Production de particules pseudo

Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.

  1. Par des techniques de culture cellulaire standard, obtenir un flacon de2 confluentes 75 cm 80 – 90 % des cellules HEK-293 t/17 repiquées dans Dulbecco complète du milieu modifié de l’aigle (DMEM-C) contenant de 10 % (vol/vol) sérum fœtal (SVF), 10 mM 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES), 100 UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Préparer milieu DMEM-T pour transfections (sa composition est la même que DMEM-C mais sans antibiotiques).
  2. Laver les cellules avec 10 mL de Dulbecco préchauffé (37 ° C) Phosphate Buffered Saline (SPD).
    Remarque : Gérer les cellules HEK293T/17 avec soin car ils se détachement facilement.
  3. Aspirer le surnageant et détacher les cellules avec 1 mL de solution de trypsine 0,25 % préchauffée à 37 ° C. Placer la fiole de cellules à 37 ° C, 5 % CO2 incubateur 3−5 min ou jusqu'à ce que les cellules commencent à détacher.
    Remarque : Évitez d’incubation des cellules avec la trypsine pendant plus de 5 min car cela mène habituellement à l’agglutination des cellules.
  4. Désactiver la trypsine en ajoutant 4 mL de DMEM-C moyen et le nombre de cellules utilisant une cellule comptage diapositive et au microscope photonique.
    Remarque : Pour éviter de compter trop de cellules, une étape de dilution supplémentaire peut être nécessaire au préalable. N’oubliez pas de tenir compte de cette dilution lors du calcul de la densité de cellule réelle des cellules trypsinisés.
  5. Diluer les cellules à 5 x 105 cellules/mL avec DMEM-C.
  6. Plaque de culture de tissu de 6 puits avec 2 mL de solution de cellule par puits de graines et doucement déplacer la plaque en arrière et côté à l’autre pour répartir les cellules, en évitant les mouvements circulaires.
    Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Répartie de façon uniforme les cellules s’assurera que les cellules ne pas s’agglutiner au centre du puits. À son tour, cela garantira efficacité de transfection bon et pseudo particules production.
  7. Incuber la plaque du jour au lendemain (16 – 18 h) dans un 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules.

2. trois-plasmide transfection co

Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.

  1. Observer des cellules au microscope inversé léger pour vérifier la morphologie cellulaire et la densité.
    Remarque : Idéalement, la densité cellulaire devrait être dans la gamme confluency de 40 à 60 %. Il est essentiel que les cellules ne soient ni trop anastomosé (80−90 % anastomosé), ni trop peu distribués (20−30 % anastomosé) dans chaque puits. Une densité cellulaire de 40−60 % confluence assurera la production de particules pseudo bonne.
  2. Mélange de plasmides
    1. Calculer le mélange de plasmide pour chaque glycoprotéine d’enveloppe suivant les quantités pour un puits d’une plaque de 6 puits indiqués au tableau 1. Multiplier les quantités si transfectants plusieurs puits et inclure un puits supplémentaire pour éviter de manquer de mélange.
      Remarque : Avec le SRAS S et S MERS-CoV encodage plasmides, comprennent la lutte antivectorielle vide pour la génération de particules de contrôle négatif qui manquent des glycoprotéines d’enveloppe virale (Δenv particules) ainsi que d’une glycoprotéine de contrôle positif tel que vésiculaire stomatite virus (VSV) G glycoprotéine est connu pour infecter fermement une très large gamme de cellules (VSV-ppm). Plasmides sont disponibles sur demande.
    2. Mélanger les volumes calculés de plasmides et de milieu de culture cellulaire sérum réduit (voir Table des matières) dans un tube de microcentrifuge.
  3. Réactif de transfection de lipides à base mix (voir Table des matières)
    1. Calculer le volume du mélange réactif de transfection des quantités indiquées dans le tableau 2 pour un puits (1:3 ratio de transfection, multiplier les quantités selon les besoins). Inclure des puits supplémentaires pour éviter de manquer de mélange réactif de transfection.
    2. Mélanger les volumes calculés de réactif de transfection de base de lipides (3 µL / puits) et le milieu de culture cellulaire sérum réduit (47 µL / puits) dans un tube de microcentrifuge, en veillant à ajouter le réactif de transfection dans le milieu de culture cellulaire sérum réduit et non l’inverse autour.
  4. Incuber les mélanges (pour un puits : 50 µL de plasmides mélanger et 50 µL de réactif de transfection de lipides à base de mélange) séparément pendant 5 min à température ambiante.
  5. Ajouter le contenu du mélange réactif transfection au mélange plasmides dans un rapport 1:1 (pour 1 bien : 50 µL de chaque mélange)
  6. Effectuer approfondie haut-bas pipetage du mélange qui en résulte.
  7. Incuber le mélange pendant au moins 20 min à température ambiante.
  8. Aspirez le milieu usé des cellules.
  9. Ajouter doucement 1 mL de milieu de culture cellulaire sérum réduit préchauffé (37 ° C) / puits.
  10. Ajouter goutte à goutte 100 µL du mélange de transfection dans chaque puits.
    Remarque : Soyez prudent lorsque vous ajoutez le mélange de transfection au puits de HEK-293 t comme ils se détachement facilement.
  11. Incuber les cellules dans un incubateur 5 % CO2 cell culture pendant 4 à 6 h 37 ° C.
  12. Ajouter 1 mL par puits de milieu DMEM-T préchauffé (37 ° C) qui ne contient-elle pas d’antibiotiques
    Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Réactifs de transfection augmentent la perméabilité cellulaire et augmentent la sensibilité aux antibiotiques. Pour assurer l’efficacité de transfection bon et production de pseudo particules, il est important d’éviter d’utiliser un milieu de culture cellulaire contenant des antibiotiques
  13. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 cell culture incubateur pendant 48 h.

3. pseudo particules Collection

Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.

  1. Observer les cellules sous microscope inversé de lumière pour vérifier la morphologie cellulaire et état général. Vérifiez également la couleur du milieu qui devrait être de lumière rose/légèrement orange.
    Remarque : Il s’agit d’une étape importante. S’il y a trop d’apoptose associée à la transfection ou la couleur moyenne tourné orange/jaune (pH acide), ce sera généralement associé à des rendements plus faibles dans les particules infectieuses pseudo
  2. Transfert de surnageants de cellules transfectées à tubes à centrifuger coniques 50 mL.
  3. Centrifuger les tubes à 290 x g pendant 7 min éliminer les débris cellulaires.
  4. Filtrer sur un filtre stérile 0,45 µm taille de pore surnageant clarifié.
  5. Faire des portions de faible volume (par exemple., 500 µL ou 1 mL) de solution de pseudo virus dans cryovials.
  6. Conserver à-80 ° C.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Pseudo particules restent stables à-80 ° C pendant plusieurs mois, mais une fois décongelé, éviter la recongélation eux comme ils perdront infectiosité

4. pseudo particules Infection des cellules susceptibles

Remarque : Effectuez cette étape dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.

  1. Cellule ensemencement des cellules sensibles à la plaque 24 puits
    1. Obtenir en standard techniques 80−90 % confluentes 75 cm2 flacon de culture cellulaire des cellules sensibles : cellules Vero E6 pour SRAS pseudo particules (SRAS-Spp) et Huh-7 cellules pour MERS-CoV S pseudo particules (MERS-Spp).
      Remarque : Pour confirmer que les pseudo particules qui ont été produites sont infectieuses, il est important de choisir avec soin une lignée de cellules sensibles approprié pour les essais d’infectiosité pseudovirion. En utilisant des cellules mal permissives conduira à faible potentiel infectieux.
    2. Laver les cellules deux fois avec 10 mL de pré chauffé (37 ° C) SPD.
    3. Aspirer le surnageant et détacher les cellules avec 1 mL de solution de trypsine 0,25 % préchauffée à 37 ° C. Placer la fiole de cellules à 37 ° C, 5 % CO2 incubateur 3−5 min ou jusqu'à ce que les cellules commencent à détacher.
      Remarque : Évitez d’incubation des cellules avec la trypsine pendant plus de 5 minutes, car cela mène habituellement à l’agglutination des cellules. Hein-7 cellules sont particulièrement sensibles à cet effet.
    4. Désactiver la trypsine en ajoutant DMEM-C moyen et le nombre de cellules utilisant une cellule comptage diapositive et au microscope photonique.
    5. Diluer les cellules à 5 x 105 cellules/mL avec DMEM-C.
    6. Puits de la graine d’un 24-puits sur plaque avec 0,5 mL de solution de cellule par puits et doucement déplacent la plaque en arrière et côté à l’autre pour répartir les cellules, en évitant les mouvements circulaires
      Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Répartie de façon uniforme les cellules s’assurera que les cellules ne pas s’agglutiner au centre du puits. Cela garantira à son tour, infectiosité bons dosages. Pour chaque particule pseudo (SRAS-Spp, MERS-Spp) et de la condition, préparer trois puits à trois répétitions expérimentales. Inclure des puits pour les non infectés (N.I.), les particules Δenv vecteur vide et les particules de contrôle positif comme VSV-Gpp
    7. Incuber pendant la nuit à la plaque (16−18 h) dans un 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules
  2. Infection de pseudo particules
    1. Observer des cellules au microscope photonique et confirmer visuellement qu’il n’y a un tapis confluent de cellules.
    2. Mettre cryovials de pseudo virus à fondre sur la glace.
    3. Cellules de laver trois fois avec 0,5 mL préchauffée (37 ° C) SPD
      Remarque : Il s’agit d’une étape clé. Cellules qui ne sont pas correctement rincés avant l’infection en général entraînent des lectures d’infectiosité faible
    4. Aspirer le surnageant de cellules.
    5. Ensemencer les cellules avec 200 µL de solution de particules pseudo décongelés.
    6. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 cell culture incubateur pour 1−2 h.
    7. Ajouter 300 µL de pré chauffé (37 ° C) milieu DMEM-C.
    8. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 cell culture incubateur pendant 72 h.

5. infectiosité Quantification par luciférase test lecture

Remarque : Effectuez les étapes initiales dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.

  1. Substrat de luciférine de dégel (conservés à-80 ° C) et 5 x luciférase dosage tampon de lyse (conservé à-20 ° C) jusqu'à ce qu’ils atteigne la température ambiante.
  2. Diluer le tampon de lyse dosage luciférase à 1 x avec de l’eau stérile.
  3. Aspirer le surnageant de cellules infectées par des particules de pseudo.
  4. Ajouter 100 µL de tampon de lyse luciférase dosage x en 1 à chaque puits.
  5. Placer la plaque sur une bascule et incuber pendant 15 min avec bascule à température ambiante (à partir de ce point, que la plaque peut être manipulée en dehors d’une armoire de biosécurité).
  6. Préparer des microtubes à centrifuger pour chaque puits en ajoutant 20 µL de substrat luciférine dans chaque tube.
  7. Allumez le luminomètre.
  8. Effectuer des mesures de l’activité luciférase un bien à la fois en transférant 10 µL de lysat dans un tube contenant 20 µL de substrat de la luciférine.
  9. Mettez le tube doucement pour mélanger le contenu, mais éviter de déplacer le liquide sur les parois du tube.
  10. Placer le tube dans l’appareil et fermez le couvercle.
  11. Mesurer la valeur de la luminescence du tube en utilisant le luminomètre.
  12. Enregistrer la mesure de l’unité lumineuse relative.
  13. Répétez les étapes 5,8 – 5.12 jusqu'à ce que tous les puits sont analysés.
    Remarque : Avec l’équipement approprié comme une plaque lecture luminomètre, ce processus peut être exécuté automatiquement. Le dosage devra être redimensionnées au format de plaque (par exemple le format de plaque à 96 puits, ).

6. analyse de données

  1. Calcul et traçage de moyennes et écarts-types de luciférase relative unités
    1. Un graphe traçant le logiciel permet de calculer la mesure de dosage luciférase moyennes et écarts-types d’expérimentale et biologique réplique.
    2. Tracer les données dans le graphique à barres avec des écarts-types.
      Remarque : Lorsque vous effectuez des analyses statistiques sur les données, assurez-vous d’inclure au moins trois réplicats biologiques dans des ensembles de données.

Results

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Résultats représentatifs des essais d’infectiosité du SARS-CoV S et S MERS-CoV pseudo particules sont indiquées à la Figure 1. Comme prévu, pour les deux figures 1A et 1 b, le VSV G pseudo positive particules contrôle (VSV-Gpp) a donné l’infectivité moyenne très élevée dans les 106 à 10 unités de luciférase relative de7 (RLU) rang respectivement. Pour S-SRAS infection de pseudo particules (Figure 1A) des cellules Vero-E6 susceptibles, une forte infectivité moyenne a été mesurée à environ 9,8 x 104 RLU. Cette valeur est presque 3 ordres de grandeur plus élevés que les valeurs mesurées pour le contrôle non infectés (1,1 x 102 RLU), ou les particules Δenv (1,5 x 102 RLU), qui ne pas héberger des glycoprotéines d’enveloppe virale à leur surface. De même, pour les MERS-CoV S infection de pseudo particules (Figure 1B) des cellules Huh-7, un moyen fort potentiel infectieux a été mesurée à environ 1,0 x 106 RLU. Il s’agit de presque 4 ordres de grandeur plus élevés que les valeurs mesurées pour le contrôle non infectés (0,8 x 102 RLU), ou les particules Δenv (2,0 x 102 RLU). Un dosage d’infectiosité supplémentaire a été effectué dans laquelle le SRAS-Spp et MERS-PSP en série ont été dilué et utilisé pour infecter les cellules Vero-E6 (Figure 2A). Ce test confirme que l’activité de la luciférase mesurée dépend de la concentration des particules utilisés pour infecter les cellules. Pour confirmer le rôle de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ECA2) et de la dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), les récepteurs du SARS-CoV et MERS-CoV, respectivement, dans la médiation attachement et entrée des particules pseudo, nous avons utilisé les cellules HEK-293 t mal permissif et pour exprimer l’ACE2 ou DPP4 transfectées (Figure 2B). Les cellules transfectées ont été utilisées ensuite pour un dosage de l’infectivité. Cette analyse démontre qu’à la surexpression du gène ACE2 et DPP4, il y a ~ 4-log et log-~ 2 augmentation d’infectiosité du SRAS-Spp et MERS-Spp, respectivement, confirmant que l’utilisation des récepteurs de pseudovirions est similaire à celle des virus natifs.

Les exemples montrés ici démontrent l’importance d’y compris négatif (non infectés, Δenv particules) ainsi que des conditions de contrôle positif (VSV-Gpp) lors de la production de particules pseudo. En effet, les particules de contrôle positif VSV-Gpp nous permettent d’évaluer si un lot particulier de pseudo particules a réussi à céder pseudovirions infectieuses et fonctionnelles. Résultats attendus de l’infection typique de VSV-Gpp particules dans des cellules de mammifères plus les lignes sont dans la gamme 106−107 RLU. Problèmes avec des cellules HEK 293 t 17/producteur (numéro de passage élevé, des problèmes avec la densité des cellules) ou de l’efficacité de transfection pauvres peut avoir un impact production de particules pseudo global et l’infectiosité. De plus, les conditions de contrôle négatif sont importantes car ils nous permettent d’évaluer les lignes de base des mesures RLU dans une lignée de cellules particulières (condition non infectés) et non-spécifique internalisation des particules (Δenv infection) qui n’est pas véhiculée par une protéine de l’enveloppe virale. Idéalement, pour un type donné de particule pseudo avec une protéine de l’enveloppe virale d’intérêt, il est recommandé d’obtenir des valeurs qui sont de plusieurs ordres de grandeur supérieures aux valeurs de contrôle négatif, comme ici sur la Figure 1A, B. Toutefois, si pour un type donné de cellules, une infection par le virus pseudo donne très peu d’infectiosité (c'est-à-dire, près de témoins négatifs tels comme dans la Figure 2B dans des conditions de N.T. non transfectées) il ne signifie pas nécessairement que le pseudo production de particules était défectueuse. Il pourrait bien être que la ligne de la cellule particulière utilisée n’est pas ou mal permissive à l’infection. Il est recommandé de vérifier si un type de cellule donnée devrait être sensible à l’infection par le virus à l’étude. Transfection des cellules mal permissives avec plasmid(s) exprimant dans que les récepteurs virales peuvent permettre l’entrée virale plus efficace et l’infection de se produire, comme le montre la Figure 2B, indiquer que la transfection des récepteurs ACE2 et DPP4 ciblent HEK-293 t les cellules, il y a ~ 4- et ~ 2-journal augmentation infectiosité, respectivement.

Plasmide/réactifQuantité
cmvp-MLVgagpol MLV gag et pol codant le plasmide300 ng
pTG-Luc vecteur de transfert avec le rapporteur de la luciférase400 ng
vector pcDNA-SRAS-S, pcDNA-MERS-S ou vide300 ng
Milieu de culture cellulaire sérum réduitÀ 50 µL

Tableau 1 : quantité de plasmides et de sérum réduit cell milieu de culture pour transfecter un puits d’une plaque de 6 puits de cellules HEK 293 t/17 pour la production de particules pseudo. De la concentration des préparations de plasmide, calculer le volume requis pour atteindre le montant requis d’ADN plasmidique. Si plus d’un puits est transfectées avec les plasmides mêmes, multiplier les volumes requis nombre de puits à transfecter et inclure un puits d’appoint dans les calculs pour éviter de manquer de mélange dans les étapes ultérieures. La quantité totale d’ADN étant transfecté est de 1 µg/puits. Plasmides sont disponibles sur demande aux auteurs.

RéactifQuantité
Réactif de transfection3 ΜL
Milieu de culture cellulaire sérum réduit47 ΜL

Tableau 2 : quantités de sérum réduit et le réactif de transfection de cellules milieu de culture pour transfecter un puits d’une plaque de 6 puits de cellules HEK 293 t/17 pour la production de particules pseudo. Multipliez les volumes requis nombre de puits à transfecter et inclure des puits supplémentaires dans les calculs pour éviter de manquer de mélange dans les étapes ultérieures. Le réactif de transfection : rapport d’ADN plasmidique utilisé est de 3:1.

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Figure 1 : Coronavirus S-pseudo essais d’infectiosité de particules dans les cellules hôtes sensibles à l’aide d’un gène de murine leukemia virus (MLV) épine dorsale et de la luciférase rapporteur. (A)-SRAS S pseudo particules infectiosité essai sur cellules Vero-E6. (B) S MERS-CoV pseudo particules infectiosité dosage dans les cellules Huh-7. Pour les deux (A) et (B), données restituées correspondant aux unités luciférase relative moyenne de trois expériences indépendantes, avec des barres d’erreur correspondant à la déviation standard (s.d.). Données tracées à l’échelle10 logarithmique sur l’axe des ordonnées. N.I. : contrôle non infectés ; Δenv : infection avec pseudo particules manquant de glycoprotéines d’enveloppe virale et de VSV-Gpp : infection avec pseudo particules portant contrôle positif VSV G glycoprotéine d’enveloppe. Autre abréviation utilisée, SRAS-Spp : infection par le SRAS-CoV S pseudo particules, MERS-Spp : infection avec S MERS-CoV pseudo particules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Concentration-dépendance de l’infectiosité de CoV S-pseudovirion et rôle des récepteurs ACE2 et DPP4 en entrée du SRAS-Spp et MERS-Spp. (A) Concentration-dépendance de l’infectivité du SRAS-Spp et MERS-PSP mesurée par analyse de l’activité de luciferase. Pseudovirions étaient en série diluées et utilisées pour infecter les cellules Vero-E6. Infectiosité (B), dosage du SRAS-Spp et MERS-PSP en cellules de cible mal permissives HEK-293 t transfecté à ACE2 express et les récepteurs de la DPP4, respectivement. Données tracées à l’échelle10 logarithmique sur axe des ordonnées comme dans la Figure 1 des expériences en double, avec des barres d’erreur correspondant à la déviation standard (s.d.). N.T. : les cellules non transfectées contrôle HEK-293 t ; EC2 : angiotensin converting enzyme 2 (récepteur-SRAS) et DPP4 : dipeptidyl peptidase 4 (récepteur des MERS-CoV). Autres abréviations utilisées sont les mêmes que dans la Figure 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Ce protocole décrit une méthode pour produire efficacement les particules pseudo portant la protéine S des risques groupe 3 coronavirus, SARS-CoV et MERS-CoV, dans un cadre de BSL-2. Ces particules, qui incorporent un gène de rapporteur luciférase, permettent de quantifier facilement coronavirus événements S-mediated entrée par une luciférase relativement simple dosage48,49,50,,51. Dans les essais d’infectiosité utilisant des cellules permissives, nous confirmons que l’activité de la luciférase mesurée dépend de la concentration des particules. En outre, ECA2 et DPP4 transfection du récepteur permet une entrée plus efficace dans les lignées de cellules mal permissive, telles que les cellules HEK-293 t. La méthode est très adaptable aux autres glycoprotéines d’enveloppe virale et a été largement utilisée48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, souvent en complément des autres épreuves comme des analyses biochimiques ou des infections de virus natif.

Le protocole que nous décrivons ici est basé sur le rétrovirus MLV qui incorpore un rapporteur de la luciférase. Toutefois, il est important de souligner qu’il existe un très large éventail d’autres systèmes de pseudotypage qui ont été développés avec succès pour emballage coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 et autre enveloppe virale glycoprotéines10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. certains de ces autres systèmes reposent sur les couramment utilisés MLV retroviral core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, ou basé sur le largement utilisé des gènes du VIH-1 système de pseudotypage en utilisant différentes stratégies23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, ou par le virus de la stomatite vésiculeuse rhabdovirus (VSV) comme noyau, qui permet d’incorporer une grande variété des glycoprotéines d’enveloppe, puis avec diverses stratégies utilisées37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. En outre, autres journalistes tels que protéines fluorescentes comme GFP11,13 et DP36ou enzymes autres que de la luciférase comme la β-galactosidase16,17 et sécrétée phosphatase alcaline (SEAP),42 ont été employés avec succès pour les mesures. En outre, dans l’analyse présentée dans le présent protocole, une transfection transitoire a été utilisée pour exprimer les gènes VCP et S du CoV et les protéines. Cependant, il y a des autres stratégies pour l’expression, comme la production de lignées cellulaires stables pour la production de virus pseudo7,14. Comme chacun de ces systèmes ont leurs avantages et leurs inconvénients, il est important d’examiner les paramètres importants suivants pour décider quel système pseudotypage mieux aux besoins de l’enquêteur : pseudovirion core (MLV, VIH-1, VSV ou autres), comment un noyau particulier pseudotypage sélective est en incorporant une glycoprotéine de l’enveloppe virale spécifique, reporter pour la lecture de l’essai (GFP, luciférase, SEAP ou autre) et la stratégie de transfection (nombre de plasmides impliqués dans la transfection co, transitoire transfection ou génération de lignées cellulaires stables).

Il y a un certain nombre d’étapes cruciales dans la méthode qui sont importants à souligner. La densité cellulaire, en particulier de la lignée de cellules HEK 293 t/17 producteur est un facteur critique pour assurer la transfection réussie. Une densité cellulaire au niveau de la confluence de 40 à 60 % s’est avérée pour être optimale. Des densités plus élevées généralement entraîner transfection faibles gains d’efficacité et de la production de particules de faible. En outre, il est important de garder à l’esprit que les cellules HEK-293 t/17 sont moins adhérentes que les autres lignées cellulaires. Il fallait être prudent lors de la manipulation afin d’éviter leur détachement inutilement. Une option consiste à traiter les surfaces en plastique de culture de cellules avec poly-D-lysine pour améliorer l’adhérence. En outre, passage de cellule supérieure aboutit souvent à des taux de transfection pauvres. Après avoir ajouté le réactif de transfection de cellules HEK 293 t/17, il est également important de se rappeler qu’augmente la perméabilité cellulaire. C’est pourquoi, à ce stade, il est préférable d’éviter d’utiliser des antibiotiques contenant moyens car ils peuvent augmenter la cytotoxicité. Avant de recueillir des particules de pseudo, vérifier la couleur des surnageants de cellules transfectées HEK-293 t/17. En règle générale, après 48 h de la transfection, la couleur du milieu de culture cellulaire prend une teinte rose-orangé. Couleur jaune moyen habituellement se traduit par des rendements de particules pseudo pauvres et résulte souvent des problèmes avec cellule ensemencement de densité ou numéro de passage élevé.

Dans ce protocole, production de pseudo particules est réalisée dans un format de plaque 6 puits. Pour augmenter le volume des particules produites, plusieurs puits d’une plaque de 6 puits peuvent être transfectées avec le même mélange de plasmides et les fractions surnageantes peuvent être regroupés ensemble. La piscine peut ensuite être clarifié, filtré et aliquotés. Par ailleurs, à l’échelle de production vers le haut, d’autres types de navires (par exemple, 25, ou 75 cm2 flacons) peuvent être utilisé. Dans ce cas, les conditions de transfection devraient être transposées en conséquence. Dans ce protocole, l’analyse de l’infectiosité est réalisée à l’aide d’un format de plaque 24 puits et un luminomètre qui permet uniquement des mesures un tube à la fois. Pour les projections à haut débit, les autres formats sont également possibles, tels que le format de la plaque à 96 puits et un luminomètre lecteur de plaque. Volumes et réactifs pour l’analyse de luciferase doivent être adaptés en conséquence. Stockage de pseudo particules dans cryovials à-80 ° C maintient leur stabilité pendant plusieurs mois sans réduction appréciable d’infectiosité. Il n’est pas recommandé de les soumettre aux cycles gel-dégel puisque cela diminuerait leur infectiosité au fil du temps. Ainsi, il est préférable de les stocker dans petites parties aliquotes tels que 0,5 à 1 mL et les décongeler avant une infection.

La méthode présentée ici présente plusieurs limites. Un important est le fait que les particules pseudo récapitulent événements entrée seulement virale. Pour analyser les autres étapes du cycle de vie infectieuses, autres tests sont nécessaires. En outre, comme MLV particules bourgeon à la membrane plasmique, il est important de garder à l’esprit que la glycoprotéine d’enveloppe étudiée a besoin pour également le trafic vers la membrane plasmique pour incorporation dans pseudovirions au cours de la production. Par conséquent, il est important de savoir où dans la cellule une glycoprotéine de l’enveloppe virale particulière s’exprime dans des conditions de transfection, comme en visualisant la localisation sous-cellulaire avec un test d’immunofluorescence, et/ou en recherchant les signaux de rétention au sein la protéine. Aussi, tandis que le protocole décrit les étapes pour produire et tester l’infectiosité, il ne pas détailler comment mesurer l’incorporation des glycoprotéines d’enveloppe virale en pseudo particules. Une méthode consiste à effectuer des analyses par transfert western sur des solutions concentrées de particules, comme décrit précédemment50,51 pour incorporation de MERS-CoV S. Ces essais, la glycoprotéine d’enveloppe S des MERS-CoV est détectée ainsi que de la protéine de capside (p30) de MLV, qui nous permettent de normaliser l’incorporation de la protéine S en particules. Autres exemples de ces tests analysant l’enveloppe virale glycoprotéines incorporation pseudovirions ont été effectués pour l’incorporation de SRAS S dans un VIH-1 des gènes pseudovirion système32 , Ebola glycoprotéines (GP) dans un autre MLV pseudo particule système17et hémagglutinine (HA) de la grippe et la neuraminidase (NA) en VSV pseudovirions38. Un développement récent en caractérisant la production de particules pseudo est l’utilisation des appareils d’imagerie innovantes telles que Nanosight : il nous permet de directement visualiser, quantifier et de taille de particules virales50. L’appareil fournit des renseignements détaillés sur la production globale de particules ; Toutefois, il est important de garder à l’esprit qu’il ne fournit pas d’informations sur l’incorporation de glycoprotéine enveloppe. Une orientation future pour l’application de ces particules pseudovirion polyvalent est d’analyser les événements de fusion virale individuels à l’aide de suivi une seule particule, microfluidique et réflexion totale interne fluorescence microscopy60,61 ,,62. Ces approches ont été appliquées avec succès à virus grippal et coronavirus félin particules comme grippe HA - et NA-pseudo axée sur la VSV pseudovirions63. Le déploiement de ces techniques appliquées au coronavirus S-pseudo particules axée sur la canalisation principale est en cours d’élaboration.

Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier tous les membres des laboratoires Whittaker et Daniel des commentaires utiles. Recherche a été financé par le NIH subventions R21 AI111085 et AI135270 R01. T.T. reconnaît le soutien de la bourse de sciences de la vie présidentielle en Cornell University et National Science Foundation recherche Fellowship programme d’études supérieures sous le Grant no. DGE-1650441. L.N. reconnaît le soutien d’un Samuel C. Fleming famille bourse d’études supérieures et de la National Science Foundation recherche Fellowship programme d’études supérieures sous le Grant no. DGE-1650441. Ce travail est également soutenu par la National Science Foundation 1504846 (à S.D. et G.R.W.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cellules de rein embryonnaire humain (HEK) HEK-293T/17ATCCCRL-11268Clone 17 cellules sont très compétentes pour la transfection.
Épithélial rénal de singe vert africain Cellules Vero-E6ATCCCRL-1586
Cellules hépatiques humaines Huh-7  ;Instituts nationaux japonais de l’innovation biomédicale, de la santé et de la nutritionJCRB0403
Microscope à lumière inversée avec objectif 10 &NikonTS100
Dulbecco' modification du milieu d’Eagle (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine sans pyruvate de sodiumCorning Mediatech10-017-CV
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS)Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES)  ;Corning Mediatech25-060-Cl
100 × ; solution de pénicilline-streptomycine (PS)Corning Mediatech30-002-Cl
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) avec Ca2+ et Mg2+ ;Corning Mediatech21-030-CV
0,25 % de trypsine, 2,21 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 1 & fois solution  ;Corning Mediatech25-053-Cl
Lames de comptage de cellules avec grilles  ;Kova87144
Milieu essentiel Opti-minimal (Opti-MEM)Thermo Fisher Scientific, Gibco31985-070
Lipofectamine 2000 réactif de transfectionThermo Fisher Scientific, Invitrogen11668-027
0.45 µ ; Filtre stérile de la taille des pores M  ;Pall4184
Seringues de 10 mLBD309604
5 &fois ; tampon de lyse pour dosage de la luciférase  ;PromegaE1531
Luciférine, substrat pour le dosage de la luciférasePromegaE1501
Eau stérile.Luminomètre VWRE476-1L
GloMax 20/20Promega2030-100

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