L’hormone sécrétée par le cortex surrénalien est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. Nous présentons ici un protocole à la culture le rat primaire les cellules surrénales. Ça pourrait être une bonne plateforme in vitro pour étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans la stéroïdogénèse surrénalienne et la biosynthèse des lipides.
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Article de méthode
Culture primaire de cellules Corticosurrénaliennes Rat et tests des fonctions Stéroïdogéniques
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’hormone qui sécrète de la corticosurrénale est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. La méthode décrite ici est la procédure de cellules surrénaliennes cultivés primaires de rat et des tests fonctionnels (immunofluorescence souillant de protéine de surface de gouttelettes lipidiques, ainsi que l’analyse corticostérone). Contrairement à un modèle in vivo, la variation d’interexperiments dans des cultures monocouches surrénalienne est inférieure et la condition expérimentale est facile à contrôler. En outre, la source des rats est aussi plus stable que les autres animaux, comme les bovins ones. Il y a aussi plusieurs lignes de cellules surrénales humaines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) qui peuvent être utilisées dans les études surrénaliennes. Cependant, la production de stéroïdes de ces lignes sera toujours influencée par de nombreux facteurs, qui comprennent le numéro de lot de sérum, nombre de passage, mutant/perte de gènes distincts, etc.. Sauf faute de 17α-hydroxylase, la culture primaire de cellules corticosurrénaliennes rat est une technique mieux et plus pratique pour l’étude de la physiologie surrénalienne. En résumé, les glandes surrénales cultures primaires de rat pourraient être une bonne plateforme in vitro pour les chercheurs d’étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans le système de la glande surrénale.
Introduction
Le système endocrinien est chargé de réglementer les activités physiologiques et l’homéostasie du1. Les glandes surrénales situées au pôle crânial des reins sont l’un des principaux organes endocrines qui sécrètent les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes et androgènes2,3. Il y a deux parties distinctes de la glande surrénale : le cortex et la médulla. Le cortex surrénalien se compose de trois couches : la glomérulée externe, le fasciculata intermédiaire et les reticularis interne3. La zone glomérulée est le site original de sécrétion d’aldostérone, un minéralocorticoïde, qui facilite en résorbant les ions sodium et eau dans les reins à3. Le fasciculata de zona produit principalement un niveau basal des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques normales3. Corticostéroïdes chez les rongeurs et le cortisol chez l’homme agissent pour aider le corps à gérer le stress en régulant le débit sanguin de glucose3. Dans une certaine mesure, ils peuvent inhiber les réponses inflammatoires et réguler le système immunitaire4,5. Contrairement aux autres mammifères, les souris et les rats n’ont pas un reticularis de zona fonctionnelle en raison de l’absence d’une expression 17α-hydroxylase dans la glande surrénale6,7. Ainsi, les glandes surrénales de rats et de souris sont dépourvues de la sécrétion des stéroïdes de C-19 surrénales (cortisol et androgènes surrénaux).
Primaire des cellules corticosurrénales ont est avérés utile pour étudier les mécanismes contrôlant la physiologie surrénalienne8. Comme les autres tissus stéroïdogènes, chaque zone surrénalienne synthétise ses stéroïdes du cholestérol libre9. Lors de la stimulation de l’hormone adrénocorticotrope (ACTH), le cholestérol libre est libéré de gouttelettes lipidiques de ventilation et, par conséquent, améliore la production de stéroïdes chez le fasciculata et reticularis10.
Plusieurs groupes ont tenté d’établir des lignées stables de carcinomes corticosurrénales. Toutefois, plusieurs préoccupations ont limité l’utilisation de lignées de cellules corticosurrénaliennes comme vitro modèles8. Les réponses de stéroïdes de lignées cellulaires peuvent différer entre les passages, le numéro de lot du sérum et la qualité du sérum, etc.. En outre, des lignées de cellules surrénaliennes commerciale (Y1 et SW13) ne pas sécréter corticostérone, rendant plus difficile à étudier la stéroïdogénèse surrénalienne8. L’utilisation des surrénales bovines et équines comme ex vivo modèles peuvent être un bon choix, même si les tissus de ces marchés peuvent occulter certains risques inconnus. Comparé à eux, gestion des glandes surrénales de rat est plus facile et la source est relativement plus stable et exempts de micro-organismes pathogènes. Pris ensemble, la présente méthode décrite ici pourrait être utilisée pour étudier le mécanisme de synthèse de la corticostérone dans les cellules surrénales fasciculata rat.
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Protocole
Toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par animalier institutionnel et utilisation Comité de Kaohsiung Medical University.
1. marche à suivre
- Sacrifier les rats de SD femelle/mâle adulte (8 à 12 semaines) en CO2 euthanasie.
- Appliquer de l’éthanol à 70 % et laissez-le être absorbée par la peau et puis essuyer la peau avec un papier de soie.
- Mettre le rat sur une plaque de plastique propre en décubitus dorsal.
- Soulever la peau avec une pince courbe « externe » à la ligne médiane et effectuer une dissection émoussée en créant une forme de «Y» (du niveau de la cuisse jusqu'à l’angle sous-costal).
- Rincer les ciseaux à l’éthanol à 70 % et, ensuite, couper le muscle, en créant une forme de «Y».
-
Trouver la glande surrénale gauche derrière l’estomac.
Remarque : la surrénale droite se trouve profondément derrière le foie.- Utilisez une paire de pinces pour soulever l’estomac ou le foie et isoler les glandes surrénales avec une autre pince courbée.
- Après avoir mis les glandes surrénales dans un récipient stérile, retirer délicatement la capsule surrénale avec une pince fine.
- Avec une délicate paire de ciseaux, couper les glandes surrénales en petits morceaux avec un petit peu de Dulbecco sans sérum de l’aigle modifié (DMEM) / F-12 moyen.
-
Préparer trois pipettes Pasteur pore taille différentes et la première pipette Pasteur permet d’aspirer tous les morceaux surrénaliennes dans un tube conique de 50 mL contenant le support avec la collagénase II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Doucement, broyer les morceaux de tissus sur x 10. Utiliser le reste de la pipette et répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que toutes les pièces deviennent plus petites.
Remarque : La taille des pores différentes des pipettes Pasteur peut être créée en les chauffant avec le feu. La première pipette est la taille d’origine (environ 1 mm), la taille des pores de la seconde est d’environ 0,8 mm et la pipette Pasteur troisième est d’environ 0,5 mm. Au cours de la digestion, les morceaux de surrénales deviendra plus petits. Ainsi, via la procédure mécanique, les glandes surrénales peuvent être digérées plus achevé. Incuber le tube dans un bain d’eau (à 37 ° C) et l’agiter toutes les 5 min, 4 x au total.
- Doucement, broyer les morceaux de tissus sur x 10. Utiliser le reste de la pipette et répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que toutes les pièces deviennent plus petites.
- Après l’incubation de 20 min, ajouter le milieu frais et cool (sextuple volume ; par exemple, 5 mL de tissu + 25 mL de cool milieu DMEM/F-12) contenant 2,5 % bovine sérum fœtal (SVF) et 5 % de sérum de cheval pour arrêter l’effet de l’enzyme.
- Recueillir les granules cellulaires par centrifugation à 800 x g pendant 10 min.
- Ajouter un volume approprié de moyenne à suspendre les cellules.
Remarque : Chaque glande peut faire environ 3 ~ x 105 à ~ 4 x 105 cellules. - Les cellules souhaitées assiettes ou plats sur plaque avec milieu de culture (mélange 1:1 [v/v] du milieu DMEM et du jambon F-12 additionné de 25 mM HEPES et 1 % pénicilline et de streptomycine) nuit (jour 0) à 37 ° C, dans un environnement humidifié de 95 % air et 5 % de CO2.
Remarque : Généralement, nous plaque cellules en plaques 24 puits (quatre glandes/plaque) pour le dosage de la corticostérone et en 35 mm plats (glande un/environ un ou deux plats) pour western blot analyse. - Se laver soigneusement les cellules 2 x avec sans sérum chaud milieu DMEM/F-12 (jour 1). Remplacer le nouveau milieu de culture.
- Maintenir les cellules à 37 ° C dans un environnement humidifié de 95 % air et 5 % de CO2 jusqu’au jour 3.
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Résultats
En utilisant la procédure décrite ici, les cellules surrénales cultivés primaires se distinguaient sous un microscope à contraste de phase (Figure 1 a). Pour confirmer que les vésicules dans le cytoplasme sont des gouttelettes lipidiques, la coloration à l’immunofluorescence de protéine de liées à la différenciation adipeuse (PACA) pourrait être réalisée sur des cultures de jour-3 (Figure 1 b). Les cellules ont été cultivées sur ...
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Discussion
Les glandes surrénales jouent un rôle clé dans l’adaptation environnementale3. Le par lequel la corticosurrénale sécrète l’hormone permettant de régler et ajuster les fonctions physiologiques et l’homéostasie du3. Le modèle in vivo reflète les effets réels physiologiques dans le corps. Toutefois, il est toujours influencée par de nombreux facteurs complexes, provoquant des effets instables dans les expériences. En revanche, le modèle in vitro de cellules possède des avantag...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Taiwan National de conseil scientifique (NSC102-2320-B-037-008-MY3) et une subvention de recherche kit de développement National Cheng-Kung University hôpital (NCKUH-10102045).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Rats femelles/mâles, SD/Wistar (8-12 semaines) | BioLASCO | conviennent aux expériences. Les glandes surrénales des femelles sont plus grandes que celles des rats mâles, cependant, les rats femelles possèdent les cycles œstraux qui peuvent influencer les expériences | |
| Collagénase, type II | Sigma | C-6885 | isolement des cellules surrénales |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | milieu en poudre pour cellules surrénales |
| F12 | ThermoFisher | 21700-075 | milieu en poudre pour cellules surrénales |
| HEPES | JT.baker | 4018 | tampon (poudre) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Sérum de cheval | Hyclone | 16050014 | |
| Sérum fœtal bovin | SAFC | 12103C | |
| Pénicilline (10 000 U)-streptomycine (10 000 μg/mL) | Antibiotiques Corning | 30-002-Cl | |
| Pince courbe | BRAUN | BD343R | |
| Pince | BRAUN | BD331R | |
| Ciseaux | BRAUN | BC224R | coupe peau et muscle de rat |
| Ciseaux délicats | BRAUN | BC101R | coupe glandes surrénales |
| Protéine liée à la différenciation adipeuse | Abcam | ab108323 | anticorps pour gouttelettes lipidiques Protéine associée |
| Corticostérone Kit ELISA | cayman | 500655 | dosage pour la synthèse de la corticostérone |
| Microscopie à lumière inversée | Microscope à fluorescence Leica | ||
| Nikon | |||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | pour la coloration par immunofluorescence |
| IgG anti-lapin IgG Alexa 488 Anticorps secondaire fluor | ThermoFisher | A-11034 | pour la coloration par immunofluorescence |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | pour la coloration par immunofluorescence |
| ProLong Gold monteur anti-décoloration | ThermoFisher | P36935 | pour la coloration par immunofluorescence |
Références
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Réimpressions et autorisations
