En utilisant en forme in Vitro et dans les cellules d’enquêter sur petites molécules a induit des changements structurels de l’ARN pré-messager

Acylation sélective 2'-hydroxyle analysée par extension d’amorce (SHAPE) est une méthode de mesure de la cinétique de chaque nucléotide dans une séquence d’ARN d’intérêt et élucider la structure secondaire à mononucléotidiques résolution¹. Méthodologies de forme, tant en conditions in vitro^2,3,4 (l’ARN purifié dans un système tampon définie) et dans la vie des cellules de mammifères^5,6, ont été développées afin d’étudier l’enseignement secondaire structure des séquences de longueur moyenne RNA (typiquement < 1 000 nucléotides de forme dans les cellules et < 200 nucléotides pour forme in vitro). Il est particulièrement utile pour évaluer les changements structurels dans le récepteur RNA lors de la liaison à RNA-interaction petite molécule métabolites^2,4,,^7,8 et d’étudier les actions mécaniques des molécules ciblant les RNA au cours de la drogue le développement^9,,¹⁰.

Découverte de médicaments ciblant les RNA a récemment attiré l’attention dans des laboratoires universitaires et l’industrie pharmaceutique^11,12 via différentes approches et stratégies^{13,14,15 ,16}. Exemples récents de ciblage RNA de petites molécules pour l’usage clinique notamment deux médicaments expérimentaux structurellement distinctes, LMI-070¹⁷ et^18,RG-7916¹⁹, pour l’atrophie musculaire spinale (SMA), qui a montré prometteur résultats de la phase II des essais cliniques²⁰. Les deux molécules ont démontré que la survie des motoneurones (SMN) cible 2 pré-ARNm et réguler le processus d’épissage du gène SMN2^6,17,21. Nous avons démontré antérieurement à l’application de l’in vitro et forme dans les cellules par un examen des changements structurels en présence d’un analogue de RG-7916 appelée SMN-C2⁶ARN cible.

En principe, forme mesure le taux de l’acylation de 2'-OH de chaque nucléotide d’une séquence d’ARN en présence de quantités excessives d’un réactif d’acylation auto extinction de manière impartiale. Le réactif d’acylation n’est pas stable dans l’eau, avec une courte demi-vie de (par exemple, T_1/2 = 17 s 1-méthyl-7-nitroisatoic anhydride ; ou 1 M 7, environ 20 min pour 2-methylnicotinic acid imidazolide, NAI)²² et une insensibilité à l’identité de les bases²³. Il en résulte une acylation plus favorable des groupes de base, souple, qui peut être transformé en une évaluation précise de la dynamique de chaque nucléotide 2'-OH. Plus précisément, un nucléotide dans une paire de base est généralement moins réactif qu’un non apparié à un réactif de modificateurs de 2'-OH, comme NAI et 1 M 7.

En regardant la source du modèle RNA, et où s’effectue l’acylation de la 2'-OH, forme peut généralement être classé en forme in vitro et dans les cellules. Dans des utilisations de vitro forme purifiée T7 transcrit RNA et ne dispose pas d’un contexte cellulaire dans des modèles expérimentaux. En forme dans les cellules, la transcription de l’ARN modèle et acylation de la 2'-OH se produisent dans des cellules vivantes ; par conséquent, les résultats peuvent récapituler le modèle structurel de RNA dans un contexte cellulaire. FORME dans les cellules a été mentionnée comme dans vivo forme pour la forme dans les cellules vivantes dans la littérature²⁴. Étant donné que cette expérience n’est pas effectuée chez un animal, nous avons appelé cette expérience forme dans les cellules pour une précision.

Les stratégies pour la phase d’extension amorce de forme in vitro et dans les cellules sont également différentes. En forme in vitro, transcription inverse s’arrête à la position 2'-OH de l’acylation en présence de Mg^{2 +}. Une extension d’amorce de ³²P-labled apparaît donc comme une bande dans l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et l’intensité de la bande est proportionnelle à l’acylation taux¹. En forme dans les cellules, transcription inverse génère des mutations aléatoires à la 2'-OH adduit position en présence de Mn^{2 +}. Le taux de mutation de chaque nucléotide peut être capturé par séquençage de prochaine génération de profondeur, et la réactivité forme mononucléotidiques résolution peut alors être calculée.

Un problème potentiel pour la forme dans les cellules est le rapport signal-bruit faible (c.-à-d., une majorité des groupes 2'-OH est non modifiée, alors que les séquences non modifiées occupent la plupart de la lire dans le séquençage de nouvelle génération). Récemment, une méthode pour enrichir la 2'-OH modifié RNA, visé comme en vivo, cliquez sur la forme (icSHAPE), a été développée par le laboratoire de Chang²⁵. Cette méthode d’enrichissement peut être avantageuse, dans l’étude de faibles petites molécules telles que les interactions de RNA, surtout dans un interrogatoire à l’échelle du transcriptome.

1. in Vitro forme

Remarque : Le protocole est modifié par le protocole publié¹.

1. Préparer le descripteur d’ARN
   Remarque : Le modèle pour la transcription T7 a été condamné comme une synthèse ADN à double brin (dsDNA) et amplifié par une insertion dans un vecteur d’e. coli qui porte une paire unique de sites de l’endonucléase de restriction EcoRI/BamHI, tels que pET28a, ou par PCR. Le protocole pour l’amplification PCR est illustré ci-dessous.
   1. Mélanger le matériel suivant : mélanger 50 μL de maître PCR (voir Table des matières), 2 μL de chaque amorce à 10 μM (voir le tableau 1 pour les séquences), 200 ng d’ADN double brin modèle 2 μL 3 μL du diméthylsulfoxyde (DMSO) et 41 μL de H₂O. aliquote dans deux PCR tubes (chaque tube contient 50 μL de mélange réactionnel).
   2. Mettre en place le thermocycleur comme suit : étape 1) 95 ° C pendant 30 s ; stade 2) 95 ° C pendant 20 s ; Etape 3) 56 ° C pendant 20 s ; Etape 4) 72 ° C pendant 20 s ; boucle de l’étape 5) retour à l’étape 2 pour 30 cycles ; étape 6) 72 ° C pendant 3 min ; et l’étape 7) infinie tenue à 4 ° C jusqu'à l’étape suivante.
   3. Purifier l’amplicon PCR par extraction des tranches de gel (voir Table des matières et utilisation protocole du fabricant). Éluer le produit ADN avec 35 μL de tampon Tris-EDTA (TE), contenant 10 mM Tris (pH 8,0) et 1 mM EDTA, à céder un 0,1 à 0,5 μg/μL modèle. Normaliser la matrice d’ADN purifiée en 0.10 μg/μL.
      Remarque : Éventuellement, on peut doser la qualité du modèle sur un électrophorèse sur gel d’agarose de 1,8 % avec 0,10 μg d’ADN. Une seule bande de modèle désiré QU'ADN est attendu sur le gel.
   4. Configurer la réaction de transcription T7 (volume total 40 μL) en ajoutant les matériaux suivants dans un tube PCR : 4 μL de 10 x tampon de réaction, 4 μL d’ATP, 4 μL de CTP, 4 μL de GTP, 4 μL d’UTP, 4 μL d’enzyme T7 (voir Table des matières) , 4 μL de purifiée amplicon PCR de l’étape 1.1.3 (0,4 μg) et 12 μL de diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-l’eau traitée. La composition de pipetage et descendre de 4 x. Incuber à 37 ° C pendant 4 à 16 h dans un thermocycleur ou dans un incubateur à 37 ° C.
      Remarque : Commencer à mettre en place étape 1.1.6 tandis que la réaction à l’étape 1.1.4 est en cours.
   5. Ajouter 2 μL de DNase, mixer en pipettant également monter et descendre de 4 x et incuber à 37 ° C pendant 15 min. mélange à volume égal de 2 x Tris-borate-EDTA (TBE)-tampon urée (voir Table des matières). Faire chauffer à 70 ° C pendant 3 min inactiver.
   6. Dans une bouteille de RNase-libre, mélanger 75 mL de solution à 40 % d’acrylamide/bisacrylamide (29 : 1, voir la Table des matières), 180,2 g d’urée et 50 mL de tampon de x TBE 10 (RNase-libre, voir la Table des matières). Placer le biberon dans un agitateur orbital (250 tr/min) jusqu'à ce que tous les cristaux d’urée sont dissous (peut prendre jusqu'à 2 h). Réglez le volume de 500 mL avec de l’eau traitée DEPC. Filtrer la solution avec une membrane 0,2 μm (voir Table des matières).
      Remarque : Dans ce processus, éviter l’utilisation spéculaire et remuer-bar pour prévenir la contamination de la RNase. La solution peut être conservée à 4 ° C pendant 1 an.
   7. Nettoyer les deux plaques de verre d’électrophorèse d’une taille correcte (16,5 x 24 cm) avec l’eau désionisée et 70 % EtOH à l’aide d’un morceau de papier d’essuyage. Aligner les plaques avec une paire d’entretoises de 2,0 mm (la plaque avec une surface siliconée est vers l’intérieur) et sceller le bord des plaques avec du ruban adhésif. Double-tape au coin de la plaque pour éviter des fuites.
   8. Dans un bol, mélanger 200 mL de solution d’acrylamide de 100 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) étape 1.1.6 et 2,0 mL de la solution de persulfate d’ammonium 10 % avec une pointe de pipette RNase-libre en le remuant rapidement pendant 30 s. Tilt les plaques sur un morceau de la couverture de benchtop et versez la solution de l’écart des plaques. Taper la plaque pour soulever les bulles et placer le plat sur la couverture de benchtop. Immédiatement, insérer le peigne et laisser le gel se polymériser pendant au moins 1 h.
      Remarque : Si le gel est à utiliser dans le lendemain, couvrez le dessus du gel avec un morceau d’essuie-tout humide et enveloppe vers le haut avec un gros morceau de pellicule plastique. Placez-le couché à plat à 4 ° C.
   9. Enlevez le ruban et fixer la plaque dans un stand de l’électrophorèse. Retirer le peigne et ajouter 1 suffisant de tampon de x TBE en haut et en bas du réservoir. Avant de courir le gel pendant 30 min à 20 w.
      Remarque : Éventuellement, si le contenu de l’ARN souhaitée est de ~ 90 % ou plus, un mini gel peut être utilisé en remplacement d’un gel préparatif.
   10. Lavez chaque puits chargement par pipetage en haut et en bas deux fois avec le liquide dans le réservoir. Ajouter RNA brut de l’étape 1.1.5 dans les puits. Exécutez le gel à 20 W jusqu'à ce que le colorant xylène cyanol FF (bleu clair) passe environ les deux tiers de la longueur du gel (~ 60 min).
       Remarque : Vérifier que vous chargez pas plus d’un tiers de la hauteur du puits (utiliser plusieurs puits si nécessaire).
   11. Immerger le gel dans 1 x TBE tampon de dilution de 1/10 000 du coffre-fort teindre (voir Table des matières) dans un récipient assez grand pour le gel. Placer le récipient dans un agitateur orbital pendant 5 min à 80 tr/min.
   12. Sous la lumière UV, identifier la gamme de RNA désirée et couper rapidement une mince bande de gel à l’aide d’une lame de rasoir propre. Mettre 1 à 2 tranches de gel dans un tube de 1,7 mL.
   13. Récupérer l’ARN de la tranche de gel par élution passive. Ajouter le mélange à élution/précipitations adéquates (~0.3 mL / tranche) dans chaque tube : 0,3 M NaOAc (pH 5,2), 2,5 M LiCl, EDTA 1 mM, 0,1 % dodécylsulfate de sodium (SDS) dans l’eau traitée DEPC. Tourner le tube contenant le www.PetSafe.net gel à 4 ° C pendant 16 h.
       Remarque : Un taux de récupération typique est environ 75 % dans cette étape. Pour augmenter le rendement, enlever et recueillir l’éluant et ajouter le même volume de tampon d’élution, puis répétez cette étape.
   14. Combiner l’éluant dans un nouveau tube de 1,7 mL. Ajouter 2,5 x EtOH glacee, inverser les tubes six fois pour mélanger le liquide et placer les tubes à-80 ° C pendant au moins 1 h.
   15. Centrifugation pendant 10 min à 10 000 x g et 4 ° C. Retirer délicatement le surnageant de pipetage. Laver le culot de RNA en ajoutant 80 % EtOH (1 mL par tube), vortexer pendant 15 s et centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et 4 ° C.
   16. Retirez le surnageant et sécher le culot de RNA pour 5 min. ajouter 50 μL d’eau exempte de RNase et mélanger en pipettant également monter et descendre de 10 fois. Normaliser la concentration d’ARN à 0.10 μg/μL. Magasin l’ARN purifié à-80 ° C.
       Remarque : Ne pas trop sécher le culot de RNA.
   17. Éventuellement, pour analyser la qualité de l’ARN, diluer 1 μL (100 ng) de l’ARN d’étape 1.1.16 dans 5 μL d’eau et mélanger avec 5 μL de tampon 2 x TBE-urée. Ensuite, chauffer à 70 ° C pendant 3 min et charge sur un mini-gel TBE-urée de 6 %.
       1. Exécutez le gel à 180 V pendant 1 h. effectuer la coloration comme fait à l’étape 1.1.11. Visualiser le gel avec UV dans un système d’imagerie. Une seule bande est attendue à la longueur désirée.
2. Préparer les ³²P-labeled primer
   1. Mettre en place la réaction en mélangeant les matières suivantes : 10 μL de γ -³²P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, voir Table des matières), 2 μL d’apprêt (100 μM, pour voir séquence, tableau 1) de la transcription inverse (RT), 2 μL de 10 x T4 polynucléotide kinase (PNK) tampon de réaction, 1 μL de T4 PNK (voir Table des matières) et 5 μL d’eau exempte de RNase. Incuber à 37 ° C pendant 1 h.
      Mise en garde : Une protection adéquate est nécessaire pour les étapes 1,2 à 1,5 dans un milieu de travail autorisé pour les matériaux radioactifs.
   2. Chaleur-inactiver pendant 20 min à 65 ° C. Ajouter les échantillons sur une colonne de dessalement et centrifuger à 1 000 x g pour 1 min. mélanger l’éluant avec 25 μL de tampon de 2 x TBE-urée. .
      Remarque : Stocker le produit brut marqué à-20 ° C si elle ne doit ne pas être immédiatement purifiée.
   3. Exécuter un gel d’acrylamide de 10 % à 20 W pendant 1 h.
      Mise en garde : Charger les ³²P-labeled primer de l’étape 1.2.1 sur le gel et d’éviter le saignement de la radioactivité dans le réservoir supérieur. Ne chargez pas plus d’un tiers de la hauteur du puits pour s’assurer une petite bande sur le gel (utiliser plusieurs puits si nécessaire). Le liquide dans le réservoir inférieur peut être hautement radioactif.
   4. Enlever les plaques de verre de la cassette de gel et posez le gel sur un morceau de pellicule plastique. Rabattez le film étirable pour couvrir la partie supérieure du gel pour faire un sandwich étanche à l’air. Placer le gel "sandwich" sur un écran de phosphore de tungstate de calcium et d’exposer avec un instrument d’imagerie. Le gel avec lumière régulière de savoir où sont les bords du gel de l’image.
   5. Utiliser une logiciel de traitement d’image pour superposer les deux images. Aligner le gel sur l’image imprimée. Utilisez une nouvelle lame de rasoir pour couper les bandes désirées hors gel. Mettre 1 à 2 tranches de gel dans un tube de 1,7 mL.
      Remarque : Assurez-vous que l’image imprimée a la même taille que le gel actuel. Vérifiez bien l’alignement par le gel de reste d’imagerie à nouveau après avoir coupé la tranche de gel.
   6. Récupérer le ³²P-labeled primer en suivant les étapes 1.1.13 à 1.1.16. Prenez 1,0 μl de solution dans un tube de 0,4 mL et diluer l’amorce avec tampon TE 1 x pour obtenir la radioactivité de 1,0 μL à ~ 100 000 cpm. Stocker les purifiés ³²P-labeled primer à-80 ° C jusqu'à ce que la réaction de modification pour le 2'-OH RNA mais pour pas plus de 4 semaines.
3. Liaison de petites molécules et la modification de 2'-OH de RNA
   1. Pour préparer quatre échantillons, ajoutez 8 pmol RNA dans 32 μL de tampon de TE 0,5 x dans un tube de 1,7 mL, chaleur à 80 ° C pendant 2 min et clin d’oeil-refroidir sur glace pendant au moins 1 minute.
      Remarque : Utilisez l’équation suivante pour calculer le poids moléculaire approximatif de l’ARN : MW = (nombre de bases) x 340 Da.
   2. Ajouter 8 μL de 5 x pliage mélange contenant 500 mM HEPES (pH 8,0), 20 mM MgCl₂et 500 mM NaCl. Aliquote μL 9 du mélange RNA dans chacun de la PCR quatre tubes et étiquetez-les #1 à #4. Ajouter 1 μL de DMSO de 10 % dans le tube 1 #, 1 μL de solution concentrée de petites molécules (10 % DMSO) en #2, 1 μL de solution diluée de petites molécules (10 % DMSO) en #3 et 1 μL d’eau dans #4.
   3. Incuber les tubes PCR à 37 ° C dans un thermocycleur pendant 30 min.
   4. Juste avant la réaction de modification 2'-OH, diluer 1 μL de solution mère de NAI (2 M) avec 3 μL d’eau traitée DEPC pour donner une solution de travail de 0,5 M. Sans tarder, ajouter 1 μL de solution de travail dans des tubes #1, #2 et #3 de NAI et 1 μL de 25 % DMSO dans #4. Incuber à 37 ° C dans un thermocycleur pendant 15 min.
   5. Ajouter 100 μL d’élution des précipitations mélanger (voir l’étape 1.1.13 pour recette), 2 μL de glycogène (15 mg/mL) et transférer tout le liquide dans chaque tube PCR dans un tube de 1,7 mL. Ajouter 0,34 mL de glacée à l’épreuve du 200 EtOH (3 x volume) dans chaque tube. Mix au vortex pour 5 s et place les tubes dans un congélateur à-80 ° C pendant au moins 1 h.
      Remarque : Durant cette période, démarrez la mise en place du gel de séquençage à être utilisé à l’étape 1.5.1.
   6. Centrifuger pendant 15 min à 14 000 x g et 4 ° C. Retirez le surnageant sans déranger le culot de RNA. Laver le culot de RNA en ajoutant 80 % EtOH (0,5 mL par tube), vortexer pendant 15 s et centrifuger pendant 15 min à 20 000 x g et 4 ° C. Retirez le surnageant à nouveau.
      Remarque : Éventuellement, utiliser un compteur Geiger pour s’assurer que le plomb radioactif conservant dans le tube.
   7. Sécher le culot de RNA pour 5 min. ajouter 9 μL d’eau exempte de RNase et mélanger en pipettant également monter et descendre de 10 fois.
      Remarque : Ne pas trop sécher le culot de RNA. Toutes les précipitations devrait être dissoute à la fin de cette étape.
4. Préparation et amorce l’extension de marqueur
   1. Transférer l’ARN modifié dans 4 nouveaux tubes PCR et étiquetez-les #1 à #4 comme précédemment. Ajouter 2 pmol control RNA dans 7 μL d’eau traitée DEPC dans 4 tubes PCR supplémentaires et étiquetez-les #5 à #8. Ajouter 2 μL d’apprêt radiomarqué (étape 1.2.6) dans tous les tubes de huit. Chauffer pour recuire à 65 ° C pendant 5 min, puis les refroidir immédiatement à 4 ° C dans le thermocycleur.
   2. Ajouter 4 μL de 5 x tampon RT (voir Table des matières), 1 μL de dithiothréitol (DTT, 0,1 M) et 1 μL de mélange dNTP (10 mM) à chacun des huit tubes PCR.
   3. Ajouter 2 μL de traitée DEPC H₂O à tubes #1 à #4. Ajouter 4 μL de ddATP (5 mM), 4 μL de ddTTP (5 mM) et 4 μL de ddCTP (5 mM) dans des tubes #5 à #7, respectivement. Ajouter 1 μL de ddGTP (5 mM) et 3 μL d’eau traitée DEPC tube #8. Pipetter quatre fois pour mélanger.
   4. Chauffer à 52 ° C pendant 1 min dans le thermocycleur. Ajouter 1 μL de la transcriptase inverse (voir Table des matières), puis mélanger en pipettant également, haut et bas quatre fois. Incubez la réaction à 52 ° C pendant 20 min.
   5. Ajouter 1 μL de 5 M NaOH dans chacun des tubes d’hydrolyser l’ARN. Chauffer les tubes à 95 ° C pendant 5 min.
   6. Ajouter 5 μl de 1 M HCl et répéter la précipitation d’éthanol (étapes 1.3.5 et 1.3.6), sauf omettre le glycogène et le transfert de liquide.
      Remarque : Omettant étape 1.4.6 résultats dans une région zone grise au milieu du gel, connu comme le « front de sel ».
   7. Sécher le culot d’ADN pour 5 min. ajouter 10 μL de H₂O et 10 μL de 2 x TBE-urée échantillon tampon de charge et pipette de haut en bas 10 fois pour le dissoudre. Chauffer à 70 ° C pendant 5 min. placer les tubes sur la glace avant du charger sur le gel.
5. Analyse de la PAGE
   1. Pour préparer un gel de polyacrylamide 8 % séquençage, suivez les étapes 1.1.6 à 1.1.10 avec les modifications suivantes : 100 mL de solution à 40 % d’acrylamide/bisacrylamide (29 : 1) permet de préparer une solution d’acrylamide de 8 % et utiliser le séquençage verre plaques de gel (par exemple, 46 x 57 cm) avec un espacement de 0,4 mm.
   2. Charger 10 μl de l’échantillon de l’étape 1.4.7. Exécutez le gel à 65 W pendant 2 heures ou jusqu'à ce que la teinture de fond arrive au 3/4 du gel.
      Remarque : Stocker le reste des échantillons à-80 ° C pour répéter si nécessaire.
   3. Retirez la plaque de verre siliconé supérieure en enlevant l’entretoise et insérant doucement une spatule. Placez un morceau de papier filtre grande pour couvrir le gel et appuyez doucement pour permettre le gel respecte le papier filtre. À partir de l’extrémité inférieure, soulevez le filtre en papier et retirer le gel de la plaque de verre ensemble.
   4. Placer le gel avec le papier filtre sur un morceau de pellicule de plastique qui est assez grand pour couvrir le gel entier (papier filtre vers le haut). Transférer le papier-filtre/gel/plastic wrap "sandwich" à un gel plus sec le papier-filtre face vers le bas.
      Mise en garde : Pour éviter la contamination de matière radioactive, utiliser 3 à 4 morceaux plus grand papier filtre entre le sandwich de gel et gel plus sec.
   5. Sécher le gel à 70 ° C pendant 1 h avec un aspirateur. Transférer le sandwich de gel sur une cassette d’écran stockage phosphore photo-blanchis. Exposer la radioactivité du gel à l’écran pendant 4 – 16 h.
   6. Placer l’écran de stockage de phosphore sur un dispositif d’imagerie et scan avec une résolution moyenne (~ 30 min).
      Remarque : Si un artefact comme sourire est présent sur l’image de gel, utiliser logiciel correcteur (p. ex., SAFA) pour traiter l’image d’une qualité publiable. N’oubliez pas que la voie de marqueur standard est plus longue que les voies de modification 2'-OH 1 nucléotides.

2. dans la cellule forme

1. Conception d’amorce
   Remarque : Contrairement à la forme in vitro, forme dans les cellules n’a pas besoin de concevoir une cassette d’expression. Cependant, un ensemble optimal de l’apprêt doit être utilisé et doit être évalué avant forme expérimenter.
   1. Générer au moins trois paires d’amorces unique en un outil de conception de BLAST primaire (p. ex., Primer-BLAST). Afin d’étudier le pré-ARNm dans les cellules humaines, sélectionnez le génome humain (pas transcriptome) comme une base de données de référence dans les paramètres de contrôle de spécificité Primer paire. Choisir la taille de l’amplicon de l’ordre de 200 à 1 000 paires de bases (bp).
   2. Extraire l’ADN génomique de ~ 10⁶ cellules d’intérêt avec une méthode basée sur les colonnes de spin avec le traitement de la RNase A et protéase K (voir Tableau des matériaux et utilisation protocole du fabricant). Normaliser l’ADN génomique purifié dans un tampon de TE 0,1 μg/μL.
   3. Test PCR avec le protocole réalisé en étapes 1.1.1 et 1.1.2.
      Remarque : Les amorces souhaitée devrait produire une seule bande sur un gel d’agarose de 1,8 %.
2. Préparation et modification de la 2'-OH des cellules
   Remarque : Pour augmenter l’abondance de la pré-ARNm d’intérêt, un minigène avec la séquence correcte par un promoteur de cytomégalovirus (CMV) pour l’expression constitutive est transfecté dans des cellules de l’hôte.
   1. Préchauffer le milieu de culture contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 x en mélange antibiotique dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) à 37 ° C. Cellules 293 t de semences à confluence 50 % 24 h avant la transfection dans le milieu de culture. Transformer le milieu 2 % BF en DMEM sans antibiotiques ~ 1 h avant la transfection.
   2. Ajouter 10 μg de plasmide minigène dans 100 μL de médias de sérum réduit (voir Table des matières) dans 1 bien sur une plaque à 96 puits. Déposer de la solution et descendre quatre fois pour mélanger.
   3. Ajouter 40 μl de réactif de transfection (voir Table des matières) dans 100 μL de médias de sérum réduit dans un autre puits de la plaque. Pipetter vers le haut et vers le bas quatre fois pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
   4. Ajoutez la solution de plasmide entier à la suspension de réactif de transfection. Pipetter vers le haut et vers le bas quatre fois pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
   5. Ajouter l’ADN complet / mélange réactif de transfection goutte à goutte sur la surface du milieu tout au long de la capsule. Incuber à 37 ° C pendant 6 à 12 h.
   6. Aspirer le milieu et laver délicatement une fois avec 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, sans CaCl₂ et MgCl₂, voir la Table des matières). Trypsinize les cellules avec 3 mL de solution de trypsine. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
   7. Frapper le plat doucement pour dissocier les cellules du fond du plat. Neutraliser la trypsine avec 6 mL de milieu de culture. Centrifuger à 300 x g pendant 4 min et retirer le support.
   8. Remettre en suspension les ~ 10⁶ cellules pour chaque échantillon dans 199 μL de milieu réactionnel (1 % FBS dans DMEM) et transférer la suspension cellulaire dans une plaque à 96 puits. Incuber les cellules avec 1 μL de solution de travail composé ou 1 μL de DMSO dans trois contrôles pendant 30 min à 37 ° C.
      Remarque : Trois échantillons de contrôle doivent être inclus : contrôle de DMSO avec NAI, RNA dénaturé et NAI, NAI contrôle négatif.
   9. Ajouter 10 μL de NAI de 2 m à chaque échantillon, sauf pour le contrôle de la dénaturation (DC) RNA et témoins négatifs NAI. Pipetter vers le haut et vers le bas quatre fois pour mélanger. Incuber à 37 ° C pendant 15 min. secouer doucement les plaques pour remettre en suspension les cellules toutes les 5 min.
   10. Les cellules de transfert dans des tubes de 1,7 mL et centrifuger à 400 x g pendant 2 min sans délai. Retirez le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
   11. Ajouter 0,4 mL de guanidinium thiocyanate (voir Table des matières). Vortexer pendant 15 s pour homogénéiser. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 5 min.
       Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à passer à l’étape suivante.
3. Extraction de l’ARN
   1. Ajouter 0,2 mL de chloroforme à chacun des échantillons guanidinium thiocyanate homogénéisé. Vortexer pendant 15 s. incuber à température ambiante pendant 2 min.
   2. Centrifuger pendant 5 min à 12 000 x g et 4 ° C. La couche aqueuse incolore contient RNA. Transférer ~ 380 μL de la solution aqueuse dans un nouveau tube de 1,7 mL.
      Mise en garde : Ne pas déranger l’interphase pour éviter toute contamination.
   3. Ajouter 1,5 x volume d’EtOH (~ 570 μL). Vortexer pendant 15 s pour mélanger.
   4. Transférer 600 μL de mélange de RNA dans une RNA isolation-colonne (voir Table des matières). Centrifuger à 12 000 x g pendant 15 s. jeter l’éluant. Répétez cette étape pour passer à travers tout le liquide dans la même colonne.
   5. Laver la colonne avec 0,35 mL de tampon RW1 (voir Table des matières) en faisant tourner pour 15 s. ajouter 80 μL de DNase RNase-libre j’ai dans un tampon RDD (voir Table des matières). Incuber à température ambiante pendant 20 min.
      Remarque : Il est essentiel d’éliminer toute contamination de l’ADN.
   6. Par la suite laver la colonne avec 0,35 mL de tampon RW1 et 0,6 mL de tampon de x RPE 2 (voir la Table des matières) par rotation pendant 15 s à chaque étape. Sécher la colonne en CENTRIFUGEANT la colonne avec un tube de collection vide à 12 000 x g pendant 1 min.
   7. Ajouter 32 μL d’eau exempte de RNase au centre de la colonne. Incuber pendant 1 min. centrifuger à 12 000 x g pendant 30 s d’obtenir environ 30 μL de la solution purifiée de RNA. Placer les échantillons à-20 ° C lors du traitement de l’échantillon dénaturé.
4. Préparation de commande ARN dénaturée
   1. Place 30 µL d’échantillon RNA pour contrôleur de domaine dans un tube en plastique de 1,7 mL sur la glace. Ajouter 50 μL de formamide et 15 μL de tampon de DC contenant 300 mM HEPES (pH 8,0) et 25 mM EDTA dans le tube.
   2. Chaleur de dénaturer l’ARN à 95 ° C pendant 1 min. rapidement ajouter 5 μl de la solution mère de NAI (2 M), puis coup deux fois pour mélanger et mettre le tuyau de retour vers le bloc de chauffage. Incuber à 95 ° C pour un supplémentaire 1 min puis mettre immédiatement le tube sur la glace.
   3. Ajouter 0,4 mL de guanidinium thiocyanate. Répétez les étapes 2.3.1–2.3.4.
   4. Laver la colonne avec 0,6 mL de tampon de x RPE 2 (voir la Table des matières) par rotation pendant 15 s à chaque étape. Sécher la colonne en CENTRIFUGEANT la colonne avec un tube de collection vide à 12 000 x g pendant 1 min.
   5. Ajouter 32 μL d’eau exempte de RNase au centre de la colonne. Incuber pendant 1 min. centrifuger à 12 000 x g pendant 30 s pour obtenir ~ 30 μL de solution d’ARN DC récupérée.
5. Extension d’amorce
   1. Normaliser la solution RNA 2.3.7 et 2.4.5 dans 0,5 μg/μL d’eau exempte de RNase. Fraîchement préparer 30 mM MnCl₂ solution de MnCl₂∙4H₂O en poudre.
   2. Transférer 9 μL de solution RNA pour chaque échantillon dans une bande PCR. Ajouter 1 μL de dNTP 10 mM et 1 μL d’amorce de gène-spécifique 2 μM (SPG) dans chaque tube. Pipetter vers le haut et vers le bas quatre fois pour mélanger. Incuber à 65 ° C pendant 5 min dans un thermocycleur et mettre sur la glace pour > 1 min.
      Remarque : Par ailleurs, 1 μL d’un nonamer aléatoire peut être utilisé en remplacement du SGP.
   3. Dans chaque tube PCR, ajouter un mélange de 2 μL de mémoire tampon RT 10 x (voir Table des matières), 4 μL de 30 mM MnCl₂et 2 μL de 100 mM TNT. Pipetter, monter et descendre de 4 x à mélanger. Incuber à 42 ° C pendant 2 min.
   4. Ajouter 1 μL de la transcriptase inverse (voir Table des matières). Pipetter, monter et descendre de 4 x à mélanger. Incuber à 42 ° C dans un thermocycleur pendant 3 h.
6. Préparation de la bibliothèque et le séquençage de prochaine génération
   1. Mettre en place une réaction de PCR en ajoutant 1 μL de l’ADN polymérase, 5 μL de 10 x tampon ADN polymérase (voir Table des matières), 2 μL de DMSO, 1,5 μL pour chacune des amorces (10 μM), 34 μL de H₂O et 5 μL du cDNA de l’étape 2.5.4.
   2. Mettre en place le thermocycleur comme suit : étape 1) 95 ° C pendant 2 min ; stade 2) 95 ° C pendant 30 s ; Etape 3) 60 ° C pendant 30 s ; Etape 4) 68 ° C pendant 30 s ; boucle de l’étape 5) retour à l’étape 2 pour 30 cycles ; étape 6) 68 ° C pendant 3 min ; et l’étape 7) infinie tenue à 4 ° C jusqu'à l’étape suivante.
   3. Purifier l’amplicon à l’aide de gel d’agarose à 1,8 %.
      Remarque : Le groupe ACP doit apparaître sur une seule bande sur le gel.
   4. Construire la bibliothèque à l’aide de fragmentation standard et des méthodes de ligature établis dans la littérature^6,26.
   5. Séquence sur un équipement de séquençage de prochaine génération à l’aide de lectures de single-end 1 x 75 pour générer environ 10 millions lit par exemple.
   6. Analyser les résultats à l’aide de ShapeMapper et SuperFold de logiciels développés par les semaines groupe²⁶.

Nous avons démontré précédemment qu’un ARN épissage modulateur, SMN-C2, interagit avec motif AGGAAG sur 7 d’exon du pré-ARNm du gène SMN2 et forme permettant d’évaluer les changements structurels de RNA en présence de SMN-C26. Le site de liaison du SMN-C2 se distingue par l’oligonucléotide antisens approuvé par la FDA (ASO) pour SMA, nusinersen, qui se lie et bloque le silencieux intronic épissage (ISS) sur intron 727,28 (Figure 1 a). Plus connus régulateurs épissage de SMN2 exon 7 sont dans la plage de ~ 100 nucléotides de l’exon 7 dans le pré-ARNm29; par conséquent, un ARN de nucléotides de long 140 et 276 séquences ont été utilisées pour la forme in vitro et dans les cellules, représentative, qui couvre exon 7 et dans la région de l’intron adjacente (Figure 1 a).

Dans cette analyse représentative de la forme in vitro, la séquence d’ARN d’intérêt est intégrée dans une cassette optimisée mis au point par le laboratoire de semaines, ce qui est compatible pour la plupart ARN séquences1. Parfois, la séquence d’intérêt interagit ou interfère avec cette cassette. Dans ces cas, une cassette modifiée peut être utilisée avec les trois caractéristiques suivantes : i) un site de liaison des amorces spécifiques extrémité 3' avec une affinité de hybridation plus efficace pour l’apprêt que n’importe quelle partie de la séquence d’ARN, ii) une boucle en épingle à cheveux très structuré situé directement en amont de l’accepteur primaire qui montrera précis et reproductibles signal de forme (Ceci agira comme les deux contrôle interne pour l’expérience et la méthode pour aligner le signal de l’expérience pour l’expérience) et iii) une structure en épingle à cheveux de 5'-fin élément, qui indique la fin du signal forme. La cassette de forme est encore flanquée de self fendage ribozyme séquences à deux 5'-3'-extrémités afin de générer un homogène de RNA30et. Nous avons constaté que marteau et l’hépatite delta virus ribozymes sont compatibles à la cassette de forme donnent habituellement un rendement élevé de l’ARN désirée. Le modèle de RNA a une extrémité 3' de 2', 3' cyclique de phosphate et une extrémité 5' du groupe hydroxyle, qui n’interfèrent pas avec l’extension d’amorce. Une longue séquence de 140-nucléoside couvrant l’exon 7 de SMN2 et région adjacente dans le pré-ARNm est synthétisée dans la forme et ribozyme cassette tel qu’illustré dans le schéma 1.

En règle générale, la séquence d’intérêt ligaturé dans la cassette d’expression doit être assez long pour couvrir l’ordre secondaire ou supérieur potentiel de structure. Dans le cas de SMN2 exon 7, une région de 140-nucléotide contient deux tige-boucle structures6,31. La structure de la région d’intérêt varie selon les cas par cas et doit être évaluée par essais et erreurs.

Séquençage sur gel de polyacrylamide avec produits d’extension 32P-labeled primer a été choisi pour visualiser le profil in vitro forme dans cette expérience de représentant. Une méthode de visualisation alternative consiste à utiliser l’électrophorèse capillaire avec une amorce d’ADN fluorescent étiquetés32. Gels de polyacrylamide de séquençage, nucléosides ~ 20 près de l’extrémité 5' et environ 10 nucléotides près de l’extrémité 3' de la séquence d’ARN d’intérêt ne va pas être visualisé quantitativement, cause de parfois s’arrête sur les étapes de l’initiation de la transcription inverse et intense bandes sur les gels de PAGE pour des transcriptions pleine longueur1.

Une autre façon pour préparative en gel de récupération d’un descripteur d’ARN (étapes 1.1.6 à 1.1.12) est de surcharger un mini gel si le rendement du modèle désiré de RNA est > 90 %. Il est conseillé de retirer l’excès NTP du produit RNA par dessalage de la colonne et l’ARN dans 50 µL de tampon TE d’élution. Mesurer la concentration de l’ARN et charger 5,0 µg dans chaque puits. Au cours de la purification, étape de la T7 transcrit descripteur d’ARN, arrêter la PAGE lorsqu’il est passé de colorant xylène cyanol FF (bleu clair) deux-tiers des 6 % dénaturé gel TBE-urée. Le fragment de RNA self-clivage (< 80 nucléosides) passé par le gel, qui a laissé l’ARN désiré est le seul grand groupe le gel après coloration (Figure 1 b).

SMN-C2 (Figure 1) a été synthétisé selon la procédure publiée33 et dissous dans la solution mère de DMSO 10 mM. La solution est plus diluée dans 500 et 50 µM en solution à 10 % DMSO pour atteindre la concentration finale de 50 et 5 µM, respectivement. Clin d’oeil-refroidi RNA replié à son stade d’équilibre en présence de DMSO ou SMN-C2 moins de 30 min à 37 ° C. Un temps d’incubation plus longs n’a pas changé le résultat de l’expérience. Deux échantillons expérimentaux (50 et 5 µM SMN-C2), deux contrôles (NAI-contrôles et DMSO) et quatre marqueurs (A, T, G, C) ont été traités pour extension d’amorce. Après avoir exposé le gel d’écran stockage phosphorescent, montrera une expérience réussie de la forme : i) une bande unique et plus intense dans la partie supérieure du gel et groupes ii) dans le gel à mononucléotidiques résolution sans frottis (Figure 1). Un problème courant dans l’analyse de PAGE, c’est qu’une région de frottis connue comme le « front de sel » peut apparaître au milieu du gel (Figure 1E). C’est probablement en raison de la forte concentration de sel, DMSO, ou autres indésirables substance dans l’échantillon de chargement qui peut être enlevé par précipitation à l’éthanol.

Dans in vitro à forme un descripteur d’ARN pur est la clé pour une expérience réussie. Un descripteur d’ARN impur est généralement la cause des résultats indésirables. Si la PAGE analyse montre clairement une tendance de 2 séries de marqueurs, il indique que le descripteur d’ARN n’est pas homogène et a besoin d’être repurifié par préparative TBE-urée gel.

Pour la forme dans les cellules, une clé pour une expérience réussie est de concevoir une optimisée d’amorces pour l’amplification. Pour 0,10 µg de matrice d’ADNc sans ADN génomique, une seule bande doit etre prise au sein de 25 cycles PCR dans l’analyse sur gel d’agarose. Les séquences répétitives intron doivent donc être évitées. Pour étudier la structure impact du SMN-C2 sur SMN2 pré-ARNm, trois paires d’amorces (tableau 2) a été testé, et tous étaient satisfaisantes (Figure 2 a).

Un certain nombre de faibles copies d’une séquence d’ARN cible est généralement un problème de forme dans les cellules. Pour enrichir l’ARN d’intérêt, un minigène qui contient la séquence d’ARN d’intérêt sous un ardent promoteur du CMV a été transfecté dans des cellules 293 t. Parce que le modèle d’épissage de la minigène SMN2 reprend celui de SMN2 endogène avec ou sans SMN-C219,34, nous prévoyons que la structure de l’ARN qui interagissent dans la probable surexprimée pré-ARNm SMN2 a été identique de SMN-C2 le produit du gène endogène. Alors que l’EC50 de SMN-C3 dans le test d’épissage était ~0.1 µM6,19, une concentration à l’extrémité supérieure (20 µM) a été utilisée pour assurer l’état de la liaison des petites molécules et séquence de l’ARN cible.

Sur l’isolement du RNA, amorces gène-spécifique et aléatoires peuvent être utilisés pour l’extension. Dans le cas de l’exon 7 de SMN2, nous avons constaté que les SMN2E7-338-RV (tableau 2) donne une copie plus élevée de l’ADNc désiré qu’un nonamer aléatoire, attestée par une bande plus intense dans l’amplification par PCR avec des amorces SMN2E7-276 (tableau 2) après 25 cycles. Dans l’étape de modification 2'-OH, une concentration finale de NAI µM 91 a été utilisé pour une période d’incubation de 15 min. Si un type de cellule différente ou un support est utilisé, le temps d’incubation doivent être ré-optimisé. Si le temps d’incubation est trop long, analyse sur gel d’agarose de l’amplicon échoue parfois montrer une bande.

Un python programme, ShapeMapper, mis au point par les semaines laboratoire35 a été utilisé pour analyser les données produites par le séquençage de prochaine génération [pour les données brutes de SMN-C2 traités dans la cellule forme de SMN2 exon 7 pré-ARNm, se référer à l’Archive séquence de lecture (SRA) base de données]. Tout au long de l’amplicon, la réactivité de la forme n’a pas significativement changé (> 1), qui a indiqué que la structure secondaire reste en présence de SMN-C2 (Figure 2 b). Ceci est également confirmé par les parcelles d’arc générés par SuperFold35. Les lignes de connexion indiquent la base possible appariement basés sur l’activité de la forme de chaque nucléotide. Modélisation de RNA traités SMN-C2 et DMSO est essentiellement le même (Figure 2). Différentiel de cellules forme réactivité a été calculée pour chaque nucléotide (Figure 2 b), et la plupart changement de réactivité a eu lieu à TSL-1 (5'-fin de l’exon 7) mais pas TSL-2 (extrémité 3' de l’exon 7). Ce résultat est d’accord avec le forme in vitro ; bien que, l’appariement base décalée d’in vitro modélisation de forme ARN dans la forme dans la cellule analyse (Figure 2D).

Un problème commun de forme dans les cellules est le taux de mutation faible tout au long de l’amplicon. C’est généralement due à la contamination de l’ADN génomique. L’ADN ne contient-elle pas de groupe de la 2'-OH ; par conséquent, aucun produit d’acylation n’est formé avec NAI. Ainsi, l’amplification par PCR reflète simplement le taux faible de mutation de l’ADN polymérase. Isolement de l’ARN par le thiocyanate de guanidinium, suivie de la digestion de DNase sur colonne suffit enlever tous les ADN dans la plupart des cas. Si l’ADN contaminant persiste, répétez l’étape 2.3 pour l’ARN.

Schéma 1 : séquence d’ADN pour le modèle de la transcription de l’ARN. La séquence de 12 bp au sein de la séquence de ribozyme Hammerhead virus en rouge est le complément inverse de la première 12 bp de la 5'-cassette. La séquence d’ARN d’intérêt présenté ci-après est un 140 bp pré-ARNm séquence contient exon 7 du gène SMN2 humain. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 1 : Expérimental et le résultat de la forme in vitro de SMN2 exon 7 pré-ARNm en présence de SMN-C2. (A) vue d’ensemble de la séquence d’intérêt pour les études in vitro et dans les cellules de forme du gène SMN2. SMN-C2 crée une liaison avec le motif AGGAAG sur l’exon 7, un emplacement distinct du site de liaison nusinersen. (B) la Purification du produit transcription T7. Chacune des trois voies contient 5,0 µg d’ARN brut. Le gel TBE-urée était taché avec SYBR-Safe (01:10, 000) pendant 5 min dans 1 x TBE tampon. Cadre en pointillés rouge indique le bord de l’excision pour récupération de RNA. (C) la structure du SMN-C2. Descripteur d’ARN (D), à la forme In vitro experience avec NAI et un 140 nucléotides de long contenant exon 7. 1 = DMSO ; 2 = SMN-C2 (50 ΜM) ; 3 = SMN-C2 (5 ΜM) ; 4 = manque de NAI ; 5-8 = échelles générées par l’addition du ddATP, ddTTP, ddCTP et ddGTP au cours de l’extension d’amorce. PAGE a eu lieu dehors sur un gel de séquençage TBE-urée à 60 W pendant 3 h rouge astérisques indiquent intensité de bande accrue avec 50 µM SMN-C26. (E), un exemple d’une région « sel avant » dans la zone rouge en pointillés depuis un autre expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dans la cellule forme dérivée modélisation RNA de SMN2 exon 7 pré-ARNm. (A), PCR amplification avec tous les trois amorces (tableau 2) ont donné une seule bande dans l’analyse sur gel d’agarose. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = échelle d’ADN. Réactivité de forme dans la cellule différentielle de (B) dans les cellules 293 t transfectées minigène SMN2 pour 10 µM SMN-C2 et DMSO dans TSL1. FORME de réactivité à mononucléotidiques résolution. Son écart-type a été calculée par ShapeMapper logiciel35. Verts astérisques indiquent les changements de réactivité forme significative induite par 10 µM SMN-C2. La numérotation des nucléotides dans l’amplicon bp 276 montré sur x-axe. Barres d’erreur ont été estimées en forme-Mapper logiciel26. (C) terrain Arc généré par SuperFold35 pour la plus plausible structure secondaire d’ARN de modélisation de données de forme dans les cellules. (D) In vitro et dans les cellules modélisation axée sur la forme de l’exon 7 et les régions adjacentes. Pour modèle in vitro de RNA, forme stabilisant cassette (orange) et nucléotides 1-19 (bleu) est indiquée dans sketch. Pour modèle de RNA dans les cellules, numérotation de nucléotides est aligné sur modèle in vitro de forme. Nucléotides 1-18 et 120-140 ont été omises. Changements de réactivité importante sont indiqués en astérisques rouges et vertes pour SHAPE in vitro et dans les cellules, respectivement. Les structures secondaires qui ont été précédemment nommés TSL1 et TSL231 sont enfermés dans des boîtes bleues. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Les séquences d’amorces utilisées pour l’expérience représentant.

Tableau 2 : l’apprêt définit pour l’amplification de la séquence de l’ARN pré-messager intérêt. Tous les trois amorces donnent un amplicon unique dans une réaction de PCR avec matrice d’ADNc sans ADN génomique.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.