Fractionnement de cellules des cellules U937 en l’Absence de Centrifugation à haute vitesse

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les membrane plasmique, cytoplasme et les mitochondries des cellules U937 sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse. Cette technique peut servir à purifier les fractions subcellulaires pour un examen subséquent de la localisation de la protéine par immunoblotting.

Résumé

Dans ce protocole, nous détaillons une méthode pour obtenir des fractions subcellulaires des cellules U937 sans l’utilisation d’ultracentrifugation ou détergents sans discernement. Cette méthode utilise des tampons hypotoniques, digitonine, lyse mécanique et centrifugation différentielle pour isoler le cytoplasme, la mitochondrie et la membrane plasmique. Le processus peut être adapté pour répondre aux besoins des chercheurs, est peu coûteux et simple. Cette méthode permettra aux chercheurs de déterminer la localisation des protéines dans les cellules sans centrifugeuses spécialisés et sans l’utilisation de kits commerciaux, qui peuvent être prohibitifs. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour séparer cytosolique, la membrane plasmique et la protéines mitochondriales chez la lignée monocytaire humaine U937.

Introduction

Une identification fiable de la localisation de la protéine est souvent nécessaire lors de l’examen des voies moléculaires dans les cellules eucaryotes. Méthodes pour obtenir des fractions subcellulaires sont utilisés par les chercheurs à examiner de plus près les composants cellulaires d’intérêt.

La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire existant tombe généralement dans deux grandes catégories, à base de détergent^1,2 et axée sur l’ultracentrifugation^3,4,5, qui peut être différen....

Protocole

1. Préparez les tampons et les réactifs

Remarque : Voir le tableau 1.

1. Préparer des solutions de tampons A, tampon de lyse B, tampon et digitonine.
   1. Préparer, tampon A en ajoutant 8,77 g de NaCl et 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) à 900 mL d’eau désionisée, ajuster le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée.
      Remarque : Les concentrations finales sont NaCl 150 mM et 50 mM HEPES.
   2. Préparer le tampon de lyse B en ajoutant 20 mL d’HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl₂, 2 mL d’acide Tétraacétique (EDTA 0,5 M), 2 mL d’éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tétraa....

Résultats

Succès le fractionnement des indifférenciées U937⁸ cellules cultivées en suspension a été accompli en utilisant le protocole indiqué ci-dessus et illustré à la Figure 1. Les échantillons obtenus avec cette méthode ont été soumis à western blotting⁹ utilisant une méthode de transfert humide sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La membrane a été sondée par la suite avec des anticorps contre cytop.......

Discussion

L’élaboration du présent protocole est née de l’incapacité de séparer les mitochondries et les échantillons de membrane, utilisant des kits disponibles dans le commerce, pour l’analyse de la localisation des protéines au cours de la necroptosis¹⁴. Les limitations primaires de kits préfabriqués sont leur incapacité à être adapté aux besoins des chercheurs individuels, leur coût par échantillon et le nombre limité d’échantillons peuvent être traitées. La méthode présentée ici peut être effectuée san.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	Pour l’extraction du cytoplasme
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	Pour le tampon de lyse B
Dounce homogénéisateur	VWR	22877-282	Pour l’homogénéisation
Rotateur de bout en bout	Barnstead	N/A	Pour l’extraction du cytoplasme
Ethylene glycol-bis(&beta ;-aminoethyl ether)-N,N,N' ,Acide N'-tétraacétique (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	Pour tampon de lyse B
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	lyse
B GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	Pour la détection de fractions cytoplasmiques sur transfert Western,  : 1:10000
HEPES	VWR	J848	Pour tampons de lyse A et B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	lyse B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	Pour tampon de lyse B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	Pour la détection des fractions de membrane plasmique sur transfert Western, u : 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Pour tampon de lyse A
fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)	VWR	M145	Pour l’extraction et l’homogénéisation du cytoplasme Sonde tampon
Sonicator	Qsonica	Q125-110	Pour les échantillons finaux
Cocktail d’inhibiteurs de protéase, Utilisation générale	VWR	M221-1ML	Pour l’extraction du cytoplasme
Centrifugeuse réfrigérée	Beckman-Coulter	N/A
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	VWR	227	Pour tampon d’échantillon
Orthovanadate de sodium (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	Pour tampons de lyse A et B
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389	Pour tampon de lyse Solution
saline à tampon tris B (TBS)	VWR	788	Pour tampon d’échantillon
VDAC (D73D12)	Technologies de	signalisation cellulaire4661	Pour la détection des fractions mitochondriales sur le transfert Western,  : 1:1000

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